Метаболический профиль спермоплазмы крыс при воздействии загрязнителей окружающей среды класса полихлорбифенилов

Одной из основных детерминант репродуктивного здоровья является воздействие окружающей среды. A. Lange и соавт. [1] отмечают, что к мужскому бесплодию приводит множество факторов, но химическое загрязнение биосферы является одной из первостепенных причин. В повседневной жизни человек постоянно контактирует с репротоксикантами техногенного происхождения. Наибольший интерес вызывают диоксины, полибром- и полихлорбифенилы, фталаты, бисфенол А, перфтороктановый сульфонат и ряд соединений с доказанной или потенциальной репро- и спермотоксичностью [2, 3]. Действуя совместно, эти вещества активны даже в том случае, если концентрация отдельных из них меньше предельно допустимой, т.е. для них характерен «эффект коктейля». Одним из последствий загрязнения стала феминизация мужских особей в дикой природе: камбалы в Великобритании, трески в Северном море, тростниковой жабы во Флориде, сапсана в Испании и черепах в Великих озерах [4]. Эквивалентом этих нарушений у человека являются снижение качества эякулята, крипторхизм, гипоспадия и рак яичек [5]. В нашей стране эти проблемы по существу игнорируются. Так, Стокгольмская конвенция (2001) по запрещению стойких органических загрязнителей была ратифицирована в РФ лишь в 2012 г. Между тем продемонстрирована взаимосвязь нарушения репродуктивной функции российских мужчин и уровня диоксинов, выявлено смещение sex ratio на загрязненных территориях, обнаружены высокие концентрации бисфенола А и полихлорбифенилов в продуктах питания [6—8] и т.п.

Полихлорбифенилы (ПХБ) занимают особое место в ряду экополлютантов вследствие уникальных физико-химических свойств, широкого распространения в природе и высокой устойчивости в живых системах [9, 10]. Обладая структурным сходством с эстрогенами, ПХБ проявляют свойства гормоноподобных ксенобиотиков, стимулируя в тканях-мишенях митотическую активность и эстрогензависимые ферменты [11, 12]. Поступление ПХБ в пренатальном периоде оказывает феминизирующее, в период полового созревания – демаскулинизирующее влияние, у половозрелых особей приводит к патологии сперматогенеза [13, 14]. Преобладает мнение, согласно которому ПХБ рассматриваются в качестве одного из основных загрязнителей, ответственных за увеличение распространенности мужской репродуктивной патологии. В ряде исследований [15, 16] подчеркивается большая чувствительность к воздействию ПХБ мужских особей как при пренатальном, так и при постнатальном воздействии. Вместе с тем имеются доказательства и альтернативной точки зрения. Трудности в трактовке большого массива данных, очевидно, обусловленных неоднородностью, большим разнообразием и сложностью смесей ПХБ, а в случае экспериментальных работ и несовпадением доз, продолжительности и режимов введения, а также отличием использованных моделей интоксикации и видов животных. Не все аспекты рассматриваемой проблемы нашли отражение в научной литературе, что и предопределяет необходимость дальнейших изысканий в этой области.

Цель настоящей работы — анализ биохимического состава спермоплазмы в условиях воздействия загрязнителей окружающей среды на модели хронической экспозиции полихлорированными бифенилами.

Для решения поставленных задач были использованы 160 белых беспородных половозрелых крыс массой 220—270 г. Животные содержались в одинаковых условиях на стандартной диете вивария при 12-часовом световом дне. Статистические группы состояли из 9—12 особей. Эксперименты проводили с соблюдением биоэтических правил по использованию животных в биологических и медицинских исследованиях [17].

Для моделирования интоксикации ПХБ использовали многокомпонентный состав Совол, содержащий 26% тетра-, 65% пента-, 9% гексахлорбифенилов и следовые качества хлорбифенилов. Выбор этого препарата обусловлен тем, что совол является основным продуктом класса ПХБ, производимым отечественной промышленностью в течение более 60 лет, кроме того, препарат совол близок к Арохлору 1254, который принят международными организациями в качестве стандартной смеси ПХБ. При проведении экспериментальных исследований были выбраны дозы: 37,5 мг/кг, которая соответствует порогу вредного воздействия, и доза 3,75 мг/кг, где действие должно быть минимальным. Совол вводили в виде раствора в растительном масле ежедневно в желудок 5 раз в неделю, за исключением выходных, в течение 4 мес.

Животные были разделены на три группы: в 1-ю группу входили крысы, которым ежедневно вводили препарат из расчета 3,75 мг на 1 кг массы, доза для животных 2-й группы составила 37,5 мг/кг, животным контрольной группы вводили растительное масло.

При биохимическом исследовании в семенной жидкости определялись основные субстраты энергетического и пластического обмена. Содержание глюкозы и общего белка в спермоплазме определяли соответственно глюкозооксидазным и биуретовым методами с помощью стандартных наборов, содержание фруктозы — по интенсивности образования комплексного соединения продукта ее окисления ω-оксиметилфурфурола с резорцином.

Определение цитрата в семенной жидкости проводили по Natelson в модификации М.А. Базарновой [18]. Содержание лактата определяли в ЛДГ-реакции по приросту НАДН+Н⁺ [19]. Концентрацию альбуминов, креатинина, мочевины и кальция исследовали на полуавтоматическом биохимическом анализаторе Stat Fax 1904+ фирмы «Awareness Technology» (США) с помощью диагностических наборов Био-ЛА-Тест компании «Эрба Лахема» (Чехия).

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью параметрических методов анализа с использованием t-критерия Стьюдента.

Спермоплазма отличается особенностями химического состава, в который входит большое количество специфических веществ, обнаруживаемых и в других жидкостях и тканях организма, но в иных пропорциях. Она содержит значительное количество белков и аминокислот, липидов и углеводов, ряд ферментов, гормонов, цитокинов и других низкомолекулярных регуляторных пептидов, катионов и анионов, основная функция которых заключается в обеспечении нормального метаболизма и жизнеспособности сперматозоидов [20].

При исследовании биохимического состава спермальной плазмы крыс, подвергшихся воздействию ПХБ, были обнаружены дозозависимые изменения содержания изученных показателей (см. таблицу).

Установлено, что динамика содержания общего белка в спермоплазме имела отчетливый отрицательный тренд, который достигал уровня статистической значимости через 3 мес после воздействия. К исходу 4-го месяца эксперимента концентрация общего белка снижалась до 54—65% от контрольных величин. В эти же сроки обнаружен более высокий уровень мочевины — в 1-й группе концентрация составляла 32,1±2,7 ммоль/л, а во 2-й группе — 36,8±3,1 ммоль/л, что на 24—30% больше (p<0,05), чем в контрольной группе.

Существенное уменьшение концентрации общего белка и увеличение содержания мочевины свидетельствуют о преобладании катаболических реакций над процессами биосинтеза. Очевидно, большее количество аминокислот подвергается внутриклеточному распаду, что ведет к образованию повышенного количества аммиака — субстрата для биосинтеза мочевины.

Столь же заметными были отклонения от нормальных значений концентрации других субстратов, за исключением фруктозы, уровень которой ни в одной из точек наблюдения в обеих дозах статистически достоверно не отличался от контроля. Вероятно, в условиях интоксикации уменьшалось использование фруктозы сперматозоидами на энергетические цели, что привело к уменьшению скорости фруктолиза: способность гамет к утилизации фруктозы к 4 мес эксперимента составила около 51% от контрольных величин.

Параллельно была отмечена убыль других важных энергетических субстратов мужских половых клеток — глюкозы и цитрата. Через 3 мес после начала введения токсиканта обнаружено достоверное пропорционально полученной дозе снижение содержания в семенной жидкости обоих соединений, через 4 мес наблюдались наименьшие значения этих показателей у животных, получивших ПХБ в максимальной дозе. Что касается лактата, который может также служить энергетическим субстратом, то его концентрация в спермоплазме на фоне затравки, напротив, даже возрастала, начиная со 2-го месяца эксперимента.

При рассмотрении роли различных молекул в генезе патологии эякулята нельзя не упомянуть о таком универсальном внутриклеточном мессенджере, как ион кальция. Более чем двукратное истощение семенной плазмы по кальцию на фоне отравления соволом практически полностью совпадало с динамикой уровня других аналитов, а по амплитуде колебаний и темпам возникновения даже превосходило их. Ионы кальция и циклический АМФ выступают как синергисты, запускающие каскад реакций фосфорилирования флагеллярных белков в процессе вызревания и приобретения сперматозоидами способности к активным движениям в придатке яичка, кроме того, они наряду с АТФ прямо или косвенно вовлечены в управление интенсивностью апоптоза в эпидидимальных и эякулированных гаметах, выполняя протекторную функцию [21—23].

Другим ключевым даун-регулятором скорости апоптоза мужских половых клеток, независимым от АТФ, является уровень лактата [24]. Однозначно негативная интерпретация повышения концентрации молочной кислоты, обнаруженного в наших экспериментах, вряд ли правомерна. В настоящее время происходит пересмотр классической парадигмы, согласно которой лактат рассматривался как ненужный продукт, метаболический тупик, а его накопление называлось главной причиной ацидоза, утомления и истощения [25]. Гиперпродукция лактата как результат кислородного голодания — скорее исключение, чем правило. Лактат осуществляет в организме функцию мобильного посредника, способного к быстрому перемещению между клетками, тканями и органами, где может быть окислен до воды и СО₂ либо превращен в пируват и реутилизирован в глюкозу [26].

Лактат стимулирует дыхание в сперматозоидах и поддерживает их подвижность благодаря транспорту в митохондрии, где он метаболизируется при помощи специфического окислительного комплекса [27]. Поэтому неудивительно, что молочная кислота является предпочтительным субстратом для митохондрий даже в присутствии пирувата, фруктозы и глюкозы [28].

Жидкость извитых семенных канальцев содержит большое количество лактата и мало глюкозы и пирувата [29], и эта зависимость метаболизма созревающих гамет от окисления лактата может быть использована в практических целях. Так, J. Courtens и L. Plöen [30] сообщили об улучшении сперматогенеза при интратестикулярной инфузии молочной кислоты в яичко крыс с крипторхизмом.

Лактат служит не только топливом для аэробного метаболизма, но и, вероятно, регулятором окислительно-восстановительного состояния в различных клеточных и тканевых компартментах, а также играет роль сигнальной молекулы или, как выразился G. Brooks [31], «лактормона». В этом качестве лактат способен к ап-регуляции генов монокарбоксилатных переносчиков и цитохромоксидазы и экспрессии соответствующих белков, выступая как физиологический стимул для активации обширной сети транскрипции, затрагивающей митохондриальный биогенез, формируя гибкую систему метаболической адаптации к экстремальным условиям окружающей среды.

Таким образом, прирост уровня лактата в спермоплазме при хроническом отравлении ПХБ может отражать, во-первых, его выход из семенников, где он в качестве сигнальной молекулы вовлекается в адаптивное усиление окислительных процессов, во-вторых, его участие в процессе регуляции количества сперматозоидов путем апоптоза.

Выявленные изменения биохимического спектра спермоплазмы, очевидно, являются отражением альтерации биоэнергетических и анаболических процессов в репродуктивной системе и могут быть одной из причин продемонстрированного ранее снижения оплодотворяющей способности эякулята на фоне хронического поступления ПХБ [15]. Полученные нами данные согласуются также с результатами исследований других авторов, обнаруживших негативное влияние ПХБ на процессы оплодотворения, включая исходы ВРТ [32, 33].