В последнее время внимание многих ученых привлечено к изучению роли фактора, ингибирующего лейкемию (ЛИФ), в процессах развития и имплантации эмбриона. Этот цитокин впервые идентифицирован в 1986 г . Metkalf и соавт. ЛИФ представляет собой высокогликолизированный полипептид с молекулярной массой 45—56 кДа, который кодируется геном, локализованным у человека в хромосоме 22q12 [1, 2, 15].

Этот цитокин оказывает влияние на пролиферацию, дифференцировку и выживание клетки в различных тканях, в том числе и репродуктивного тракта, где он участвует во многих процессах, начиная с роста и развития гамет и заканчивая наступлением и прогрессированием беременности.

Свое действие ЛИФ осуществляет путем связывания с двумя типами рецепторов: 1) ЛИФ-специфический рецептор (ЛИФ-СР), связь с которым обеспечивают многие уникальные функции ЛИФ, 2) мембранный рецептор gp130, который служит рецептором также для родственных цитокинов IL-6, IL-11, онкостатина М и др., чем объясняется частичное дублирование многих эффектов ЛИФ указанными цитокинами [1—6].

Наиболее интересными оказались результаты исследования функции ЛИФ в эндометрии человека, где этот цитокин продуцируется в течение всего менструального цикла [2, 23, 24]. Выявлено, что уровень ЛИФ в функциональном слое эндометрия — низкий в пролиферативную фазу повышается после овуляции, достигает максимума в среднесекреторную фазу и остается относительно высоким почти до конца менструального цикла, снижаясь с началом менструации до базального уровня. Эти данные явились первыми указаниями на вероятную роль цитокина в имплантации у человека [2, 3, 6, 7, 25].

Что касается рецепторов ЛИФ в эндометрии, известно, что в течение нормального менструального цикла секреция растворимой формы gp130 (sgp130) значительно возрастает между 6-м и 13-м днем после овуляции. У пациенток, страдающих бесплодием, отмечается снижение секреции sgp130 в период «окна имплантации» в сравнении с контрольной группой (фертильные женщины) [6, 8].

Прямые доказательства того, что экспрессия ЛИФ в эндометрии является абсолютно необходимым для процесса имплантации, были получены в экспериментах на мышах с использованием генной инженерии. В работах C. Stewart [24] показано, что у самок мышей с инактивированным ЛИФ-геном процесс фертилизации яйцеклеток не нарушен; однако последние оказались не способны к имплантации эмбриона. При переносе бластоцист от указанных самок в матку интактным самкам имплантация происходила нормально, свидетельствуя о значении ЛИФ в материнском эндометрии для успешного внедрения эмбриона в матку. Искусственное введение мышам с дефицитом ЛИФ-гена рекомбинантного ЛИФ восстанавливало процесс имплантации.

В числе первых клинических работ, посвященных роли ЛИФ в женской репродуктивной системе, были работы G. Delage и соавт. [9] и S. Laird и соавт. [10]. Эти исследователи показали присутствие ЛИФ в эндометрии человека, а также в промывных водах матки в период ожидаемой имплантации, причем количество цитокина было достоверно снижено у женщин, страдающих бесплодием. Примечательно, что в этой популяции женщин в период «окна имплантации» также значительно снижена эндометриальная секреция рецептора gp130 [8]. Аналогичные нарушения продукции эндометриального ЛИФ отмечаются у женщин, страдающих многократными выкидышами [11]. Это свидетельствует о том, что дефекты продукции ЛИФ приводят не только к нарушению имплантации бластоцисты, но и к неполноценной инвазии трофобласта, а в конечном итоге — к выкидышам на ранних сроках беременности [8, 11].

Группой исследователей изучена взаимосвязь экспрессии ЛИФ, его рецепторов и таких морфологических маркеров рецептивности эндометрия, как эндометриальные пиноподии, что доказывает непосредственную связь цитокина с процессом имплантации [3, 6, 7, 12].

Значимость цитокина ЛИФ в обеспечении полноценной имплантации также привлекло внимание исследователей, занимающихся поиском нестероидных методов контрацепции. Методы основаны на системном или вагинальном введении агонистов или антагонистов ЛИФ, конкурентно связывающихся с его рецепторами. Эти исследования заложили фундамент в развитии иммунологической контрацепции [13, 14, 16, 19].

Ряд исследований посвящен изучению диагностических и прогностических возможностей определения уровня ЛИФ. Так, показано, что определение уровня ЛИФ в эндометриальных смывах женщин может иметь прогностическое значение для наступления последующей беременности [17]. У женщин, у которых на 26-й день менструального цикла выявлена дисфункция в продукции цитокина, последующий цикл ЭКО оказывался безуспешным [17, 18].

Интерес представляет также поиск неинвазивных методов определения этого цитокина для оценки имплантационных возможностей эндометрия. Показано, что нарушение концентрации ЛИФ в цервикальной слизи характерно для женщин, страдающих бесплодием [6, 20]. В целом работы в этом направлении еще только начинаются, и дальнейшие исследования представляют значительный интерес.

Цель исследования — изучение секреции ЛИФ в ткани эндометрия и цервикальной слизи в период «имплантационного окна» для оценки рецептивности эндометрия у пациенток с неудачными программами ЭКО в анамнезе.

Обследованы 79 пациенток с бесплодием различного генеза (основная группа) и 8 фертильных женщин репродуктивного возраста, составивших группу контроля. В овуляторных циклах у пациенток, включенных в исследование, на 6—8-й день после овуляции брали пробы цервикальной слизи (ЦС) и проводили пайпель-биопсию эндометрия. Овуляция отслеживалась совместно двумя методами: путем ультразвукового мониторинга цикла, а также определением пика концентрации ЛГ в моче.

Пробы ЦС (являющейся продуктом секреции желез эндоцервикса и эндометрия) брали при помощи урогенитального велюр-зонда («Copan», Италия). Концентрацию ЛИФ в ЦС определяли методом иммуноферментного анализа с набором тест-систем фирмы «Bender Medsystems» (cotol. №242, США).

Биопсию эндометрия выполняли под ультразвуковым контролем из области дна матки с помощью аспирационной кюретки Pipelle de Cornier («Laboratoire C.C.D.», Франция). Проводили морфологическое и иммуногистохимическое исследования соскоба. Материалы биоптатов фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 ч. Образцы обработаны по общепринятой стандартной методике и заключены в парафин. Срезы толщиной 5 мкм готовили на роторных микротомах и окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование гистологических препаратов проводилось в световом микроскопе при увеличении от 50 до 400. Проводилось гистологическое датирование эндометрия, оценка процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий в световом микроскопе при увеличении 400 в 5 полях зрения.

Иммуногистохимические реакции проводили на депарафинированных срезах толщиной 4—5 мкм по общепринятым протоколам (DAKO protocols). Для выявления экспрессии ЛИФ использовали первичные антитела (R@D Systems, США, clone: 9824, mouse anti-human antibody). Результаты иммуногистохимической реакции для ЛИФ оценивали полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике: отсутствие иммуноокрашенных клеток (–) — 0 баллов; менее 5% иммуноокрашенных клеток (±) — 0,5 балла; менее 20% иммуноокрашенных клеток (+) — 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток (++) — 4 балла; более 40% окрашенных клеток (+++) — 6 баллов.

В основной группе первичным бесплодием страдали 47 (60%) пациенток, вторичным — 32 (40%), возраст женщин колебался от 24 до 39 лет (в среднем составил 34,1±2,6 года). Продолжительность бесплодия составляла 2—14 лет (в среднем 6,5±3,2 года).

Пациентки основной группы исследования готовились к продолжению лечения бесплодия (обусловленного различными факторами) методом ЭКО. Всем им ранее было проведено от 1 до 3 попыток ЭКО, при этом регистрировались адекватные параметры фолликулогенеза (от 7 до 18 фолликулов преовуляторного размера), оогенеза (получено от 6 до 15 зрелых ооцитов хорошего качества) и эмбриогенеза (число эмбрионов хорошего качества от 5 до 10). Толщина и структура эндометрия по результатам ультразвукового мониторинга в программах ЭКО не отличались от нормы: в преовуляторный период 9±1,9 мм с «трехслойной» структурой, а в день переноса эмбрионов наблюдался эндометрий с характерной гравидарной трансформацией, толщиной — 11±2 мм.

Группу контроля (n=8) составили женщины репродуктивного возраста, имеющие регулярный менструальный цикл и подтвержденную фертильность (хотя бы одну самостоятельную беременность и роды в анамнезе) (рис. 1).

При морфологическом исследовании биоптатов фертильных женщин наблюдали эндометрий ранней и средней стадии фазы секреции. Иммуногистохимическое исследование выявило высокую экспрессию ЛИФ (5—6 баллов) как в эпикальной части покровного эпителия, так и в железах (рис. 2, см. таблицу).

Морфологическое исследование биоптатов пациенток основной группы (n=79) выявило, что у 77 пациентов эндометрий соответствовал ранней и средней стадии фазы секреции, а у 2 пациенток наблюдался эндометрий поздней стадии фазы пролиферации. У 18 женщин выявлены признаки хронического эндометрита (наличие в эндометрии воспалительных инфильтратов, очаговое фиброзирование стромы). Данные пациентки были выделены в отдельную подгруппу, впоследствии им была предписана специфическая терапия. При иммуногистохимическом исследовании экспрессия цитокина ЛИФ в эндометрии не различалась между пациентками с хроническим эндометритом и без него и варьировала от полного отсутствия до высокого уровня (0—6 баллов) (см. рис. 2, см. таблицу).

При иммуногистохимическом окрашивании препаратов слизистого слоя матки выявлено, что в норме ЛИФ вырабатывается в железистом и поверхностном эпителии эндометрия, а также (в меньшей степени) в строме. Эпителиальное содержание ЛИФ меняется в течение цикла со значительным увеличением в среднюю и позднюю секреторную фазы, что сопряжено с максимальным количеством пиноподий.

В целом выявлено снижение экспрессии ЛИФ во всех рассматриваемых гистологических структурах эндометрия в основной группе исследования. Анализ особенностей распределения ЛИФ в клетках функционального слоя эндометрия у пациенток основной группы показал отсутствие тенденции к усилению экспрессии ЛИФ от глубокого гистологического слоя к более поверхностному. В группе фертильных женщин такая тенденция отчетливо прослеживалась. Также отмечено, что у пациенток с хроническим эндометритом экспрессия ЛИФ в значительной степени преобладает в строме эндометрия.

Концентрация ЛИФ в ЦС у пациенток с неудачными попытками ЭКО в анамнезе значительно варьировала (от 0 до 135 пг/мл) и в среднем составила 23±8,6 пг/мл. Повышение этого показателя более 45 пг/мл было связано с воспалительным процессом в эндометрии (см. рис. 3, см. таблицу).

Отмечена корреляция (r=0,68) между уровнем экспрессии ЛИФ в ткани эндометрия и его концентрацией в ЦС в период предполагаемого «имплантационного окна» (рис. 4).

По результатам многочисленных исследований из всех маркеров, вовлеченных в процесс формирования «имплантационного окна», именно ЛИФ выделен как наиболее информативный в оценке имплантационных свойств эндометрия [6, 12, 23]. Однако клиническая интерпретация результатов этих работ пока крайне ограничена.

Настоящее исследование посвящено изучению особенностей имплантационных свойств эндометрия у пациенток с неудачными попытками ЭКО в анамнезе. Была изучена рецептивность эндометрия у 79 женщин, имеющих от 1 до 3 неудачных попыток ЭКО в анамнезе. При этом параметры фолликуло-, оо- и эмбриогенеза были адекватными. Динамика роста и структурной трансформации эндометрия в ходе программ соответствовала адекватной ультразвуковой картине. Более того, у большинства больных (кроме двух) при морфологическом датировании в период предполагаемой максимальной рецептивности эндометрия обнаружен эндометрий ранней и средней стадии фазы секреции, что не отличалось от такового в группе контроля. Все это явилось предпосылкой для более углубленного исследования имплантационных свойств эндометрия у данной группы больных путем оценки секреции ЛИФ в ткани эндометрия и ЦС в период предположительной максимальной рецептивности эндометрия.

И действительно, по результатам проведенного нами исследования, экспрессия цитокина ЛИФ в период «имплантационного окна» у женщин с неудачными попытками ЭКО в анамнезе достоверно снижена по сравнению с группой контроля, что подтвердило высокую диагностическую роль определения экспрессии ЛИФ в эндометрии среднесекреторной фазы. Также была отмечена взаимосвязь экспрессии ЛИФ и эндометриальных пиноподий, в период расцвета которых и определяется максимальная концентрация цитокина, что соответствует данным литературы [3, 7, 12].

Концентрация ЛИФ в ЦС в преимплантационный период в среднем составила 23±8,6 пг/мл. Повышение этого показателя более 45 пг/мл свидетельствует о наличии воспалительных процессов в эндометрии. Этот факт объясняется тем, что ЛИФ является провоспалительным цитокином и его экспрессия резко повышается при наличии местного воспаления.

Отмечена строгая корреляция (r=0,68) между уровнем экспрессии ЛИФ в эндометрии и его концентрацией в ЦС в период предполагаемого «имплантационного окна», что соответствует данным [4, 6].

В настоящее время возможности клиницистов ограничены лишь традиционными методами улучшения рецептивных свойств эндометрия. Многообещающими являются исследования о применении рекомбинантного ЛИФ для улучшения имплантационных свойств эндометрия у женщин с бесплодием. Авторы исследований [21, 22] сделали вывод, что добавление ЛИФ в среды для культивирования эмбрионов мышей in vitro значительно улучшает исходы программ ЭКО, причем не отмечено никакого негативного влияния на морфологию преимплантационных эмбрионов. Однако возможность патогенетической терапии (применение рекомбинантного ЛИФ), направленной на улучшение имплантационных свойств эндометрия, остается пока далекой перспективой [8].

На основании полученных результатов сделаны следующие выводы: концентрация ЛИФ в ЦС коррелирует с экспрессией этого цитокина в эндометрии. В норме концентрация ЛИФ в ЦС в среднем составляет 23±8,6 пг/мл, повышение этого показателя более 45 пг/мл отражает наличие воспалительных процессов в эндометрии. Отмечено, что при хроническом эндометрите уровень экспрессии ЛИФ в строме эндометрия значительно преобладает над его экспрессией в более поверхностных слоях эндометрия. Эти признаки могут быть рекомендованы для использования в диагностике хронического эндометрита. Определение концентрации цитокина ЛИФ в ЦС может считаться неинвазивным методом оценки состояния и имплантационных свойств эндометрия как в циклах подготовки к программе ЭКО, так и в лечебных циклах.