Нарушения функции щитовидной железы могут стать причиной преждевременного или позднего полового созревания, расстройств менструального цикла, ановуляции, бесплодия, невынашивания беременности, патологии плода [1, 2].

Антитела к щитовидной железе обнаруживают у женщин с эндометриозом и бесплодием [2]. Бесплодие - одна из важных проблем у пациенток с аутоиммунным тиреоидитом [2-5]. Сегодня актуальны исследования, направленные на выяснение возможных механизмов развития бесплодия на экспериментальных моделях с использованием животных.

Новейшие стратегии оценки профилей ооцитов, гранулярных и кумулюсных клеток, эмбрионов и культуральной среды, включающие геномику, транскриптомику, протеомику и метаболомику (ОМИКС-технологии), предлагают исключительные преимущества и обнаруживают скрытые на сегодня ограничения вспомогательных репродуктивных технологий при лечении определенных видов женского бесплодия. В условиях гипофункции щитовидной железы таким может быть повреждение интегральной целостности ДНК клеток кумулюсного окружения и, как следствие, - низкое качество ооцитов.

Цель настоящего исследования - оценить уровень повреждения ДНК и экспрессию генов hyaluronan synthase 2 (HAS2), cyclooxygenase 2 (COX2), gremlin 1 (GREM1) в клетках кумулюсного окружения ооцитов в условиях экспериментального тиреоидита у мышей.

Исследования проведены на самках мышей линии СВА (8 нед, 16-18 г) с соблюдением всех требований по работе с лабораторными животными (Международная Европейская конвенция по защите позвоночных животных, Страсбург, 1986). После завершения экспериментов животным вводили нембутал и умерщвляли методом дислокации шейных позвонков. Экспериментальный тиреоидит как гипофункцию щитовидной железы у мышей вызывали ежедневным введением мерказолила («Здоровье», Украина) на протяжении 7 дней в дозе 50 мг/кг [6]. Ежедневно регистрировали общее состояние, поведение и динамику массы тела подопытных животных. Через 6 сут от момента последнего введения мерказолила у животных забирали яичники для дальнейших исследований. Контрольным животным вводили физиологический раствор по этой же схеме.

Объект исследования - клетки кумулюсного окружения ооцитов мышей линии СВА.

Метод ДНК-комет для выявления повреждений ДНК на клеточном уровне заключается в микро­электрофорезе лизированных клеток, когда фрагментированное ядро образует на электрофореграмме своеобразный ореол, похожий на хвост кометы. Считается, что размеры хвоста ДНК-кометы положительно коррелируют со степенью фрагментации ДНК [7]. В качестве фактора, взаимодействующего с ДНК и вызывающего ее повреждение, использовали антибиотик рубомицин (Московский завод медпрепаратов, Россия). Суспензию клеток в среде (300-400 тыс. в 1 мл) инкубировали в присутствии различных концентраций вышеуказанных веществ в течение 4 ч при 37 °С. Процент мертвых клеток определяли в аликвоте с помощью теста с трипановым синим (конечная концентрация 0,1%). Электрофорез проводили при напряжении 0,6 В/см в течение 25 мин [8]. Раствор для окраски (5% пропидиум йодид) готовили непосредственно перед использованием. Подсчет количества комет проводили при увеличении 200-400. В образце подсчитывали не менее 500 клеток. Кометы разделяли на 5 классов в зависимости от соотношения ДНК в «голове» и «хвосте» кометы [7].

Определение экспрессии генов HAS2, COX2 и GREM1 на уровне мРНК в кумулюсных клетках методом полимеразной цепной реакции. Тотальную РНК выделяли из клеток кумулюсного окружения ооцитов с помощью набора Trizol RNA-prep («Isogen», Россия). Обратную транскрипцию проводили, используя First Strand cDNA Synthesis Kit («Fermentas», Литва). Реакцию останавливали прогреванием при 70 °С в течение 10 мин, после чего пробирки переносили на лед.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Методом ПЦР увеличивали количество фрагмента исследуемого гена. Для оценки экспрессии генов использовали по паре специфических праймеров («Fermentas», Литва) для генов HAS2, COX2 и GREM1 и гена GAPDH (внутренний контроль). ПЦР проводили в термоциклере GeneAmp System 2700 («Applied Biosystems», США).

Полученные амплификаты разделяли горизонтальным электрофорезом в 1,5% агарозном геле в трис-боратном буфере. Визуализацию и оценку яркости амплификата после электрофореза при 160 В в течение 25 мин проводили с помощью трансиллюминатора и программного обеспечения Vitran («Биоком», Россия).

Статистическая обработка данных. Для статистической обработки результатов использовали пакет программ Origin 8Pro («OriginLab Corp.», North, MA, США) и электронные таблицы Microsoft Excel 2003. Достоверность различий средних значений определяли по t-критерию Стьюдента, достоверными считали значения р<0,05.

Результаты количественного кометного анализа ДНК клеток кумулюсного окружения ооцитов мыши приведены в таблице.

Рубомицин в концентрации 4 мкг/мл вызывает гибель ~25% клеток, причем количество клеток с поврежденной ДНК составляет 53,5%. Большинство комет отнесены к 3-му классу.

Установлено, что экспериментальный тиреоидит вызывает гибель ~17% кумулюсных клеток, количество клеток с поврежденной ДНК составляет 46,2%, большинство комет кумулюсных клеток с двунитевыми разрывами ДНК отнесены к 3-му классу.

Таким образом, оценка интегральной целостности генома, соотношение материала ДНК в «голове» и «хвосте» кометы как показателя функционирования генома клеток кумулюсного окружения ооцитов дают основания утверждать, что экспериментальное повреждение щитовидной железы может изменять процессы повреждения и репарации, что отображается как двунитевой разрыв ДНК.

Установлено, что в условиях экспериментального тиреоидита происходит снижение экспрессии GREM1 в 1,65 раза, экспрессия HAS2 и COX2 не изменялась (см. рисунок).

Распространенность гипотиреоза в популяции составляет 0,2-2%. Для женщин репродуктивного возраста этот показатель достигает 2-5%. Гипотиреоз является одним из наиболее частых нарушений функционального состояния щитовидной железы, в том числе у женщин, страдающих бесплодием. Частота его в этой группе женщин колеблется от 2 до 25% [5, 9]. Субклеточный гипотиреоз (повышенный уровень тиреотропного гормона при нормальном уровне свободного тироксина) может стать причиной нарушений менструального цикла и бесплодия [2]. Кроме дефицита йода, развитию заболеваний щитовидной железы способствуют экологическая и радиологическая ситуация, хронические стрессовые состояния, инфекционные заболевания, изменения иммунного статуса.

Гипофункция щитовидной железы у мышей сопровождалась снижением уровня гормонов трийодтиронина и тироксина, увеличением уровня тиреотропного гормона и биохимическими сдвигами в сыворотке крови, а также морфологическими изменениями самой щитовидной железы и внутренних органов, что моделирует развитие тяжелого гипотиреоза, который характеризуется снижением двигательной активности и увеличением массы тела животных [6].

Именно жизненно необходимая роль кумулюсных клеток при in vivo и in vitro созревании ооцита определила их выбор для исследования. Изолированные кумулюсные клетки относительно однородные, практически без загрязнения другими клетками, в то время как изолированные клетки гранулезы, как правило, содержат текальные клетки и клетки крови. Ожидания таковы, что кумулюсные клетки могут стать надежной моделью для понимания составляющих качества ооцитов и оценки эффективности протокола гиперстимуляции яичников, а также диагностики анеуплоидии ооцитов, оценки развития эмбрионов и самого исхода беременности. А также углубят понимание фундаментальной биологии кумулюсно-ооцитарных клеточных комплексов и эмбрионов через исследование, например, функции отдельных генов.

Окраска пропидиума йодидом дает возможность визуализировать форму комет и позволяет разделить ДНК-кометы клеток кумулюсного окружения ооцитов мышей в условиях экспериментального тиреоидита на 5 классов в зависимости от соотношения полученного нами материала ДНК в «голове» и «хвосте» кометы, что полностью соответствует данным литературы [7]. Нами впервые установлено, что экспериментальный тиреоидит вызывает гибель ~17% клеток кумулюсного окружения ооцитов, количество таких клеток с поврежденной ДНК составляет 46,2%, большинство комет кумулюсных клеток с двунитевыми разрывами ДНК отнесены к 3-му классу.

Известно, что взаимодействие ооцита и кумулюса в значительной степени опосредовано экспрессией growth differentiation factor 9 (GDF9) и bone morphogenetic protein 15 (BMP15), входящих в состав суперсемейства трансформирующих факторов роста β - одного из крупнейших семейств ростовых факторов у млекопитающих, функционирующего в многочисленных физиологических процесах, в частности, в фолликулогенезе, стероидогенезе и овуляции. Их ключевая роль в регуляции овуляции первоначально была установлена у мышей, а затем подтверждена у овец и человека [10].

GDF9 регулирует экспрессию нескольких генов кумулюсных клеток, участвующих в кумулюсном расширении, в том числе HAS2, COX2 и GREM1, кодирующих gremlin 1 (ВМР - антагонист). GREM1, как считают, осуществляет регуляцию функции кумулюсных клеток через ооцит-продуцируемые GDF9 и BMP15. HAS2 имеет важное значение для кумулюсного расширения, гиалуроновая кислота является основным компонентом матрицы, которая образуется при расширении кумулюса в ответ на овуляторный выброс лютеинизирующего гормона. COX2 имеет важное значение для овуляции, но также необходима для оплодотворения и действует как селективный ингибитор BMP15, что предотвращает преждевременную лютеинизацию кумулюса [11, 12]. В наших опытах впервые установлено, что при экспериментальном тиреоидите происходит снижение экспрессии GREM1 в 1,65 раза, тогда как экспрессия HAS2 и COX2 не изменяется.

Экспериментальный тиреоидит вызывает гибель ~17% клеток кумулюсного окружения ооцитов, количество таких клеток с поврежденной ДНК составляет 46,2%, большинство комет кумулюсных клеток с двунитевыми разрывами ДНК отнесены к 3-му классу; происходит снижение экспрессии GREM1 в 1,65 раза, экспрессия HAS2 и COX2 не изменяется.

Проведенная нами оценка дает основание утверждать, что в условиях экспериментального тиреоидита происходит нарушение интегральной целостности генома клеток кумулюсного окружения ооцитов, что отражается в увеличении количества двунитевых разрывов ДНК. Однако эти изменения могут быть обратимыми; изменение экспрессии гена GREM1 может стать характерным показателем нарушения овариальной функции.

Дальнейшие работы должны быть направлены на определение оценки качества ооцитов по состоянию генома клеток их кумулюсного окружения в отдельных кумулюсно-ооцитарных клеточных комплексах.

Работа поддержана грантом «Фундаментальные основы геномики и протеомики» Национальной академии наук Украины (0112U001477).

The work was supported with a grant "Fundamental bases of genomics and proteomics" of National Academy of Sciences of Ukraine (0112U001477).