Оценка качества спермы, рекомендованная ВОЗ, не всегда позволяет выявить ультраструктурные изменения сперматозоидов, обусловливающие нарушения эмбрионального развития [1, 2].

Последние годы в качестве лабораторного критерия нормальной репродуктивной функции мужчины стали применять оценку структурных нарушений ДНК сперматозоидов - оценку адекватной упаковки ДНК и оценку наличия разрывов ДНК [3, 4].

Фрагментация ДНК сперматозоидов оказывает влияние на ранние этапы эмбрионального развития, особенно на формирование бластоцисты, что определяет частоту наступления беременности в циклах ВРТ [5, 6].

Многими исследованиями [2, 7-10] установлена прямая корреляция частоты наступления беременности при применении методов ВРТ с количеством повреждения ДНК в сперматозоидах. Повреждения ДНК могут служить диагностическим маркером негативного отцовского эффекта в отношении преимплантационного развития человека. Сперматозоиды даже со значительным уровнем повреждений ДНК сохраняют способность к оплодотворению ооцита, но в дальнейшем эмбриональное развитие может блокироваться при формировании бластоцист и имплантации эмбрионов в матку.

Для диагностики фрагментации ДНК сперматозоидов в России, как и во всем мире, широко применяют метод TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferases (TdT) dUTP end labeling), который способен прямо метить разрывы в ДНК. Интенсивность люминесценции пропорциональна числу встроенных dUTP и соответственно числу разрывов в ДНК. О наличии повышенного уровня фрагментации ДНК сперматозоидов говорят при обнаружении у пациентов более 15% TUNEL-позитивных сперматозоидов [9, 11].

Существуют эмбриологические и андрологические подходы к преодолению высокой фрагментации ДНК в протоколах ВРТ.

Технологии обработки спермы растворами «PureSperm» и «Percoll» способствуют обогащению образца спермы клетками с интактной нормально упакованной ДНК [12]. Сравнение различных методов подготовки спермы доказывает, что наиболее эффективным методом элиминации неживых и апоптотических сперматозоидов является процедура swim-up [13, 14] в сравнении с градиентным центрифугированием и простой отмывкой сперматозоидов от семенной плазмы [15].

Однако обработка спермы in vitro, удаление при отмывке семенной плазмы, обладающей антиоксидантными свойствами, центрифугирование и длительная инкубация повышают вероятность вредоносного воздействия на сперму активных форм кислорода (АФК), источником которых являются лейкоциты, клетки сперматогенеза, цитоплазматические капли [16].

При лечении бесплодия с мужским фактором, обусловленным повышенным уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов, целесообразно применение метода PICSI. Метод PICSI основан на снижении подвижности зрелого сперматозоида из-за связывания с гиалуронатом. Только полностью зрелый сперматозоид с интактной ДНК имеет на головке специальные рецепторы и способен эффективно связываться с гиалуронатом. В клинических исследованиях было показано, что при использовании PICSI наблюдалось увеличение процента эмбрионов высокого качества и частоты наступления имплантации [17-19].

Снизить высокие показатели фрагментации ДНК возможно с помощью применения в протоколах ИКСИ тестикулярных сперматозоидов. Установлено, что фрагментация ДНК в эякуляторных сперматозоидах существенно выше, чем в тестикулярных [20].

Тестикулярные сперматозоиды имеют менее поврежденные хромосомы даже по сравнению со сперматозоидами, аспирированными из придатков у пациентов с обструктивной азооспермией [21].

Потенциально перспективным методом лечения высокого уровня фрагментации ДНК сперматозоидов является применение рекомбинантных препаратов ФСГ (фоллитропин бета, фоллитропин альфа). По-видимому, уменьшение количества сперматозоидов с фрагментированной ДНК при назначении рекомбинантного ФСГ достигается за счет снижения их объемной доли в общем количестве сперматозоидов. Под воздействием ФСГ увеличивается число созревающих в семенных канальцах сперматозоидов, а число сперматозоидов с фрагментированной ДНК в ходе апоптоза остается неизменным. Несмотря на то что достоверность исследования была статистически значимой, исследователи в своих выводах отметили необходимость проведения масштабных двойных плацебо-контролируемых исследований [22].

Экспериментальные исследования на лабораторных животных также показали роль рецепции рекомбинантного ФСГ в обеспечении нормальной структуры ДНК: фрагментация ДНК эпидидимальных сперматозоидов у мышей дикого типа была значительно ниже, чем у мышей с «нокаутом» рецептора ФСГ [23].

Сегодня принято считать, что стимуляция клеток Сертоли гормоном ФСГ - условие ингибирования апоптоза диплоидных сперматогоний, признаком чего является интактность ДНК, сохранение их жизнеспособности и вхождения в мейоз [24, 25].

К патогенетически обоснованному лечению при повышенной фрагментации ДНК относится применение антиоксидантов [4, 26]. Практика назначения пероральных антиоксидантов поддерживается отсутствием серьезных побочных эффектов, связанных с антиоксидантной терапией, хотя некоторые исследования тщательно оценивали риски передозировки антиоксидантами [27].

Антиоксидантная терапия обычно приводит к значительному улучшению целостности ДНК сперматозоидов, более адекватной упаковки на протаминах, меньшей выраженности признаков апоптоза гамет (annexin V и др.), в некоторых случаях - увеличению частоты наступления беременности после ВРТ [28-32].

При этом существенных изменений в параметрах рутинной спермы (концентрация, подвижность, морфология) и/или концентрации мужских половых гормонов может и не быть [32].

Проанализировав и обобщив мировой опыт, мы провели настоящее исследование, чтобы в дальнейшем разработать алгоритм действий при выявлении высокого уровня фрагментации ДНК сперматозоидов.

Цель исследования - повысить уровень успешных программ ВРТ у пациентов с повышенным уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов.

Характеристика клинического материала. В период с мая 2012 г. по октябрь 2013 г. в исследование были включены 18 мужчин (средний возраст 37,6±6,7 года) с повышением уровня фрагментации ДНК сперматозоидов.

Критерии включения пациентов в исследование:

- продолжительность бесплодного брака не менее 5 лет;

- первичность мужского бесплодия и вторичность женского;

- наличие в анамнезе не менее трех неудачных протоколов ВРТ (ИКСИ 100%) с остановкой эмбрионов в развитии на 3-5-е сутки культивирования;

- отсутствие врожденных и приобретенных анатомических дефектов репродуктивной системы;

- отсутствие генетических нарушений и эндокринопатий;

- отсутствие острых и обострений хронических воспалительных процессов органов репродуктивной системы в ходе исследования;

- показатели основных параметров спермограммы на уровне: концентрация сперматозоидов ≥5 млн/мл; прогрессивная подвижность сперматозоидов ≥5%; морфология сперматозоидов по строгим критериям Крюгера ≥1%;

- уровень фрагментации ДНК сперматозоидов (определенный методом TUNNEL) не менее 15%.

Отдельно были определены критерии для супруг пациентов:

- возраст менее 35 лет (на момент протокола ВРТ);

- выполнение гормональной стимуляции ооцитов, позволяющей получить не менее 5 яйцеклеток;

- отсутствие синдрома гиперстимуляции яичников в протоколе ВРТ;

- отсутствие медицинских показаний к имплантации эмбрионов и самостоятельному вынашиванию беременности.

Дизайн исследования. После обследования и включения пациентов в исследование пациентам за 8 нед до предполагаемой даты пункции назначалась следующая терапия:

- оральные антиоксиданты (L-carnitine 1000 мг + Acetyl-L-carnitine 500 мг) 2 раза в день;

- рекомбинантный ФСГ (фоллитропин бета) в дозе 0,5 МЕ на 1 кг массы тела через день.

За 10 дней до даты пункции яйцеклеток у супруги пациентам проводилась динамическая оценка уровня фрагментации ДНК сперматозоидов и принималось решение о выборе протокола ВРТ:

- если уровень фрагментации ДНК сперматозоидов (определенный методом TUNNEL) составлял менее 30%, то выполнялся протокол PICSI 100% с использованием нативных сперматозоидов;

- если уровень фрагментации (определенный методом TUNNEL) составлял более 30%, то выполнялся протокол PICSI 100% с использованием тестикулярных сперматозоидов.

В процессе эмбриологического этапа определялся индекс связывания сперматозоидов с гиалуроном (ИС). Нормальным считали индекс 65% и более.

Через 2 нед после переноса эмбрионов, выполненного во всех случаях на 5-е сутки культивирования (за исключением случаев остановки эмбрионов в развитии), определялся уровень чХГ у супруг пациентов для оценки факта наступления/отсутствия биохимической беременности.

В случае фиксации биохимической беременности осуществлялось стандартное акушерское наблюдение за супругами пациентов. Контрольными показателями акушерского наблюдения в данном исследовании были клиническая беременность и роды живым ребенком.

После отбора пациентов в соответствии с критериями включения пациентов и их супруг в настоящее исследование выяснилось, что клинические диагнозы мужчин были представлены шестью группами. Спермиологические диагнозы были более вариабельны. Данные представлены в табл. 1.

При анализе табл. 1 выяснилось, что уровень фрагментации ДНК сперматозоидов не коррелирует ни с клиническим, ни со спермиологическим диагнозом. В то же время у 13 из 18 пациентов было выявлено варикоцеле. Хочется отметить, что во всех случаях варикоцеле было выявлено впервые, у всех пациентов отсутствовал болевой синдром, а по данным УЗДГ, ретроградный кровоток не фиксировался. В связи с этим, а также учитывая возраст пациентов, оперативное лечение варикоцеле не предлагалось.

На фоне проводимой терапии представлялось необходимым оценить изменение уровня фрагментации ДНК сперматозоидов. На рисунке представлена динамическая характеристика изменений уровня фрагментации ДНК сперматозоидов, проведенная за 10 дней до даты ВРТ.

Пациенты (см. табл. 2) были ранжированы в порядке убывания уровня фрагментации ДНК, определенного первоначально.

При проведении клинического анализа не удалось найти связи между изменением уровня фрагментации и клиническим и спермиологическим диагнозами пациентов. Эти данные представлены в табл. 2.

Конечным результатом настоящей работы явилась оценка клинического эффекта в виде положительных исходов ВРТ (табл. 3).

Эффективность ВРТ в 22,2%, достигнутая в ходе настоящего исследования, является сопоставимой с эффективностью ВРТ у бесплодных пар, вообще не имеющих мужской фактор. Разработана доктрина комплексного подхода к лечению инфертильности у данной категории пациентов. Анализ мировой литературы подтверждает наш тезис о недопустимости использования только андрологических или только эмбриологических методик преодоления инфертильности у пациентов с повышенным уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов.

Несомненно, необходимо проведение более широкого исследования проблемы лечения бесплодия, обусловленного повышенным уровнем фрагментации ДНК. Надеемся, что легкая воспроизводимость настоящего исследования позволит увеличить число клинических наблюдений и даст импульс к совершенствованию медицинской помощи у данной категории пациентов.