Экспрессия транскрипционных, ростовых факторов и компонентов AKT/m-TOR сигнального пути в ткани папиллярного рака щитовидной железы

Авторы:
  • Л. В. Спирина
    ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», Томск, Россия; ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет», Томск, Россия
  • С. Ю. Чижевская
    ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», Томск, Россия
  • И. В. Кондакова
    ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», Томск, Россия
Журнал: Проблемы эндокринологии. 2018;64(4): 208-215
Просмотрено: 1596 Скачано: 238

На долю рака щитовидной железы приходится 1—1,5% всех онкологических заболеваний. Разработка новых подходов к диагностике и прогнозированию развития этого вида рака является чрезвычайно актуальным в последние десятилетия, что связано с постоянно увеличивающимися темпами прироста заболеваемости. Так, за период с 2004 по 2014 г. прирост заболеваемости населения России раком щитовидной железы составил 18,47%, что позволяет отнести этот рак к самой распространенной злокачественной опухоли эндокринных желез [1].

Развитие злокачественных новообразований щитовидной железы связано с активацией транскрипционных и ростовых факторов. Ключевыми среди них являются транскрипционный фактор NF-κB, играющий основную роль в процессах онкогенеза [2—4], а также ядерный фактор HIF, который способствует образованию ростового фактора VEGF и карбоангидразы IX, определяющих неоангиогенез. Эти события активируют AKT/m-TOR сигнальный каскад и лежат в основе роста и распространения опухоли [5].

Гиперактивация AKT/m-TOR сигнального пути — характерный признак большинства раковых клеток и, по-видимому, играет ключевую роль в механизмах опухолевой трансформации клеток и прогрессии опухолей [6]. К значимым компонентам этого пути относят протеинкиназы AKT, c-Raf, GSK-3, PDK1, а также m-TOR, ее субстраты p70-S64 и E-BP1. Активность данного сигнального каскада регулируется белком-онкосупрессором PTEN.

В опухолях эндокринных органов AKT/m-TOR сигнальный путь изучен менее чем в опухолях другой локализации [7]. Существуют множественные зависимости между уровнями молекулярных маркеров, что отражает интенсивность патологических процессов и может влиять на прогноз заболевания. Однако вклад молекулярных показателей, связанных с активацией транскрипционных, ростовых факторов и компонентов AKT/m-TOR сигнального пути, определяющих особенности папиллярного рака щитовидной железы (ПРЩЖ), практически не исследован.

Цель исследования — сравнение экспрессии транскрипционных факторов NF-κB p65 и p50, HIF-1α, HIF-2α, ростовых факторов VEGF, CAIX и VEGFR2, а также компонентов AKT/m-TOR сигнального пути в ткани ПРЩЖ и в доброкачественных опухолях щитовидной железы.

Материал и методы

Дизайн исследования

Проведено обсервационное одномоментное сплошное контролируемое исследование.

Критерии соответствия

В исследование включали пациентов с верифицированным ПРЩЖ в стадии T1−4N0−2M0 в возрасте от 30 до 70 лет при условии добровольного подписания информированного согласия. В группу контроля включали пациентов с доброкачественными образованиями щитовидной железы сопоставимого возраста при том же условии. Критериями исключения были возраст старше 70 лет, диссеминированный рак щитовидной железы, наличие тяжелой сопутствующей патологии, наличие первично-множественных опухолей других локализаций, отказ пациента от участия в протоколе.

Условия проведения

Исследование проводилось в Научно-исследовательском институте онкологии Томского национального исследовательского медицинского центра РАН.

Описание медицинского вмешательства

Объемы диагностики и лечения больных соответствовали рекомендуемым алгоритмам по диагностике и лечению злокачественных новообразований, утвержденных министерством здравоохранения РФ (2007), и клиническим рекомендациям по диагностике и лечению рака щитовидной железы (2014) [8, 9].

Пациентам с патологией щитовидной железы было проведено оперативное лечение в объеме гемитиреоидэктомии или тиреоидэктомии. На втором этапе лечения при наличии метастазов в лимфатических узлах больные получали терапию радиоактивным йодом. Материалом для исследования явилась опухолевая и гистологически неизмененная ткань щитовидной железы, полученная от больных обеих групп после оперативного вмешательства. Образцы тканей замораживали и хранили при –80 °С.

Основной исход исследования

Определяли экспрессию NF-κB p65 и p50, HIF-1α, HIF-2α, ростовых факторов VEGF, CAIX и VEGFR2, а также компонентов AKT/m-TOR сигнального пути в ткани ПРЩЖ и в доброкачественных опухолях щитовидной железы.

Анализ в подгруппах

В ходе исследования были сформированы две группы:

— в группу, А вошли пациенты с ПРЩЖ в стадии T1−4N0−2M0;

— в группу Б вошли пациенты с доброкачественными новообразованиями щитовидной железы.

Методы регистрации исходов

РНК выделяли с помощью набора RNeasy mini Kit, содержащего ДНКазу I («Qiagen», Германия). На спектрофотометре NanoDrop-2000 («Thermo Scientific», США) оценивали концентрацию и чистоту выделения РНК. Концентрация РНК колебалась от 80 до 250 нг/мкл, А260/А280 = 1.95—2.05; А260/А230 = 1.90—2.31. Целостность РНК оценивалась с помощью капиллярного электрофореза на приборе TapeStation («Agilent Technologies», США) и набора R6K ScreenTape («Agilent Technologies», США). RIN составил 5.6—7.8.

Уровень экспрессии генов оценивали при помощи количественной обратно-транскриптазной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR) с использованием красителя SYBR Green на амплификаторе iCycler («Bio-Rad», США). Для получения кДНК на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью набора m-MuLV-RH («БиоЛабмикс», Россия) со случайными гексануклеотидными праймерами в соответствии с инструкцией. ПЦР ставили в трех репликах в объеме 25 мкл, содержащем 12,5 мкл БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue («БиоЛабмикс», Россия), 300 нM прямого и обратного праймеров и 50 нг кДНК. Двухшаговая программа амплификации включала 1 цикл — 94 °C, 10 мин — предварительная денатурация; 40 циклов — 1 шаг 94 °C, 10 с и 2 шаг 20 с — при 60 °C. Праймеры были подобраны с использованием программы Vector NTI Advance 11.5 и базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/nuccore) (табл. 1).

Таблица 1. Последовательность праймеров проб исследованных генов Примечание. NM — номер последовательности РНК в NCBI Nucleotide Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore); F — прямой праймер; R — обратный праймер.

В качестве референсного гена использовали ген «домашнего хозяйства» фермента GAPDH (glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase), и уровень экспрессии каждого целевого гена нормализовали по отношению к экспрессии GAPDH. Количественный анализ экспрессии проводили по 2ΔΔСt по отношению к конститутивно-экспрессируемому гену GAPDH.

Этическая экспертиза

Проведение данной работы одобрено локальным этическим комитетом НИИ онкологии Томского НИМЦ (протокол № 5 от 24.04.15).

Статистический анализ

Размер выборки предварительно не рассчитывался. Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета программ Statistica 8.0. Результаты определения экспрессии генов представлены как среднее значение ± ошибка среднего. Значимость различий оценивали с помощью критерия Манна—Уитни. Различия считали значимыми при р<0,05. Существование связи между показателями определяли с использованием корреляционного анализа, силу связи между переменными оценивали, рассчитывая коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r).

Результаты

Участники исследования

В группу, А были включены 40 больных (7 мужчин, 33 женщины) с ПРЩЖ в возрасте от 33 до 66 лет (средний возраст 52,0±2,6 года) со стадией опухолевого процесса T1−4N0−2M0. Группа Б представлена 22 больными (4 мужчины, 18 женщин) в возрасте от 38 до 66 лет (средний возраст 53,0±4,4 года) с доброкачественными новообразованиями щитовидной железы. У всех больных диагноз был морфологически верифицирован.

Основные результаты исследования

В табл. 2 представлены

Таблица 2. Экспрессия транскрипционных и ростовых факторов в ткани фолликулярной аденомы и папиллярного рака щитовидной железы (Х±SD) Примечание. * — р<0,05 при сравнении с доброкачественными новообразованиями.
уровни мРНК изучаемых показателей в ткани доброкачественных новообразований и ПРЩЖ. В ткани ПРЩЖ выявлено увеличение экспрессии транскрипционных факторов NF-κB p65 и p50 в 8,7 (p=0,041) и 5,6 раза (p=0,036) соответственно, а также ядерного фактора HIF-2α в 5,3 раза (p=0,042) по сравнению с тканью доброкачественных новообразований.

Экспрессия ростового фактора VEGF, его рецептора VEGFR2 и CAIX в ткани ПРЩЖ не отличалась от таковой в ткани доброкачественных опухолей железы.

На следующем этапе исследования была изучена экспрессия компонентов AKT/m-TOR сигнального пути (AKT, c-Raf, GSK-3β, PDK1 и PTEN) в ткани новообразований щитовидной железы (табл. 3).

Таблица 3. Экспрессия AKT, c-Raf, GSK-3β, PDK1, PTEN, m-TOR и ее субстратов в ткани фолликулярной аденомы и папиллярного рака щитовидной железы (Х±SD) Примечание. * — р<0,05 при сравнении с доброкачественными новообразованиями.
В ткани ПРЩЖ отмечено увеличение уровня мРНК протеинкиназы AKT в 8,6 раза (p=0,041) на фоне компенсаторного роста уровня мРНК PTEN в 8,1 раза (p=0,037). При этом экспрессия гена c-Raf в ткани ПРЩЖ была в 2,1 раза (p=0,048) ниже, чем в ткани доброкачественных опухолей. Однако экспрессия протеинкиназы m-TOR, ее субстратов p70-S6 киназы и 4E-BP1 не отличалась от таковой в ткани доброкачественных опухолей (см. табл. 3).

Корреляционный анализ обнаружил многочисленные связи между изучаемыми молекулярными маркерами в ткани ПРЩЖ (рис. 1).

Рис. 1. Взаимосвязи между транскрипционными и ростовыми факторами при папиллярном раке щитовидной железы. Линиями обозначены прямые связи между молекулярными маркерами.
Выявлена положительная связь между экспрессией NF-κB p65, VEGFR2 (r=0,7; p<0,05), CAIX (r=0,8; p<0,05), HIF-1α (r=0,6; p<0,05) и HIF-2α (r=0,6; p<0,05); между VEGFR2 и VEGF (r=0,5; p<0,05), CAIX (r=0,6; p<0,05) и HIF-1α (r=0,7; p<0,05); а также положительная связь между экспрессией VEGF, CAIX (r=0,6; p<0,05) и HIF-2α (r=0,7; p<0,05) и прямая зависимость между экспрессией HIF-1α, CAIX (r=0,7; p<0,05) и HIF-2α (r=0,6; p<0,05). Эти взаимозависимости между транскрипционными и ростовыми факторами являются основой молекулярных механизмов развития опухоли.

В ткани ПРЩЖ обнаружена прямая зависимость между экспрессией PTEN, c-Raf (r=0,6; p<0,05) и 70-S6 (r=0,8; p<0,05), а также между m-TOR и PDK1 (r=0,7; p<0,05), что указывает на наличие системы регуляции между киназами и их ингибиторами.

Обнаружены ассоциации между экспрессией онкосупрессора PTEN c транскрипционными факторами NF-κB p65 (r=0,76; p<0,05) и NF-κB p50 (r=0,72; p<0,05) (рис. 2, 3),

Рис. 2. График рассеяния между экспрессией PTEN и экспрессией NF-κB p65.
Рис. 3. График рассеяния между экспрессией PTEN и экспрессией NF-κB p50.
характеризующие особенности функционирования сигнальных каскадов. Экспрессия NF-κB p65 коррелировала также с экспрессией PDK1 (r=0,71; p<0,05), а NF-κB p50 — с c-Raf (r=0,76; p<0,05).

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

Экспрессия транскрипционного фактора HIF-1 в ткани ПРЩЖ связана с прогнозом заболевания и определяет исход патологического процесса [10, 11]. В нашем исследовании показано, что к молекулярно-биологическим характеристикам данной опухоли также можно отнести повышение экспрессии HIF-2, NF-κB p65 и NF-κB p50. Эти изменения приводят к модификации экспрессии компонентов AKT/m-TOR сигнального каскада.

Обсуждение основного результата исследования

В ткани ПРЩЖ отмечено повышение экспрессии протеинкиназы AKT — одного из ключевых компонентов AKT/m-TOR сигнального каскада. Это объясняется преобладанием в клетках опухоли анаболических процессов. Имеются сведения, что в ткани рака щитовидной железы увеличивается содержание AKT [12, 13]. Иными словами, рост экспрессии гена AKT сопровождается увеличением количества его белкового продукта.

Негативным регулятором активности AKT/m-TOR сигнального пути является фосфатаза PTEN. Мы отметили рост уровня ее мРНК при ПРЩЖ. Полагают, что развитие и прогрессирование данной патологии происходят на фоне мутационных изменений гена PTEN, что является одной из причин развития раковых синдромов (синдром Cowden) и связано с формированием функционально неполноценного белка. В исследовании S. Beg и соавт. [14] показано снижение содержания PTEN в 24,5% образцов ПРЩЖ, однако при проведении флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) дефект гена PTEN был зафиксирован только в 4,8% образцов.

Мы нашли снижение уровня мРНК c-Raf в ткани ПРЩЖ, что может быть связано с ингибирующим действием киназы AKT. В литературе [15] имеются иные данные об экспрессии протеинкиназы c-Raf в ткани ПРЩЖ. Стоит отметить, что в этой работе связь между экспрессией c-Raf и активностью AKT/m-TOR сигнального каскада не изучалась.

Известно, что ядерный фактор NF-κB может влиять на экспрессию ростового фактора VEGF как непосредственно, так и путем регуляции транскрипции ядерного фактора HIF-1α [16, 17]. Связь между экспрессией HIF-1α и HIF-2α, CAIX, VEGFR2 и между экспрессией HIF-2α и HIF-1α, VEGF также можно объяснить способностью HIF-1α и HIF-2α усиливать транскрипцию генов. Подобные сведения имеются в работах последних лет [18, 19]. Также показана совместная регуляция экспрессии VEGF, его рецептора и CAIX, что является свидетельством эффективной регуляции ангиогенеза.

В ткани ПРЩЖ выявлена связь между экспрессией m-TOR и PDK1, что указывает на роль PDK1 в активации протеинкиназы AKT, субстратом которой является m-TOR [6]. Связь экспрессии фосфатазы PTEN и p70-S6 киназы объясняется, вероятно, регуляцией активности AKT/m-TOR сигнального пути онкосупрессором PTEN [20]. Прямая зависимость между уровнем мРНК c-Raf и экспрессией PTEN показывает, что данная фосфатаза может также влиять на активность MAPK сигнального каскада, который принимает участие в регуляции пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток [10, 11].

Особое значение имеет обнаруженная нами положительная связь между экспрессией ядерных факторов NF-κB p65 и NF-κB p50 c PTEN. В исследованиях K. Vasudevan [21] показано, что активация транскрипционной активности данного ядерного фактора происходит в условиях супрессии PTEN и выраженной активности киназ изучаемого сигнального каскада. К ним относят c-Raf и PDK1. Потеря функциональной активности онкосупрессора PTEN приводит к усилению экспрессии NF-κB за счет активации AKT/m-TOR сигнального каскада [22]. Высокий уровень мРНК фосфатазы PTEN является косвенным доказательством измененной активности данного онкомаркера, что приводит к еще большей активности AKT.

Заключение

В настоящем исследовании установлены важные молекулярно-биологические характеристики ПРЩЖ. К ним относятся высокая экспрессия транскрипционных факторов NF-κB и HIF-2α, протеинкиназы AKT и фосфатазы PTEN, а также низкий уровень мРНК c-Raf. Особенности экспрессии транскрипционных и ростовых факторов, а также компонентов AKT/m-TOR сигнального пути могут влиять на течение заболевания, определяя эффективность лечения. Полученные данные имеют значение как для фундаментальной, так и для клинической онкологии.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа проведена при поддержке ФГБУ Томский национальный медицинский центр РАН.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: Л.В. Спирина — определение экспрессии изучаемых показателей, подготовка статьи к публикации; С.Ю. Чижевская — формирование групп исследования; И.В. Кондакова — координация исследования, общее руководство. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Сведения об авторах

*Спирина Людмила Викторовна — д.м.н. [Liudmila V. Spirina, MD, PhD]; адрес: Россия, 634050, Томск, пер. Кооперативный, д. 5 [address: 5 Kooperativny street, Tomsk, 634050, Russia]; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5269-736X; eLibrary SPIN: 1336-8363; e-mail: spirinalv@oncology.tomsk.ru

Чижевская Светлана Юрьевна — д.м.н. [Sventlana Yu. Chizhevskaya, MD, PhD]; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-2974-4778; eLibrary SPIN: 9561-3382; e-mail: sch@oncology.tomsk.ru

Кондакова Ирина Викторовна — д.м.н., проф. [Irina V. Kondakova, MD, PhD, Professor]; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-0907-4615; eLibrary SPIN: 9338-4149; e-mail: kondakova@oncology.tomsk.ru

Список литературы:

  1. Злокачественные новообразования в России в 2015 г. (заболеваемость и смертность)/ Под ред. Каприна А.Д., Старинского В.В., Петровой Г.В. // М.: МНИОИ им. П.А. Герцена — Филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России; 2017.
  2. Spirina LV, Usynin YA, Kondakova IV, et al. The Akt-MTOR signalling pathway in kidney cancer tissues. Aip Conf Proc. 2015; 1688:080004. doi:10.1063/1.4936067
  3. Спирина Л.В., Усынин Е.А., Кондакова И.В., и др. Влияние таргетной терапии на содержание транскрипционных, ростовых факторов, протеинкиназы TOR и активности внутриклеточных протеиназ у больных диссеминированным раком почки. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2015. — Т. 60. — № 6. — C. 768—772.
  4. Спирина Л.В., Усынин Е.А., Юрмазов З.А., и др. Экспрессия МРНК и содержание Nf-kB, Hif-1, Hif-2, Vegf, Vegfr2 и арбоангидразы Ix при метастазировании рака почки. Молекулярная биология. — 2017. — Т. 51. — № 2. — С. 372—377. doi:10.7868/S0026898417020197
  5. Tanaka TN, Alloju SK, Oh DK, et al. Thyroid cancer: molecular pathogenesis, tyrosine kinase inhibitors, and other new therapies. Am J Hematol Oncol. 2015;11(4):5-9.
  6. Robbins HL, Hague A. The Pi3k/Akt pathway in tumors of endocrine tissues. Front Endocrinol (Lausanne). 2015;6:188. doi:10.3389/Fendo.2015.00188
  7. Dodd KM, Yang J, Shen MH, et al. MTORC1 Drives Hif-1α and Vegf-a signalling via multiple mechanisms involving 4e-Bp1, S6k1 and Stat3. Oncogene. 2015;34(17):2239-2250. doi:10.1038/onc.2014.164
  8. Бельцевич Д.Г., Ванушко В.Э., Мельниченко Г.А., и др. Российские клинические рекомендации по диагностике и лечению дифференцированного рака щитовидной железы у взрослых. Проект. Редакция 2016 г. // Эндокринная Хирургия. — 2015. — Т. 9. — № 3. — С. 7—17. doi:10.14341/Serg201537-14
  9. Клинические рекомендации по диагностике и лечению рака щитовидной железы. / Под ред. Алиевой С.Б., Алымова Ю.В., Мудунова А.М., и др. — М. 2014. Доступно по http://www.Oncology.ru/Association/Clinical-Guidelines/2014/56.Pdf. Ссылка активна на 22.09.14. Dostupno po://www.Oncology.ru/Association/Clinical-Guidelines/2014/56.Pdf. Accessed 22.09.14
  10. Magnon C, Opolon P, Ricard M, et al. Radiation and inhibition of angiogenesis by canstatin synergize to induce HIFα-mediated tumor apoptotic switch. J Clin Invest. 2007;117(7):1844-1855. doi:10.1172/jci30269
  11. Burrows N, Babur M, Resch J, et al. Hypoxia-inducible factor in thyroid carcinoma. J Thyroid Res. 2011;2011:762905. doi:10.4061/2011/762905
  12. Vasko V. Akt activation and localisation correlate with tumour invasion and oncogene expression in thyroid cancer. J Med Genet. 2004;41(3):161-170. doi:10.1136/jmg.2003.015339
  13. Krzeslak A, Pomorski L, Lipinska A. Expression, localization, and phosphorylation of Akt1 in benign and malignant thyroid lesions. Endocr Pathol. 2011;22(4):206-211. doi:10.1007/s12022-011-9177-4
  14. Beg S, Siraj AK, Jehan Z, et al. PTEN loss is associated with follicular variant of middle eastern papillary thyroid carcinoma. Br J Cancer. 2015;112(12):1938-1943. doi:10.1038/bjc.2015.169
  15. Lee J, Jeong S, Park JH, et al. Aberrant expression of cot is related to recurrence of papillary thyroid cancer. Medicine (Baltimore). 2015;94(6):E548. doi:10.1097/Md.0000000000000548
  16. Alverdi V, Hetrick B, Joseph S, Komives EA. Direct observation of a transient ternary complex during kappabalpha-mediated dissociation of Nf-Kappab from DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 2014;111(1):225-230. doi:10.1073/Pnas.1318115111
  17. Potoyan DA, Zheng W, Komives EA, Wolynes PG. Molecular stripping in the Nf-Kappab/Ikappab/DNA genetic regulatory network. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;113(1):110-115. doi:10.1073/Pnas.1520483112
  18. Liu YM, Ying SP, Huang YR, et al. Expression of HIF-1alpha and HIF-2alpha correlates to biological and clinical significance in papillary thyroid carcinoma. World J Surg Oncol. 2016;14(1):30. doi:10.1186/S12957-016-0785-9
  19. LV Y, Sun Y, Shi T, et al. Pigment epithelium-derived factor HAS a role in the progression of papillary thyroid carcinoma by affecting the Hif1alpha-Vegf signaling pathway. Oncol Lett. 2016;12(6):5217-5222. doi:10.3892/Ol.2016.5316
  20. Chalhoub N, Baker SJ. PTEN and the Pi3-kinase pathway in cancer. Annu Rev Pathol. 2009;4:127-150. doi:10.1146/Annurev.Pathol.4.110807.092311
  21. Vasudevan KM, Gurumurthy S, Rangnekar VM. Suppression of PTEN expression by Nf-B prevents apoptosis. Mol Cell Biol. 2004;24(3):1007-1021. doi:10.1128/Mcb.24.3.1007-1021.2004
  22. Koul D, Takada Y, Shen R, et al. PTEN enhances TNF-induced apoptosis through modulation of nuclear factor-Kappab signaling pathway in human glioma cells. Biochem Biophys Res Commun. 2006;350(2):463-471. doi:10.1016/J.Bbrc.2006.09.077