Согласно данным литературы [1], в 30% случаев оперативное вмешательство в хиазмально-селлярной области выполняется по поводу неактивных аденом гипофиза (НАГ). НАГ не сопровождаются биохимическими и клиническими признаками гиперпродукции гормонов, поэтому в основном диагностируются на стадии макроаденом и проявляются симптомами, обусловленными наличием объемного образования в полости «турецкого» седла (неврологические и зрительные нарушения, гипопитуитаризм, гиперпролактинемия и др.) [2]. Согласно данным МРТ, для НАГ характерен экстраселлярный рост; опухолевая ткань часто распространяется более чем в одном направлении. Параселлярный рост с прорастанием в кавернозные синусы свидетельствует об инвазивной природе образования и более неблагоприятном течении заболевания [3, 4].

Иммуноэкспрессия тропных гормонов гипофиза определяется более чем в 50% случаев НАГ, что свидетельствует о скрытом секреторном потенциале этих аденом. В зависимости от реакции с антителами (АТ) к ЛГ/ФСГ, АКТГ, СТГ, ТТГ, ПРЛ выделяют «немые» гонадо-, кортико-, сомато-, тиреотропиномы, пролактиномы и ноль-клеточные опухоли (отсутствии экспрессии) [5]. Для «немых» кортико- и соматотропином характерен более неблагоприятный прогноз и больший риск рецидива, чем для аденом других морфологических типов [6]. В настоящее время активно изучается роль гранинов в качестве иммуногистохимических маркеров НАГ. Гранины относятся к уникальному классу гликопротеинов, регулирующих процессы синтеза пептидных гормонов, их предшественников и нейротрансмиттеров, а также контролирующих механизмы высвобождения гормонов из нейроэндокринных клеток. Учитывая влияние гранинов на синтез и секрецию биологически активных пептидов, в том числе тропных гормонов гипофиза, обсуждается возможность их использования в качестве иммуногистохимических маркеров соответствующих опухолей, позволяющих оценить скрытую функциональную активность последних [7].

Цель — изучение иммуноэкспрессии тропных гормонов гипофиза, хромогранина А, секретогранина II и секретоневрина в ткани НАГ, определение взаимосвязи морфологических, иммуногистохимических и рентгенологических особенностей НАГ.

Протокол исследования одобрен этическим комитетом на базе ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России (протокол № 16 от 24.10.12). Всеми участниками подписано информированное согласие на использование биоматериала в настоящем исследовании.

В исследование включены 50 пациентов с верифицированным диагнозом гормонально-неактивной макроаденомы гипофиза, которым проведена трансназальная аденомэктомия в ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ РФ и ФГБНУ «НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России за период 2012—2014 гг. Соотношение женщин к мужчинам в обследуемой группе составило 1,3:1, медиана возраста пациентов — 52,5±12 лет (от 22 до 77 лет).

Отсутствие гормональной гиперсекреции подтверждено результатами лабораторных анализов, включающих определение уровней ТТГ, св. Т4, пролактина, АКТГ, кортизола, СТГ, ИРФ-1, ЛГ, ФСГ, эстрадиола (у женщин) и тестостерона (у мужчин), ночной подавляющий тест с 1 мг дексаметазона (МДП). Всем пациентам проведено МРТ головного мозга с оценкой размеров и характера распространения опухолевой ткани (супра-, пара-, ретро, инфра- и антеселлярный рост). Объем опухоли (V) рассчитан по формуле:

V = 0,5 × длина (мм) × ширина (мм) × высота (мм).

Критерием включения в исследование было наличие показаний к оперативному вмешательству по поводу основного заболевания. Таким образом, все опухоли являлись макроаденомами с диаметром 1 см и более характеризовались экстраселлярным ростом. Аденомы разделены на макроаденомы (более 1 см в диаметре) и гигантские опухоли (более 4 см в диаметре) [8]. Для оценки инвазивного роста аденом использована классификация J. Hardy [9]. В нашем исследовании к неинвазивным опухолям относились образования Grade I и Grade II A, к инвазивным — Grade III—IV (А—Е).

Для морфологического исследования фрагменты удаленной ткани фиксировали в течение 4 ч в 10% забуференном нейтральном формалине при 56 ° С, после чего материал промывали в проточной воде в течение 5 мин. Проводилась автоматизированная гистологическая проводка (Leica TP1020); образцы заливали в парафин и готовили срезы толщиной 3—5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Срезы исследовали при увеличениях ×40, ×100, ×200, ×400 с использованием светового микроскопа (Zeiss Axio Scope A1, Германия). Анализировали особенности гистологического строения опухоли: ее структуру (трабекулярная, солидная, смешанная), наличие очагов некроза, выраженность полиморфизма ядер и уровень митотической активности.

Для автоматизированного иммуногистохимического исследования использовали иммуностейнер Dako Autostainer Link 48 с применением первичных антител (n=47). Оценивали экспрессию ЛГ, ФСГ, ТТГ, пролактина, АКТГ, СТГ, ki-67, хромогранина, А (ХгA), секретогранина II (СгII) и секретоневрина (Сн). Микрофото выполнены на сканирующем аппаратном комплексе Aperio AT2 («Leica Biosystems», США). Реакции с АТ к тропным гормонам гипофиза оценивали полуколичественно по 4 степеням: 0 — нет окрашенных клеток; I (слабая реакция) — окрашено до 10% клеток; II (умеренная реакция) — окрашено более 10%, но менее 50% клеток; III (выраженная реакция) — окрашено более 50% клеток.

Использовали следующие первичные АТ: моноклональные АТ к ТТГ (1:50, Dako, M3503, Дания), ФСГ (1:50, Dako, M3504, Дания), ЛГ (1:50, Dako, M3502, Дания), Ki-67 (ready to use, Dako, IR626, Дания), поликлональные АТ к СТГ (1:400, Dako, A0570, Дания), АКТГ (1:75, Dako, Дания), моноклональные АТ к ХгА (ready to use, Dako, SK200, Дания), поликлональные АТ к СгII (1:600, Abcam, ab126935, Великобритания), поликлональные АТ к Сн (1:1000, SantaCruz Pharm, США).

Статистическая обработка полученных результатов проведена с помощью программ Microsoft Office Excel 2003, Statistica for Windows, v.6.0 («StatSoft Inc.», США) и SPSS Statistics, v.17.0 («SPSS Inc.», США).

По результатам МРТ среди НАГ в 16 случаях визуализировались гигантские аденомы диаметром более 4 см. Средний объем образований составил 16282 мм³, мин. — 2295 мм³, макс. — 79350 мм³. Супраселлярный рост опухоли с компрессией перекреста зрительного нерва наблюдался в 49 (98%) случаях, параселлярный с инвазией в кавернозные синусы — у 20 пациентов [40%, S (34%) > D (26%)]; инфраселлярный — у 13 (26%), ретроселлярный — у 6 (12%), антеселлярный определен — у 1 (2%) пациента. Распространение опухолевой ткани более чем в двух направлениях наблюдалось у 22 (44%) пациентов. По классификации J. Hardy, инвазивные аденомы, характеризовавшиеся местно-деструирующим инвазивным ростом, определялись в 28 (56%) случаях. Ни в одном из наблюдений метастазы не выявлены (Grade V).

Очаги некроза со следами кровоизлияния и прилежащими к нему участками фиброза выявлены в 6 (12%) случаях. Ангиоматоз стромы в опухолевой ткани наблюдался у 5 (10%) больных. Митозы обнаружены в 11 (22%) наблюдениях, полиморфизм ядер — в 10 (20%).

При иммуногистохимическом исследовании в 74,5% случаев НАГ эскпрессировали один или несколько тропных гормонов гипофиза (см. таблицу). Преобладали «немые» гонадотропиномы с положительной иммунной реакцией на ЛГ и/или ФСГ 24 (51,1%) случая. Плюригормональные опухоли с экспрессией двух и более тропных гормонов гипофиза (за исключением сочетанной реакции на ЛГ и ФСГ) обнаружены в 7 (14,9%) наблюдениях. Положительная иммунная реакция с АТ к АКТГ выявлена в 6 случаях, из них в 4 — в сочетании с экспрессией других гормонов (ПРЛ, СТГ, ФСГ). Изолированная позитивная иммунная реакция на СТГ определялась в 2 случаях, еще в 2 — совместно с ЛГ и ПРЛ, в 1 — с АКТГ. В 25,5% случаев имели место гормон-негативные аденомы.

Для оценки пролиферативного потенциала НАГ исследована иммуноэкспрессия ki-67. По классификации ВОЗ [10], разработанной для опухолей эндокринной системы, индекс пролиферации Ki-67 >3% свидетельствует об инвазивном росте аденомы и более агрессивном течении заболевания. В нашем исследовании медиана ki-67 составила 2% (мин. — 0,5%, макс. — 7%). Мы не выявили зависимости показателя Ki-67 от пола, возраста больных, размера опухоли и положительной реакции с АТ к тропным гормонам гипофиза. При сравнении ki-67 в группах инвазивных и неинвазивных аденом, статистически значимой разницы получено не было (p>0,05). Однако медиана уровня ki-67 в случае инвазивных опухолей была несколько выше, чем при неинвазивных опухолях (1,75 и 1% соответственно).

При иммуногистохимическом анализе удаленной ткани НАГ определена выраженная иммуноэкспрессия гранинов (рис. 1). Экспрессия ХгА выявлена в 39 (83%) наблюдениях, чаще в случае «немых» гонадотропином (в 23 из 24) и в гормон-негативных опухолях (в 10 из 12) с преобладанием II и III степени окрашивания. Положительная реакция с АТ к СгII выявлена в 44 (93,6%) наблюдениях; во всех случаях «немых» гонадо-, кортико- и соматотропином преобладала III степень окрашивания. Экспрессия СгII отсутствовала в 3 гормон-негативных опухолях. Положительная реакция с АТ к Сн наблюдалась в 40 (85,1%) случаях. Отсутствие иммунной реакции отмечено в 4 из 12 случаев гормон-негативных аденом, в 1 из 24 случаев «немых» гонадотропином, в 1 из 6 — «немых» кортикотропином, в 1 из 4 «немых» соматотропином. Мы не выявили корреляций между экспрессией гранинов и морфологическими типами НАГ. Тем не менее имела место тенденция к усилению иммунной реакции на гранины среди «немых» гонадотропином с преобладанием III степени окрашивания.

При сопоставлении рентгенологических и иммуногистохимических данных выявлены отрицательные корреляционные связи между размером опухоли и экспрессией гормонов гипофиза в ткани НАГ. При окрашивании на ЛГ и АКТГ развитие гигантской макроаденомы маловероятно; коэффициенты корреляции составили r=–0,365 (p=0,014) и r=–0,355 (p=0,014) соответственно. Также нами обнаружена обратная связь между супраселлярным распространением опухолевой ткани и иммунореактивностью ПРЛ — r=–0,354 (p=0,009).

При сравнении инвазивных (56%) и неинвазивных (44%) аденом, значимой разницы в иммуноэкспрессии тропных гормонов гипофиза выявлено не было. Тем не менее инвазивный рост опухоли выявлялся в 5 из 6 «немых» кортикотропином, что может указывать на более агрессивное поведение данного типа опухоли.

Статистически значимых корреляций между иммуноэкспрессией СгII и Cн в ткани, с одной стороны, и размерами и распространением аденомы, с другой, не выявлено. При оценке чувствительности и специфичности позитивной реакции с АТ к ХгА в рамках ROC-анализа определена прогностическая значимость данного фактора в отношении инвазивного роста опухолевой ткани. Чем выше иммуноэкспрессия ХгА в ткани, тем больше вероятность инвазии в окружающие структуры (чувствительность — 80%, специфичность — 72%, диагностическая точность — 76,6%); площадь под кривой (AUC) =0,705 (рис. 2).

Положительная реакция на один или несколько гормонов гипофиза отмечена в 74,5% случаев. Наши результаты подтверждают данные F. Golkowski и соавт. [11], согласно которым в 34 (62,9%) из 54 аденом гипофиза позитивное иммуногистохимическое окрашивание ткани не сопровождалось повышением уровня соответствующих гормонов в плазме крови [11]. В нашем исследовании преобладали «немые» гонадотропиномы и гормон-негативные опухоли, что соответствует данным литературы [12]. Для этих морфологических типов НАГ характерно более благоприятное течение и меньший риск рецидива после оперативного лечения [13].

Иммуноэкспрессия АКТГ выявлена в 6 (12,8%) случаях. Она с равной частотой определялась у мужчин и женщин. Четыре из 6 «немых» кортикотропином были представлены гигантскими аденомами; при этом средний индекс пролиферации составил 1,75%, что сопоставимо с показателями в НАГ других гистологических типов. Параселлярный рост опухоли с инвазией в кавернозные синусы отмечен в половине наблюдений. По данным литературы [14, 15], для «немых» кортикотропином с экспрессией АКТГ характерно более агрессивное течение; они чаще встречаются у женщин. «Немые» кортикотропиномы чаще, чем другие типы НАГ инвазируют кавернозные синусы. Это, возможно, лежит в основе увеличения частоты рецидивов таких опухолей в более короткие сроки после операции. Индекс пролиферации ki-67 в большинстве «немых» кортикотропином остается низким (менее 5%), и не может использоваться в качестве предиктора рецидива после хирургического лечения [16].

Положительная реакция с АТ к СТГ отмечалась в 5 (10,6%) случаях, в основном, в сочетании с окрашиванием на другие тропные гормоны гипофиза, что подтверждает данные литературы [17]. Гигантские размеры опухоли определялись в 1 из 5 случаев, параселлярное распространение — в 3. По многим данным, «немые» соматотропиномы чаще диагностируются у пациентов молодого возраста и характеризуются инвазивным ростом и высоким индексом ki-67, что обусловливает большую частоту рецидивов в послеоперационном периоде [13, 17]. В нашем исследовании медиана возраста пациентов с «немыми» соматотропиномами составляла 51,8 года. Мы не выявили значимого повышения уровня индекса пролиферации по сравнению с НАГ других типов; средний показатель ki-67 равнялся 1,5%.

Корреляций между индексом пролиферации, размером аденомы и направлением ее роста, в том числе при инвазии кавернозных синусов, выявлено не было. Значимые различия показателей ki-67 при НАГ разных гистологическиих типов также отсутствовали. В работе G. Chaсko и соавт. [4] показано, что гигантские аденомы диаметром более 4 см с деформацией полости III желудочка имеют более высокий пролиферативный потенциал и чаще представляют собой «немые» гонадотропиномы. Однако мы получили противоположные результаты, выявив обратную корреляцию между гигантскими аденомами и экспрессией ki-67. H. Madsen и соавт. [18], применив экспрессионные микрочипы, сравнили 5 гигантских инвазивных гонадотропином и 7 гонадотропином диаметром менее 4 см (без инвазии кавернозных синусов); корреляций между индексом пролиферации и агрессивным ростом не было.

Мы выявили высокую иммуноэкспрессию различных гранинов в удаленной ткани НАГ. Реакция с АТ к ХгА, СгII и Cн наблюдалась в 83, 93,6 и 85,1% случаев соответственно. Полученные данные подтверждают способность НАГ к синтезу биологически активных пептидов, Эти гранины могут служить иммуногистохимическими маркерами такой способности. Данных об экспрессии различных гранинов в ткани НАГ в литературе недостаточно. Наиболее изученным иммуногистохимическим маркером является ХгА. M. Pawlikowski и соавт. [19] продемонстрировали экспрессию ХгА в 70,7% случаев НАГ, при этом в 100% гонадотропином и ноль-клеточных аденом. СгII и Сн влияют на синтез и секрецию гликопротеиновых гормонов, в особенности ЛГ. В исследованиях на золотых рыбках E. Zhao и соавт. [20]. показали, что гонадолиберин повышает экспрессию СгII и Сн. Повышение уровня Сн приводило к активации гонадотрофов и увеличению синтеза и секреции Л.Г. Схожие результаты получены и на мышиных моделях [21]. В нашем исследовании значимой корреляции между экспрессией гранинов и ЛГ/ФСГ получено не было. Однако отмечена тенденция к более выраженной экспрессии CгII и Сн в «немых» гонадотропиномах. В этих опухолях позитивная реакция на СгII и Сн наблюдалась в большинстве случаев с преобладанием II и III степени окрашивания. Возможно, для обнаружения связи между гранинами и гликопротеиновыми гормонами необходимы исследования на больших выборках.

Таким образом, НАГ обладают скрытым секреторным потенциалом, несмотря на отсутствие биохимических признаков гормональной гиперсекреции. Высокая экспрессия гранинов в удаленной ткани указывает на способность клеток к синтезу биологически активных пептидов, даже в случае гормон-негативных опухолей. Вопрос о взаимосвязи между экспрессией тропных гормонов гипофиза, пролиферативным потенциалом и инвазивным ростом опухоли остается открытым. Необходимы дальнейшие рандомизированные исследования с участием большего числа пациентов, направленные на изучение иммуногистохимических и рентгенологических особенностей НАГ.

1. По данным иммуногистохимического анализа, большинство НАГ (74,5% случаев) способны секретировать один или более тропных гормонов гипофиза. Наиболее часто отмечалась положительная реакция с АТ к ЛГ/ФСГ (51,1%), экспрессия АКТГ и СТГ наблюдалась в 14,8 и 10,6% случаев. Отсутствие экспрессии тропных гормонов отмечено в 25,5% случаев.

2. Для НАГ характерна высокая экспрессия хромогранина, А (83%), секретогранина II (93,6%) и секретоневрина (85,1%). Иммуноэкспрессия хромогранина A является неблагоприятным прогностическим фактором в отношении инвазивного роста опухоли.

3. НАГ характеризуются умеренной пролиферативной активностью (медиана ki-67 — 2%), не имеющей значимых различий в инвазивных и неинвазивных аденомах.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.К. Липатенкова, Л.К. Дзеранова, Е.А. Пигарова.

Сбор и обработка материала — А.К. Липатенкова, Л.И. Астафьева, Л.В. Шишкина, А.П. Эктова.

Статистическая обработка данных — А.К. Липатенкова.

Редактирование — Л.К. Дзеранова, Е.А. Пигарова, Н.С. Далантаева.

Исследование выполнено в рамках государственного задания ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России.