Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) уже давно стала рутинной процедурой во многих клиниках ЭКО по всему миру. В тех случаях, когда пациент является носителем генной или хромосомной аномалии, ПГД становится неотъемлемой частью программы ЭКО. Стремительному развитию ПГД в настоящее время способствует внедрение в эмбриологическую практику современных молекулярных методов анализа ДНК: сравнительной геномной гибридизации (CGH) [1, 42], секвенирования [6, 16, 43], полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флюоресцентной детекцией [23, 28]. Использование данных технологий в целях ПГД наряду с общепринятым FISH и ПЦР с электрофоретической детекцией расширяет возможности исследования генетического статуса эмбрионов человека, полученных in vitro.

Независимо от того, какой метод молекулярного анализа используют для ПГД, исследование проводят на материале ДНК одной или нескольких эмбриональных клеток. Первые работы [21, 45], в которых была продемонстрирована биопсия клеток у эмбрионов человека в целях генетической диагностики, выполнены на 3-и сутки раннего развития, когда эмбрион состоит из 6—8 клеток (стадия дробления). Биопсия бластомеров на восьмиклеточной стадии и сейчас является наиболее распространенной и широко практикуемой во многих лабораториях мира [5, 10, 13, 46].

Тем не менее в настоящее время уже стали очевидными преимущества биопсии клеток трофэктодермы бластоцист (5-е сутки развития) по сравнению с биопсией бластомеров на стадиях дробления (3-и сутки развития) [17, 22, 25, 29]. В первую очередь при биопсии клеток у бластоцист возможно получение большего объема клеточного материала для исследования, чем при биопсии на стадиях дробления, когда количество изъятого материала ограничено 1—2 клетками [5, 18]. Увеличение числа эмбриональных клеток, полученных в результате биопсии, упрощает проведение генетического анализа, повышает достоверность результата и позволяет выявить хромосомные и генные нарушения, используя методы, основанные на ПЦР или FISH [47].

Другим преимуществом биопсии на 5-е сутки развития является то, что исследуют эмбрионы, достигшие стадии бластоцисты. Эмбрионы на данной стадии успешно прошли первый этап клеточной дифференцировки, который морфологически выражен в процессах компактизации и кавитации, и обладают наиболее высоким потенциалом к имплантации [4, 17, 20]. В ряде современных работ [14, 47] было показано, что частота выявленных анеуплоидий у бластоцист достоверно ниже, чем у дробящихся эмбрионов.

Несмотря на очевидные преимущества биопсии трофэктодермы бластоцисты на 5-е сутки развития, этот подход имеет существенный недостаток: время для осуществления диагностики ограничено сроками проведения переноса эмбрионов (embryo transfer) и составляет интервал от нескольких часов до одних суток. Данное обстоятельство может являться причиной отмены переноса эмбрионов в текущем цикле ЭКО, криоконсервации бластоцист и проведения переноса эмбрионов в другом цикле [8, 40]. Кроме того, материал биопсии трофэктодермы не всегда пригоден для проведения генетического исследования методом FISH, поскольку выделение и фиксация ядер клеток, полученных в результате механического или лазерного отсечения трофэктодермы, как правило, затруднены. В настоящее время, по опубликованным данным, только в 0,2% случаев ПГД выполняют на материале трофэктодермы [19].

Таким образом, методики получения эмбриональных клеток для ПГД как на стадии дробления, так и на стадии бластоцисты хорошо известны и имеют свои особенности. Одновременно с этим в настоящее время отсутствуют какие-либо данные относительно возможности проведения биопсии на стадии компактной морулы (4-е сутки развития).

Мы впервые продемонстрировали возможность биопсии на стадии компактной морулы и изучили особенности и эффективность данного подхода при проведении преимплантационного генетического скрининга (ПГС).

В исследование были включены супружеские пары, проходящие лечение методом ЭКО-ИКСИ с ПГС в Медицинской клинике репродукции МАМА с сентября 2011 г. Средний возраст пациенток составил 33 года. ПГС проводили с целью выявления у эмбрионов наиболее распространенных анеуплоидий (хромосомы X, Y, 21) по желанию пациентов. В период с сентября 2011 г. по февраль 2013 г. проведено 215 лечебных циклов ЭКО-ИКСИ с ПГС, в ходе которых было получено в среднем по 11±4,0 ооцита. Во всех циклах оплодотворение проводили методом ИКСИ. Биопсия была выполнена 709 эмбрионам на стадии компактной морулы.

Индукцию суперовуляции проводили по короткому протоколу с использованием антагонистов, гонадотропных гормонов и гормонов, рекомбинантных ФСГ. Стартовые дозы ФСГ были подобраны индивидуально от 150 до 225 МЕ, в зависимости от исходного состояния пациенток и реакции яичников на гормональную стимуляцию. Овуляторную дозу чХГ (10 000 МЕ) вводили, когда по меньшей мере три фолликула имели размер 17 мм или более. Трансвагинальную пункцию яичников проводили на 12—14-й день стимулированного цикла.

После проведения процедуры ИКСИ ооциты помещали в среду для культивирования (500 мкл) под слой минерального масла и культивировали в течение 72 ч в мультигазовом инкубаторе (CO₂ 6,0%; O₂ 5,0%; N₂ 89%; температура 37,2±0,2 °С), с последующей сменой среды через 72 ч после оплодотворения. Эмбрионы, достигшие к 4-м суткам развития (92 ч после оплодотворения) стадии компактной морулы, не имеющие вакуолизации и фрагментации >30%, инкубировали в среде без содержания ионов Cа²⁺ в течение 15 мин в мультигазовом инкубаторе. После этого осуществляли иссечение блестящей оболочки механическим способом и проводили биопсию клеток декомпактизированной морулы методом, применяемым для биопсии бластомеров на стадии дробления. После биопсии эмбрионы продолжали культивировать in vitro под слоем минерального масла в течение 24—48 ч до момента их переноса в полость матки на 5—6-е сутки после оплодотворения.

Выделение ядер эмбриональных клеток после биопсии осуществляли с использованием солевого гипотонического раствора (цитрат натрия — 1%). Для фиксации ядер на предметном стекле использовали фиксатор Карнуа (объемное соотношение метанола и уксусной кислоты 3:1).

FISH проводили с использованием флюоресцентно-меченных ДНК-проб: на хромосому Х (SEP X/DXZ1/Spectrum Green), хромосому Y (SEP Y/DYZ1/Spectrum Aqua) и хромосому 21 (21q22.13-22.2/LSI 21/Spectrum Orange) («Abbott Molecular Inc»). Гибридизацию осуществляли во влажной камере в течение 16—24 ч при температуре 37 °C. Позитивные сигналы визуализировали при помощи люминесцентного микроскопа после DAPI — окрашивания препаратов.

В 125 циклах ЭКО-ИКСИ с ПГС проведена биопсия 709 компактным морулам. В результате процедуры от каждого эмбриона получали от 3 до 7 клеток. После биопсии эмбрионы помещали в среду для культивирования и контакты между клетками восстанавливались в течение 2—3 ч (рис. 1).

Всего 645 (91%) из 709 эмбрионов после биопсии к 5—6-м суткам развития достигли стадии бластоцисты (в Медицинской клинике репродукции МАМА в циклах ЭКО без ПГД 92,3% компактных морул становятся бластоцистами). В 125 циклах ЭКО из 195 на 5—6-е сутки после оплодотворения осуществлена внутриматочная трансплантация бластоцист (по 1—2 эмбриона); клиническая беременность наступила в 64 (32,8%) из 195 случаев (в Медицинской клинике репродукции МАМА средняя частота наступления клинической беременности после ЭКО без проведения ПГД составляет 38,2%). Таким образом, развитие эмбрионов и частота наступления беременности после проведения биопсии на стадии компактной морулы достоверно не отличаются (p≤0,05) от данных показателей в обычных циклах ЭКО-ИКСИ без ПГС. В настоящее время из 64 полученных клинических беременностей 24 завершились родами, 32 беременности прогрессируют, 8 беременностей прервались. Клинико-эмбриологические данные по 215 циклам ЭКО-ИКСИ с ПГС представлены в таблице.

По результатам FISH исследования (хромосомы X, Y, 21) (рис. 2)

Для генетической диагностики доимплантационных эмбрионов, полученных в программах ЭКО, используют материал ДНК эмбриональных клеток. Известно, что биопсию клеток у эмбриона можно выполнить на стадии дробления, когда эмбрион состоит из 6—8 клеток (биопсия бластомеров) или на стадии бластоцисты (биопсия трофэктодермы) [11, 41]. Проведение биопсии у компактной морулы считалось невозможным из-за наличия адгезивных контактов между эмбриональными клетками на данной стадии развития [12].

Клеточные контакты в ходе компактизации у морулы млекопитающих, в том числе человека, образуются при участии трансмембранного гликопротеина увоморулина (epithelial-cadherin, E-cadherin), который относится к классу кадгеринов — кальцийзависимых адгезивных молекул [2]. Внеклеточный регион Е-кадгерина содержит домен, претерпевающий Ca²⁺ зависимые конформационные изменения, что приводит к гомодимеризации гликопротеина на мембране. Внутриклеточный домен Е-кадгерина ассоциирован с актиновыми филаментами цитоскелета. В димеризованном состоянии Е-кадгерины соседних клеток взаимодействуют между собой, образуя адгезивные контакты [24].

В 1998 г. R. Pey и соавт. [36] продемонстрировали возможность искусственной декомпактизации морулы мыши в среде без содержания ионов Ca²⁺. Процесс декомпактизации в бескальциевой среде происходит только за счет конформационного изменения внеклеточного домена Е-кадгерина без потери адгезивной способности гликопротеина. Таким образом, искусственная декомпактизация морулы является обратимой, и при введении в среду ионов Ca²⁺ между клетками морулы вновь образуются контакты, возобновляется процесс клеточной дифференцировки [36]. В нашем исследовании тоже показано, что после инкубирования компактных морул человека в среде без содержания ионов Ca²⁺ происходит их декомпактизация. Отсутствие контактов между клетками у декомпактизированной морулы делает возможным получение нескольких клеток для анализа. После возврата эмбрионов в среду для культивирования с содержанием ионов Ca²⁺ процесс компактизации восстанавливается в течение 2—3 последующих часов.

В настоящем исследовании продемонстрировано, что при биопсии на стадии компактной морулы возможно получение 3—7 клеток от эмбриона для анализа. Этот результат сопоставим с результатом биопсии трофэктодермы, при которой возможно получение от 2 до 6 клеток [23, 25, 30, 48], и значительно превосходит возможности биопсии на стадии дробления, когда количество получаемых бластомеров ограничено 1—2 клетками [5, 18]. Эмбриональные клетки, полученные при биопсии морул, сохраняют жизнеспособность. Данный факт отличает предложенный нами метод биопсии от способа биопсии трофэктодермы, когда часть клеток получает механические повреждения, связанные с особенностями методики проведения данной процедуры (механическое или лазерное отсечение фрагмента трофэктодермы). Жизнеспособность биоптированных клеток играет важную роль при получении адекватных препаратов для исследования методом FISH, поскольку эффективное выделение ядер методом гипотонии осуществляется у клеток с неповрежденной плазматической мембраной. Таким образом, материал биопсии трофэктодермы не всегда может быть пригоден для проведения FISH анализа, и в настоящее время чаще всего используется при выполнении ПГД с применением ПЦР [16, 23, 25, 35] и последующей CGH [9, 26, 43, 48]. В то же время клетки, полученные в результате биопсии у морул, могут быть пригодны как для проведения FISH анализа, так и для исследования амплифицированной ДНК.

Ключевыми параметрами для оценки влияния любой манипуляции на развитие эмбрионов человека in vitro и in vivo являются доля эмбрионов, достигших стадии бластоцисты, и частота наступления беременности. В отличие от биопсии бластомеров на 3-и сутки развития, когда выход бластоцист, по некоторым данным литературы [10, 18, 25], составляет 47—60%, после биопсии на стадии компактной морулы 96% исследуемых эмбрионов достигают стадии бластоцисты. Этот результат достоверно не отличается от данных, полученных в нашей клинике относительно развития морул, не подвергавшихся процедуре биопсии: к 5-м суткам развития 92,3% компактных морул становятся бластоцистами. Частота наступления клинической беременности после биопсии на стадии компактной морулы составляет 32,8%, что также достоверно не отличается от средней частоты наступления беременности при проведении ЭКО в нашей клинике. Отсутствие достоверной разницы по формированию бластоцист и наступлению беременности указывает на то, что биопсия, проведенная на стадии компактной морулы, не имеет негативного влияния на эмбриональное развитие in vitro и жизнеспособность in vivo.

Высокий уровень формирования бластоцист после биопсии на 4-е сутки развития и адекватная частота наступления беременности указывают на обратимость процесса декомпактизации в бескальциевой среде, отсутствие травматичности метода, а также на высокую степень регуляторной и компенсаторной способности эмбрионов на данной стадии развития. Высокая регуляторная способность морул была продемонстрирована многими исследователями на эмбрионах разных видов млекопитающих. Так, даже микрохирургическое разделение пополам морул коровы, козы, свиньи и мыши не сказывается негативно на эмбриональном развитии и рождении полноценной особи [33, 34, 37, 39, 44].

Кроме того, к моменту проведения нами биопсии (на стадии компактной морулы) уже осуществлен этап естественной селекции эмбрионов, несущих грубые генетические аномалии, которые возникают в ходе активации эмбрионального генома [3, 20, 27]. Как правило, это проявляется в выраженном нарушении доимплантационного развития, в то время как эмбрионы, не несущие грубых генетических нарушений, успешно проходят первый ключевой этап раннего эмбриогенеза — начало клеточной дифференцировки [4, 20, 38]. В настоящем исследовании результатами FISH диагностики показано, что уровень выявленной анеуплоидии у эмбрионов при биопсии на 4-е сутки составляет 19,2%, что значительно ниже, чем уровень анеуплоидии у эмбрионов при биопсии на 3-и сутки развития — 55—65%, по данным литературы [7, 15, 31, 32]. Таким образом, мы осуществляем выбор эмбрионов для проведения генетической диагностики в тот момент, когда их потенциал к нормальному доимплантационному развитию уже в значительной степени определен.

В представленной работе мы впервые продемонстрировали возможность проведения биопсии на стадии компактной морулы, что позволяет получить достаточный объем клеточного материала для генетической диагностики любым общепринятым способом. Механическая травматизация изъятых клеток минимальна, что значительно облегчает процесс фиксации ядер для проведения FISH анализа. Интервал времени между проведением биопсии и получением результата исследования достаточен для того, чтобы осуществить перенос эмбрионов на 5—6-е сутки развития в текущем цикле ЭКО. После биопсии практически все исследуемые эмбрионы достигают стадии бластоцисты, а частота наступления беременности сопоставима с эффективностью программы ЭКО без ПГД, что говорит об отсутствии негативного влияния биопсии на стадии компактной морулы на развитие эмбрионов человека как in vitro, так и in vivo.