Cахарный диабет 1-го типа (СД1) — широко распространенное, тяжелое заболевание, приводящее к ранней инвалидности и преждевременной смерти [1]. При СД1 происходит аутоиммунное разрушение b-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы, что приводит к полной зависимости больных от экзогенного инсулина, который необходим для регуляции уровня глюкозы в крови. Постоянное введение препаратов экзогенного инсулина продлевает жизнь, но не предотвращает развитие поздних осложнений, которые являются основной причиной ранней смертности больных. В целом средняя продолжительность жизни у заболевших СД1 в детстве на 20 лет меньше средней продолжительности жизни в общей популяции [1].

Развитие СД1 более чем наполовину связано с генетическими факторами. Актуальность изучения молекулярной генетики СД1 обусловлена главным образом возможностью идентификации генов, предрасполагающих к СД1, что существенно для понимания того, какие именно механизмы определяют этот процесс [2].

Ассоциация хромосомной области 2q33 с СД1 впервые была установлена в 1996 г. [3] при анализе сцепления с СД1 группы полиморфных маркеров, расположенных около генов CTLA4 и CD28. Эти гены рассматривались в качестве кандидатов, так как, во-первых, структурная организация данной области генома человека подобна области хромосомы 1 мыши, содержащей локус idd5, который вовлечен в развитие СД у мышей линии NOD. Во-вторых, гены CTLA4 и CD28 кодируют поверхностные рецепторы Т-клеток и играют важную роль в пролиферации этих клеток.

Как известно, активация Т-клетки происходит после связывания с ней комплекса антигена с молекулой HLA вследствие последовательного фосфорилирования гидроксигрупп остатков тирозина нескольких белковых факторов, обеспечивающих передачу сигнала в ядро клетки [4, 5]. Внутриклеточная часть белка CTLA-4 обладает фосфатазной активностью, и CTLA-4, дефосфорилируя соответствующие белковые факторы, понижает эффективность передачи такого сигнала [6], играя таким образом важную роль в формировании «разумного» иммунного ответа.

Ассоциация гена CTLA4 с СД1 установлена с точностью до блока неравновесия по сцеплению, содержащего весь ген. Кроме того, разные уровни ассоциации были обнаружены в случае полиморфного микросателлита (АТ)n, расположенного в 3`-некодирующей области гена, а также в случае однонуклеотидных полиморфных маркеров A49G и C(–318)T.

Расположенному в экзоне 1 полиморфизму A49G соответствует аминокислотный полиморфизм аланин/треонин в сигнальном пептиде молекулы CTLA-4 [7, 8]. Исследования in vitro показали, что у носителей аллеля Ala имеет место пониженный уровень гликозилирования молекулы CTLA-4 в эндоплазматическом ретикулуме, что в свою очередь приводит к снижению содержания молекул CTLA-4 на поверхности клеток [9].

Аллель T полиморфного маркера C(–318)T ассоциирован с более высокой активностью промотора и, следовательно, с повышенным уровнем экспрессии гена CLTA4 [8, 10], что приводит к снижению уровня активации Т-клеток. Таким образом, носительство аллеля T понижает риск развития аутоиммунных заболеваний.

Полный геномный анализ позволил обнаружить еще один маркер гена CTLA4 [11], ассоциированный с рядом аутоиммунных заболеваний (rs3087243—G6230А), в наибольшей степени с тиреоидитом. В недавнем исследовании, проведенном на японской популяции, утверждалось, что полиморфный маркер rs3087243 ассоциирован исключительно с аутоиммунным тиреоидитом, при этом аллель G не имеет прямого влияния на предрасположенность к СД1 [12]. Позднее в трех других исследованиях было доказано, что данный полиморфный маркер ассоциирован с совместным развитием СД1 и аутоиммунного тиреоидита [13—15]. Таким образом, роль полиморфизма rs3087243 в целом пока еще неясна и к тому же до сих пор не исследовалась у больных СД1 русского происхождения.

Ранее у больных русского происхождения с использованием семей с конкордантными и дисконкордантными сибсами были обнаружены сцепление и ассоциация с СД1 полиморфного микросателлита (АТ)n, расположенного в 3`-некодирующей области гена, и полиморфного маркера A49G [16].

Цель настоящей работы — изучение ассоциации полиморфного маркера rs3087243 (G6230А) гена CTLA4 с СД1 методом «случай—контроль» на больших группах больных СД1 и здоровых лиц русского происхождения.

В работе использовали образцы крови больных СД1 (257 человек) и здоровых лиц (526 человек) русского происхождения, любезно предоставленные сотрудниками ЭНЦ. Использовали термостабильную ДНК-полимеразу Taq производства ЗАО «Диалат» (Москва). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы ЗАО «Евроген» (Москва). Флюоресцентные зонды синтезированы ООО «ДНК-Синтез» (Москва). Геномную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством экстракции фенолом-хлороформом после инкубации образцов крови с протеиназой К в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия [17].

Амплификацию полиморфного участка гена проводили с помощью полимеразной цепной реакции «в реальном времени» на термоциклере ABI 7500 Fast («Applied Biosystems») в 10 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01% Твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 300 нМ праймеров, 150 нМ зондов,1,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, 50—100 нг геномной ДНК. Условия амплификации фрагмента ДНК: 95 °C/2 мин — 1-й цикл; 94 °C/10 с, 56 °C/60 — 40 циклов для полиморфного маркера rs3087243 гена CTLA4. Размер продукта амплификации 102 п.н. Анализ продуктов амплификации проводился методом детекции «по конечной точке» с помощью встроенных средств программного обеспечения версии SDS 1.4.

Статистический анализ распределения частот и генотипов проводили с использованием таблиц сопряженности и критерия χ². Достоверными считали различия при p<0,05. Для описания относительного риска развития заболевания рассчитывали отношение шансов (OR). Вычисления производили с помощью программы «Калькулятор для расчета статистики в исследованиях «случай—контроль» [18].

В нашем исследовании аллель G полиморфного маркера G6230А гена CTLA4 был преобладающим в группах больных и здоровых лиц. Однако частота аллеля А у здоровых лиц существенно превышала частоту аллеля А в группе больных (см. таблицу).

Генотип АА встречался реже в группе больных СД1, чем в контрольной группе (11,3 и 22,1% соответственно), а частота генотипа GG была выше у больных СД1 (44,7 и 37,5% соответственно). Можно сделать вывод, что носители аллеля G и генотипа GG имеют повышенный риск развития СД1, тогда как носители аллеля А и генотипа АА — пониженный риск развития этого заболевания.

Полученные результаты показывают, что полиморфный маркер rs3087243 гена СTLA4 тесно ассоциирован с предрасположенностью к СД1 у больных русского происхождения. Однако трудно решить, какой из четырех изученных к настоящему времени маркеров (полиморфный микросателлит (АТ)n, A49G, C(–318)T и G6230А) гена CTLA4 вносит наибольший вклад в развитие СД1.

Все эти маркеры тесно ассоциированы с СД1 и в то же время не сцеплены между собой. Для маркеров A49G и C(–318)T показана функциональная значимость. У носителей аллеля A (Ala) полиморфного маркера A49G снижено содержание молекул CTLA-4 на поверхности клеток [9]. У носителей аллеля T полиморфного маркера C(–318)T имеет место повышенная активность промотора гена CTLA4 [8, 10], что приводит к снижению уровня активации Т-клеток.

Для двух других маркеров (полиморфный микросателлит (АТ)n и G6230А) функциональная значимость до настоящего времени не обнаружена. Однако это не означает, что они не оказывают влияния на реализацию функций молекул CTLA-4. В данной ситуации при расчете риска развития СД1, по-видимому, следует учитывать совокупное влияние всех изученных маркеров.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.Г. Никитин, В.В. Носиков, И.И. Дедов, О.И. Копылова

Сбор и обработка материала — Т.Л. Кураева, Г.Е. Смирнова, В.А. Петеркова, Е.Ю. Лаврикова, О.И. Копылова

Статистическая обработка данных — А.Г. Никитин, О.И. Копылова

Написание текста — А.Г. Никитин, О.И. Копылова, В.В. Носиков

Редактирование — В.В. Носиков