Из всех ассоциированных с сахарным диабетом 1-го типа (СД1) генов и генетических локусов полиморфизм в промоторной области гена инсулина (5`VNTR INS) сообщает наибольший риск развития заболевания (OR~2,5) после локуса HLA класса II [1, 2]. Впервые ассоциация локуса INS с СД1 была показана в 1984 г. [3]. 5`VNTR INS представляет собой разное число повторов (variable number of tandem repeat) 14 нуклеотидной последовательности - 5`-ACAGGGGTGTGGGG-3`[4]. От 26 до 63 повторов последовательности соответствуют аллелям I класса 5`VNTR INS, от 140 до 210 повторов последовательности соответствуют аллелям III класса, аллели II класса (около 80 повторов) у европеоидов и ориентов (представители азиатских популяций) встречаются редко [5].

Аллели класса I и аллели класса III ассоциированы с разной функциональной активностью промоторной области гена INS. Ген INS транскрибируется (синтез РНК на матрице ДНК) не только в клетках поджелудочной железы, но и в тимусе, и уровень транскрипции коррелирует с аллелями VNTR INS. Показано, что СД1-протективный аллель III класса ассоциирован с 2-3-кратным повышением уровня мРНК INS в тимусе по сравнению с СД1 предрасполагающим аллелем I класса [6-8]. При нарушении экспрессии инсулина в тимусе ускоряется развитие сахарного диабета [9]. Недостаточность центральной толерантности может быть следствием спасения инсулинреактивных Т-клеток в отсутствие негативной селекции [10] и/или нарушения позитивной селекции инсулин-реактивных регуляторных Т-клеток (Tregs) [11]. Носительство аллеля III класса VNTR INS может приводить к более эффективной индукции центральной аутотолерантности к инсулину и снижению риска возникновения СД1 [12].

В подавляющем большинстве работ для типирования аллелей 5`VNTR INS использовался суррогатный маркер –23HphI гена INS (rs689). Аллели 5`VNTR INS и –23HphI гена INS находятся в почти полном неравновесии по сцеплению (99,6%) в европеоидных и азиатских популяциях [13]. Аллель А rs689 сцеплен с аллелями I класса 5`VNTR INS, аллель Т - с аллелями III класса 5`VNTR INS. Выявлены межпопуляционные отличия диабетогенности и частоты аллеля А rs689 [1, 13-17] (табл. 1).

В масштабах РФ, где проживают более 100 народов, популяционная стратификация при исследовании клинико-генетических ассоциаций является необходимым условием достижения релевантных результатов [18].

Цель настоящей работы - исследование ассоциации диморфизма –23HphI гена INS (rs689) с СД1 в нескольких популяциях РФ и межпопуляционное сравнение частот аллелей указанного диморфизма.

Методом случай-контроль ассоциация исследовалась в 5 популяциях РФ: русской, башкирской, удмуртской, якутской и бурятской. Исследованы образцы ДНК в общей сложности 528 пациентов с СД1 и 439 контрольных групп. Из них 403 человека русской национальности (298 больных СД1 и 105 здоровых, проживающих в Москве и области), 130 человек башкирской национальности (50 больных СД1 и 80 здоровых, проживающих в Башкирии), 140 удмуртской (32 больных СД1 и 108 здоровых, проживающих в Удмуртской Республике), 159 якутской (74 больных СД1 и 85 здоровых, проживающих в Якутии), 135 бурятской (74 больных СД1 и 61 здоровый, проживающих в Бурятской Республике). Контрольные группы представлены практически здоровыми лицами без аутоиммунных заболеваний и отягощенной наследственности по ним. Родственники из анализа исключались. Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови фенольно-хлороформной экстракцией после обработки протеиназой К. Типирование полиморфизма rs689 проводили с помощью RFLP-PCR [19]. Степень ассоциации признака с заболеванием определялась величиной показателя отношения шансов (OR-odd`s ratio) [20]. Приведены 95% доверительные интервалы для OR (95% CI-confidence intervals). Точный двусторонний тест Фишера или &khgr;²-тест с поправкой Йетса на непрерывность использовали для оценки достоверности различий (р) в распределении частот признака. Значимыми считали различия с р<0,05. Расчеты выполняли при помощи компьютерных программ StatSoft Inc. (2001). Statistica (data analysis software system), version 6.www.statsoft.com; Microsoft Office Excel-2003.

Выбор популяционных групп обусловлен в первую очередь тем, что они принадлежат к наиболее многочисленным языковым группам РФ, проживают в различных географических зонах, антропологически и генетически различны, характеризуются различным уровнем заболеваемости СД1 (табл. 2).

Анализ показал статистически значимую ассоциацию аллеля А и генотипа АА rs689 в 4 из 5 исследованных популяциях - русской, удмуртской, башкирской и якутской. Разница частот аллеля А в группах сравнения для русской популяции составляет 12% (OR=2,2, 95% CI =1,5-3,2; p=5,×10^–5), для удмуртской - 13% (OR=2,4, 95% CI =1,1-5,2; p=0,01), для башкирской - 23% (OR=5,1, 95% CI =2,3-11,3; p=5,7×10^–7), для якутской - 17% (OR=2,9, 95% CI =1,6-5,2; p=0,0001) (см. табл. 2).

Протективным маркером в этих популяциях является аллель Т и генотип Т+. Разница частот аллеля Т в группах сравнения для русской популяции составляет 12% (OR=0,46, 95% CI =0,3-0,7; p=5,0×10^–5), для удмуртской - 13% (OR=0,4, 95% CI =0,19-0,95; p=0,01), для башкирской - 23% (OR=0,2, 95% CI =0,09-0,44; p=5,7×10^–7), для якутской - 17% (OR=0,34, 95% CI =0,19-0,6; p=0,0001). Разница частот генотипа Т+ в группах сравнения для русской популяции составляет 19% (OR=0,43, 95% CI =0,3-0,7; p=0,0002), для удмуртской - 28% (OR=0,27, 95% CI =0,1-0,7; p=0,04), для башкирской - 38% (OR=0,16, 95% CI =0,07-0,4; p=7,2×10^–6), для якутской - 32% (OR=0,24, 95% CI =0,1-0,5; p=2,1×10^–5) (см. табл. 2).

В бурятской популяции, отличающейся наименьшей заболеваемостью СД1, ассоциации не выявлено. Разница частот любого из исследованных признаков не превышает 7% (p>0,05). Бурятская популяция статистически значимо отличается от других популяций, исследованных в настоящей работе, наибольшей частотой аллеля А rs689 (87% vs. 69-75%, р å [0,0002-0,004] и генотипа АА rs689 (77% vs. 45-60%, р å [0,00006-0,01]) (табл. 3).

В японской популяции ассоциация этого локуса с СД1 выявляется при введении дополнительных условий. Например, при стратификации аллелей класса I на субряды диабетогенными являются аллели класса I с количеством повторов не больше 38 [25]. Или при определении аллелей наряду с 5`VNTR INS 10 SNP этого локуса: диабетогенными являются 3 из 6 возможных гаплотипов [13].

Исследования последних лет показывают, что диабетогенность локуса VNTR INS связана и с эпигенетическими факторами, включая метилирование ДНК и модификацию гистонов. Уровень и характер метилирования промоторной области гена INS коррелируют с уровнем экспрессии мРНК в β-клетках, ассоциирован с rs689 и VNTR INS и с СД1 [26-28]. Выявлены существенные различия в структуре метилирования INS у СД1-дискордантных монозиготных близнецов [29]. Накапливаются данные о роли стресса эндоплазматического ретикулума в аутоиммунной деструкции β-клеток [30, 31], о роли транс-действующих факторов на трансляционную специфику и активность β-клеток в ответ на внешний стимул [32].

Различные механизмы установления/срыва толерантности могут превалировать в разных популяциях. Популяционно специфическая генетическая архитектоника СД1 подтверждается работами, опубликованными ранее. Специфичны и спектр, и распределение частот диабетогеннных аллелей, и степень их ассоциации с СД1 [33-36].

Полученные в отношении различных этнических групп данные являются предварительными, учитывая недостаточно большой объем выборок. Однако обнаруженные тенденции соответствуют данным подобных исследований в других популяциях. Одномоментное получение биологического материала от достаточного количества представителей различных этносов затруднено в связи с наличием большого количества смешанных браков и низкой заболеваемостью СД1 в большинстве исследуемых популяций. В то же время учет популяционных особенностей клинико-генетических ассоциаций - необходимое условие достижения релевантных результатов в развитии персонализированной медицины.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования - В.А. Петеркова, И.И. Дедов

Сбор материала - Т.П. Бардымова, Г.И. Данилова, Т.В. Коваленко, Ю.И. Сунцов

Обработка материала - С.М. Степанова, Н.Б. Смирнова, Я.С. Зверева, О.Н. Иванова

Статистическая обработка данных - О.Н. Иванова

Написание текста - О.Н. Иванова

Редактирование - Т.Л. Кураева, В.А. Петеркова

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.