Спирина Л.В.

ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», Томск, Россия; ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет», Томск, Россия

Чижевская С.Ю.

ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», Томск, Россия

Кондакова И.В.

ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», Томск, Россия

Экспрессия транскрипционных, ростовых факторов и компонентов AKT/m-TOR сигнального пути в ткани папиллярного рака щитовидной железы

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2018;64(4): 208-215

Просмотров : 181

Загрузок : 1

Как цитировать

Спирина Л. В., Чижевская С. Ю., Кондакова И. В. Экспрессия транскрипционных, ростовых факторов и компонентов AKT/m-TOR сигнального пути в ткани папиллярного рака щитовидной железы. Проблемы эндокринологии. 2018;64(4):208-215. https://doi.org/10.14341/probl9310

Авторы:

Спирина Л.В.

ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», Томск, Россия; ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет», Томск, Россия

Все авторы (3)

На долю рака щитовидной железы приходится 1—1,5% всех онкологических заболеваний. Разработка новых подходов к диагностике и прогнозированию развития этого вида рака является чрезвычайно актуальным в последние десятилетия, что связано с постоянно увеличивающимися темпами прироста заболеваемости. Так, за период с 2004 по 2014 г. прирост заболеваемости населения России раком щитовидной железы составил 18,47%, что позволяет отнести этот рак к самой распространенной злокачественной опухоли эндокринных желез [1].

Развитие злокачественных новообразований щитовидной железы связано с активацией транскрипционных и ростовых факторов. Ключевыми среди них являются транскрипционный фактор NF-κB, играющий основную роль в процессах онкогенеза [2—4], а также ядерный фактор HIF, который способствует образованию ростового фактора VEGF и карбоангидразы IX, определяющих неоангиогенез. Эти события активируют AKT/m-TOR сигнальный каскад и лежат в основе роста и распространения опухоли [5].

Гиперактивация AKT/m-TOR сигнального пути — характерный признак большинства раковых клеток и, по-видимому, играет ключевую роль в механизмах опухолевой трансформации клеток и прогрессии опухолей [6]. К значимым компонентам этого пути относят протеинкиназы AKT, c-Raf, GSK-3, PDK1, а также m-TOR, ее субстраты p70-S64 и E-BP1. Активность данного сигнального каскада регулируется белком-онкосупрессором PTEN.

В опухолях эндокринных органов AKT/m-TOR сигнальный путь изучен менее чем в опухолях другой локализации [7]. Существуют множественные зависимости между уровнями молекулярных маркеров, что отражает интенсивность патологических процессов и может влиять на прогноз заболевания. Однако вклад молекулярных показателей, связанных с активацией транскрипционных, ростовых факторов и компонентов AKT/m-TOR сигнального пути, определяющих особенности папиллярного рака щитовидной железы (ПРЩЖ), практически не исследован.

Цель исследования — сравнение экспрессии транскрипционных факторов NF-κB p65 и p50, HIF-1α, HIF-2α, ростовых факторов VEGF, CAIX и VEGFR2, а также компонентов AKT/m-TOR сигнального пути в ткани ПРЩЖ и в доброкачественных опухолях щитовидной железы.

Материал и методы

Дизайн исследования

Проведено обсервационное одномоментное сплошное контролируемое исследование.

Критерии соответствия

В исследование включали пациентов с верифицированным ПРЩЖ в стадии T1−4N0−2M0 в возрасте от 30 до 70 лет при условии добровольного подписания информированного согласия. В группу контроля включали пациентов с доброкачественными образованиями щитовидной железы сопоставимого возраста при том же условии. Критериями исключения были возраст старше 70 лет, диссеминированный рак щитовидной железы, наличие тяжелой сопутствующей патологии, наличие первично-множественных опухолей других локализаций, отказ пациента от участия в протоколе.

Условия проведения

Исследование проводилось в Научно-исследовательском институте онкологии Томского национального исследовательского медицинского центра РАН.

Описание медицинского вмешательства

Объемы диагностики и лечения больных соответствовали рекомендуемым алгоритмам по диагностике и лечению злокачественных новообразований, утвержденных министерством здравоохранения РФ (2007), и клиническим рекомендациям по диагностике и лечению рака щитовидной железы (2014) [8, 9].

Пациентам с патологией щитовидной железы было проведено оперативное лечение в объеме гемитиреоидэктомии или тиреоидэктомии. На втором этапе лечения при наличии метастазов в лимфатических узлах больные получали терапию радиоактивным йодом. Материалом для исследования явилась опухолевая и гистологически неизмененная ткань щитовидной железы, полученная от больных обеих групп после оперативного вмешательства. Образцы тканей замораживали и хранили при –80 °С.

Основной исход исследования

Определяли экспрессию NF-κB p65 и p50, HIF-1α, HIF-2α, ростовых факторов VEGF, CAIX и VEGFR2, а также компонентов AKT/m-TOR сигнального пути в ткани ПРЩЖ и в доброкачественных опухолях щитовидной железы.

Анализ в подгруппах

В ходе исследования были сформированы две группы:

— в группу, А вошли пациенты с ПРЩЖ в стадии T1−4N0−2M0;

— в группу Б вошли пациенты с доброкачественными новообразованиями щитовидной железы.

Методы регистрации исходов

РНК выделяли с помощью набора RNeasy mini Kit, содержащего ДНКазу I («Qiagen», Германия). На спектрофотометре NanoDrop-2000 («Thermo Scientific», США) оценивали концентрацию и чистоту выделения РНК. Концентрация РНК колебалась от 80 до 250 нг/мкл, А260/А280 = 1.95—2.05; А260/А230 = 1.90—2.31. Целостность РНК оценивалась с помощью капиллярного электрофореза на приборе TapeStation («Agilent Technologies», США) и набора R6K ScreenTape («Agilent Technologies», США). RIN составил 5.6—7.8.

Уровень экспрессии генов оценивали при помощи количественной обратно-транскриптазной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR) с использованием красителя SYBR Green на амплификаторе iCycler («Bio-Rad», США). Для получения кДНК на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью набора m-MuLV-RH («БиоЛабмикс», Россия) со случайными гексануклеотидными праймерами в соответствии с инструкцией. ПЦР ставили в трех репликах в объеме 25 мкл, содержащем 12,5 мкл БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue («БиоЛабмикс», Россия), 300 нM прямого и обратного праймеров и 50 нг кДНК. Двухшаговая программа амплификации включала 1 цикл — 94 °C, 10 мин — предварительная денатурация; 40 циклов — 1 шаг 94 °C, 10 с и 2 шаг 20 с — при 60 °C. Праймеры были подобраны с использованием программы Vector NTI Advance 11.5 и базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/nuccore) (табл. 1).

Таблица 1. Последовательность праймеров проб исследованных генов Примечание. NM — номер последовательности РНК в NCBI Nucleotide Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore); F — прямой праймер; R — обратный праймер.

В качестве референсного гена использовали ген «домашнего хозяйства» фермента GAPDH (glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase), и уровень экспрессии каждого целевого гена нормализовали по отношению к экспрессии GAPDH. Количественный анализ экспрессии проводили по 2ΔΔСt по отношению к конститутивно-экспрессируемому гену GAPDH.

Этическая экспертиза

Проведение данной работы одобрено локальным этическим комитетом НИИ онкологии Томского НИМЦ (протокол № 5 от 24.04.15).

Статистический анализ

Размер выборки предварительно не рассчитывался. Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета программ Statistica 8.0. Результаты определения экспрессии генов представлены как среднее значение ± ошибка среднего. Значимость различий оценивали с помощью критерия Манна—Уитни. Различия считали значимыми при р<0,05. Существование связи между показателями определяли с использованием корреляционного анализа, силу связи между переменными оценивали, рассчитывая коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r).

Результаты

Участники исследования

В группу, А были включены 40 больных (7 мужчин, 33 женщины) с ПРЩЖ в возрасте от 33 до 66 лет (средний возраст 52,0±2,6 года) со стадией опухолевого процесса T1−4N0−2M0. Группа Б представлена 22 больными (4 мужчины, 18 женщин) в возрасте от 38 до 66 лет (средний возраст 53,0±4,4 года) с доброкачественными новообразованиями щитовидной железы. У всех больных диагноз был морфологически верифицирован.

Основные результаты исследования

В табл. 2 представлены

Таблица 2. Экспрессия транскрипционных и ростовых факторов в ткани фолликулярной аденомы и папиллярного рака щитовидной железы (Х±SD) Примечание. * — р<0,05 при сравнении с доброкачественными новообразованиями.
уровни мРНК изучаемых показателей в ткани доброкачественных новообразований и ПРЩЖ. В ткани ПРЩЖ выявлено увеличение экспрессии транскрипционных факторов NF-κB p65 и p50 в 8,7 (p=0,041) и 5,6 раза (p=0,036) соответственно, а также ядерного фактора HIF-2α в 5,3 раза (p=0,042) по сравнению с тканью доброкачественных новообразований.

Экспрессия ростового фактора VEGF, его рецептора VEGFR2 и CAIX в ткани ПРЩЖ не отличалась от таковой в ткани доброкачественных опухолей железы.

На следующем этапе исследования была изучена экспрессия компонентов AKT/m-TOR сигнального пути (AKT, c-Raf, GSK-3β, PDK1 и PTEN) в ткани новообразований щитовидной железы (табл. 3).

Таблица 3. Экспрессия AKT, c-Raf, GSK-3β, PDK1, PTEN, m-TOR и ее субстратов в ткани фолликулярной аденомы и папиллярного рака щитовидной железы (Х±SD) Примечание. * — р<0,05 при сравнении с доброкачественными новообразованиями.
В ткани ПРЩЖ отмечено увеличение уровня мРНК протеинкиназы AKT в 8,6 раза (p=0,041) на фоне компенсаторного роста уровня мРНК PTEN в 8,1 раза (p=0,037). При этом экспрессия гена c-Raf в ткани ПРЩЖ была в 2,1 раза (p=0,048) ниже, чем в ткани доброкачественных опухолей. Однако экспрессия протеинкиназы m-TOR, ее субстратов p70-S6 киназы и 4E-BP1 не отличалась от таковой в ткани доброкачественных опухолей (см. табл. 3).

Корреляционный анализ обнаружил многочисленные связи между изучаемыми молекулярными маркерами в ткани ПРЩЖ (рис. 1).

Рис. 1. Взаимосвязи между транскрипционными и ростовыми факторами при папиллярном раке щитовидной железы. Линиями обозначены прямые связи между молекулярными маркерами.
Выявлена положительная связь между экспрессией NF-κB p65, VEGFR2 (r=0,7; p<0,05), CAIX (r=0,8; p<0,05), HIF-1α (r=0,6; p<0,05) и HIF-2α (r=0,6; p<0,05); между VEGFR2 и VEGF (r=0,5; p<0,05), CAIX (r=0,6; p<0,05) и HIF-1α (r=0,7; p<0,05); а также положительная связь между экспрессией VEGF, CAIX (r=0,6; p<0,05) и HIF-2α (r=0,7; p<0,05) и прямая зависимость между экспрессией HIF-1α, CAIX (r=0,7; p<0,05) и HIF-2α (r=0,6; p<0,05). Эти взаимозависимости между транскрипционными и ростовыми факторами являются основой молекулярных механизмов развития опухоли.

В ткани ПРЩЖ обнаружена прямая зависимость между экспрессией PTEN, c-Raf (r=0,6; p<0,05) и 70-S6 (r=0,8; p<0,05), а также между m-TOR и PDK1 (r=0,7; p<0,05), что указывает на наличие системы регуляции между киназами и их ингибиторами.

Обнаружены ассоциации между экспрессией онкосупрессора PTEN c транскрипционными факторами NF-κB p65 (r=0,76; p<0,05) и NF-κB p50 (r=0,72; p<0,05) (рис. 2, 3),

Рис. 2. График рассеяния между экспрессией PTEN и экспрессией NF-κB p65.
Рис. 3. График рассеяния между экспрессией PTEN и экспрессией NF-κB p50.
характеризующие особенности функционирования сигнальных каскадов. Экспрессия NF-κB p65 коррелировала также с экспрессией PDK1 (r=0,71; p<0,05), а NF-κB p50 — с c-Raf (r=0,76; p<0,05).

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

Экспрессия транскрипционного фактора HIF-1 в ткани ПРЩЖ связана с прогнозом заболевания и определяет исход патологического процесса [10, 11]. В нашем исследовании показано, что к молекулярно-биологическим характеристикам данной опухоли также можно отнести повышение экспрессии HIF-2, NF-κB p65 и NF-κB p50. Эти изменения приводят к модификации экспрессии компонентов AKT/m-TOR сигнального каскада.

Обсуждение основного результата исследования

В ткани ПРЩЖ отмечено повышение экспрессии протеинкиназы AKT — одного из ключевых компонентов AKT/m-TOR сигнального каскада. Это объясняется преобладанием в клетках опухоли анаболических процессов. Имеются сведения, что в ткани рака щитовидной железы увеличивается содержание AKT [12, 13]. Иными словами, рост экспрессии гена AKT сопровождается увеличением количества его белкового продукта.

Негативным регулятором активности AKT/m-TOR сигнального пути является фосфатаза PTEN. Мы отметили рост уровня ее мРНК при ПРЩЖ. Полагают, что развитие и прогрессирование данной патологии происходят на фоне мутационных изменений гена PTEN, что является одной из причин развития раковых синдромов (синдром Cowden) и связано с формированием функционально неполноценного белка. В исследовании S. Beg и соавт. [14] показано снижение содержания PTEN в 24,5% образцов ПРЩЖ, однако при проведении флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) дефект гена PTEN был зафиксирован только в 4,8% образцов.

Мы нашли снижение уровня мРНК c-Raf в ткани ПРЩЖ, что может быть связано с ингибирующим действием киназы AKT. В литературе [15] имеются иные данные об экспрессии протеинкиназы c-Raf в ткани ПРЩЖ. Стоит отметить, что в этой работе связь между экспрессией c-Raf и активностью AKT/m-TOR сигнального каскада не изучалась.

Известно, что ядерный фактор NF-κB может влиять на экспрессию ростового фактора VEGF как непосредственно, так и путем регуляции транскрипции ядерного фактора HIF-1α [16, 17]. Связь между экспрессией HIF-1α и HIF-2α, CAIX, VEGFR2 и между экспрессией HIF-2α и HIF-1α, VEGF также можно объяснить способностью HIF-1α и HIF-2α усиливать транскрипцию генов. Подобные сведения имеются в работах последних лет [18, 19]. Также показана совместная регуляция экспрессии VEGF, его рецептора и CAIX, что является свидетельством эффективной регуляции ангиогенеза.

В ткани ПРЩЖ выявлена связь между экспрессией m-TOR и PDK1, что указывает на роль PDK1 в активации протеинкиназы AKT, субстратом которой является m-TOR [6]. Связь экспрессии фосфатазы PTEN и p70-S6 киназы объясняется, вероятно, регуляцией активности AKT/m-TOR сигнального пути онкосупрессором PTEN [20]. Прямая зависимость между уровнем мРНК c-Raf и экспрессией PTEN показывает, что данная фосфатаза может также влиять на активность MAPK сигнального каскада, который принимает участие в регуляции пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток [10, 11].

Особое значение имеет обнаруженная нами положительная связь между экспрессией ядерных факторов NF-κB p65 и NF-κB p50 c PTEN. В исследованиях K. Vasudevan [21] показано, что активация транскрипционной активности данного ядерного фактора происходит в условиях супрессии PTEN и выраженной активности киназ изучаемого сигнального каскада. К ним относят c-Raf и PDK1. Потеря функциональной активности онкосупрессора PTEN приводит к усилению экспрессии NF-κB за счет активации AKT/m-TOR сигнального каскада [22]. Высокий уровень мРНК фосфатазы PTEN является косвенным доказательством измененной активности данного онкомаркера, что приводит к еще большей активности AKT.

Заключение

В настоящем исследовании установлены важные молекулярно-биологические характеристики ПРЩЖ. К ним относятся высокая экспрессия транскрипционных факторов NF-κB и HIF-2α, протеинкиназы AKT и фосфатазы PTEN, а также низкий уровень мРНК c-Raf. Особенности экспрессии транскрипционных и ростовых факторов, а также компонентов AKT/m-TOR сигнального пути могут влиять на течение заболевания, определяя эффективность лечения. Полученные данные имеют значение как для фундаментальной, так и для клинической онкологии.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа проведена при поддержке ФГБУ Томский национальный медицинский центр РАН.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: Л.В. Спирина — определение экспрессии изучаемых показателей, подготовка статьи к публикации; С.Ю. Чижевская — формирование групп исследования; И.В. Кондакова — координация исследования, общее руководство. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Сведения об авторах

*Спирина Людмила Викторовна — д.м.н. [Liudmila V. Spirina, MD, PhD]; адрес: Россия, 634050, Томск, пер. Кооперативный, д. 5 [address: 5 Kooperativny street, Tomsk, 634050, Russia]; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5269-736X; eLibrary SPIN: 1336-8363; e-mail: spirinalv@oncology.tomsk.ru

Чижевская Светлана Юрьевна — д.м.н. [Sventlana Yu. Chizhevskaya, MD, PhD]; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-2974-4778; eLibrary SPIN: 9561-3382; e-mail: sch@oncology.tomsk.ru

Кондакова Ирина Викторовна — д.м.н., проф. [Irina V. Kondakova, MD, PhD, Professor]; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-0907-4615; eLibrary SPIN: 9338-4149; e-mail: kondakova@oncology.tomsk.ru

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail