Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Орлова Е.Г.

Лаборатория иммунорегуляции Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь

Ширшев С.В.

Лаборатория иммунорегуляции Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь

Регуляция лептином и грелином экспрессии мембранных молекул и апоптоза лимфоцитов человека при беременности

Авторы:

Орлова Е.Г., Ширшев С.В.

Подробнее об авторах

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2010;56(3): 26‑30

Просмотров : 233

Загрузок: 1

Как цитировать:

Орлова Е.Г., Ширшев С.В. Регуляция лептином и грелином экспрессии мембранных молекул и апоптоза лимфоцитов человека при беременности. Проблемы эндокринологии. 2010;56(3):26‑30.
Orlova EG, Shirshev SV. Regulation of expression of membrane molecules and apoptosis of human lymphocyte by leptin and ghrelin during pregnancy. Problemy Endokrinologii. 2010;56(3):26‑30. (In Russ.).

Исследование иммуномодулирующих эффектов гормонов, принимающих активное участие в процессах гестации, необходимо для понимания механизмов, определяющих изменение иммунитета при беременности. Лептин и грелин являются пептидными гормонами, разнонаправленно регулирующими энергетический обмен. Помимо этого, оба гормона обладают иммуномодулирующей активностью и необходимы для реализации репродуктивной функции [1]. Лептин синтезируется адипоцитами и ограничивает избыточное накопление жировой ткани [2]. Грелин вырабатывается тканью желудка и угнетает секрецию лептина, усиливая чувство голода и аппетит [1]. При беременности уровень лептина значительно нарастает, особенно во II—III триместрах [3]. Гормон необходим для успешной имплантации и активно вырабатывается плацентой [1]. Участие грелина в регуляции репродуктивных процессов обусловлено экспрессией рецепторов к нему клетками эндометрия, плаценты и эмбриона. В противоположность лептину уровень грелина нарастает на ранних этапах беременности и снижается в поздние сроки [4]. Грелин препятствует развитию бластоцисты и процессу имплантации [1]. Участие гормонов в регуляции иммунитета определяется их непосредственным влиянием на клетки иммунной системы, которые экспрессируют специфические мембранные рецепторы к лептину и грелину [5—9]. Основные исследования [1, 2, 5—9] иммуномодулирующих эффектов лептина и грелина проводились на моделях ожирения и воспаления, при которых концентрации гормонов значительно превышают физиологические. В работах ряда авторов [1, 2, 10] показано, что лептин является провоспалительным гормоном и способствует преобладанию клеточно-опосредованного иммунного ответа. Грелин оказывает противовоспалительные эффекты и антагонистическое действие по отношению к лептину, блокируя, например, индуцированную лептином продукцию провоспалительных цитокинов [1, 6, 7, 11]. Лептин в свою очередь усиливает экспрессию рецепторов к грелину на иммунокомпетентных клетках [6, 11]. Беременность смещает центр иммунных реакций на T-хелперы (Th) — 2-й тип иммунного реагирования [12], поэтому изучение роли лептина и грелина в контроле функциональной активности лимфоцитов при беременности приобретает особую значимость.

Цель работы — исследовать влияние лептина и грелина, а также их совместные эффекты, в сочетаниях, характерных для разных триместров беременности, на экспрессию мембранных молекул и апоптоз лимфоцитов периферической крови женщин.

Материал и методы

В работе использовали суспензию мононуклеарных лейкоцитов периферической крови здоровых небеременных женщин (от 23 до 35 лет), находящихся в фолликулярной фазе менструального цикла (5—11-й день). Мононуклеарные клетки получали с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл—верографин (1,077 г/см3). Полученную суспензию (1·106 мл) после двойной отмывки раствором Хэнкса инкубировали в полной питательной среде (среда 199 с добавлением 10 мM HEPES; 2 мM L-глутамина; 100 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки) с гормонами в течение суток при температуре 37°С в условиях 5% СО2. Лептин («Sigma», США) в культуры вносили в дозах 10 и 35 нг/мл, отражающих его содержание в периферической крови в I и во II—III триместрах беременности соответственно [3]. Грелин («Sigma», Израиль) использовали в концентрациях 1,25 и 0,83 нг/мл, соответствующих уровню гормона в периферической крови в I—II и III триместрах беременности [4]. Для изучения совместных эффектов лептин и грелин вносили в культуры одномоментно в сочетаниях, характерных для I—II (лептин 10 нг/мл + грелин 1,2 нг/мл) и II—III (лептин 35 нг/мл + грелин 0,87 нг/мл) триместров беременности. В контрольные пробы вместо гормонов добавляли равное количество их растворителя (хлорида натрия).

Фенотип лейкоцитов оценивали методом проточной цитометрии на цитофлюориметре EPICS XL («Beckman Coulter», США). После инкубации с гормонами клетки отмывали фосфатно-солевым буфером и окрашивали моноклональными антителами, меченными флуорохромами: флюоресцеинизотиоционатом (FITC) и фикоэритрином (PE), согласно методике производителя («Beckman Coulter», США). Лимфоцитарный гейт выставляли на основе комбинации прямого и бокового светорассеивания и размера клеток, подсчитывая не менее 10 000 клеток. Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции лимфоцитарного окна использовали соответствующие изотипические контроли.

Определяли следующие субпопуляции лимфоцитов: активированные Тh-клетки CD3+CD4+CD25dim (CD4-FITC/CD25-PE), Т-клетки CD4+ с высокой экспрессией CD25 (CD3+CD4+CD25bright), так называемые естественные T-регуляторные лимфоциты, или Treg. Основным маркером Treg является экспрессия в клетке транскрипционного фактора Foxp3, которая коррелирует с интенсивностью экспрессии мембранной молекулы CD25 [13, 14]. Таким образом, к Treg (CD3+CD4+CD25+Foxp3+) относятся именно лимфоциты CD3+CD4+CD25bright, а активированные Тh-клетки составляют пул CD3+CD4+CD25dim [5, 14—16]. Кроме того, определяли содержание натуральных киллеров (NK-клеток) с фенотипом CD3–CD16+CD56+ (CD3-FITC/CD16,56-PE) и Т-клеток с функциями естественных киллеров (NKT-клетки) CD3+CD16+CD56+ (CD3-FITC/CD16,56-PE).

Апоптоз лимфоцитов оценивали путем окрашивания аннексином-V (AnV-FITC) и йодистым пропидием (PI). Данный метод позволяет идентифицировать клетки, находящиеся в ранней (AnV+/PI-) и поздней стадии (AnV+/PI+ ) апоптоза [17]. Для индукции апоптоза использовали анти-CD3 моноклональные антитела (5 мкг/мл, «Медбиоспектр», Россия), которые вносили в культуры вместе с гормонами [18]. Контролем служили пробы, в которые добавляли только индуктор апоптоза.

Достоверность полученных результатов оценивали с помощью парного и непарного t-критериев Стьюдента.

Результаты и обсуждение

С учетом того, что активация Т-клеток играет ключевую роль в поляризации иммунного ответа, а интерлейкин-2 является основным аутокринным регулятором дифференцировки и пролиферации лимфоцитов, исследование гормональной регуляции Т-клеточного звена иммунитета включало анализ экспрессии CD25 (высокоаффинного рецептора к интерлейкину-2) на Тh-клетках. Установлено, что грелин в дозах, характерных для беременности, дозозависимо регулирует экспрессию молекулы CD25 Тh-клетками. Высокая доза гормона увеличивает, а низкая не влияет на процент активированных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25dim. Лептин в исследуемых дозах, напротив, снижает количество CD4+CD25dim Т-клеток. Одновременное внесение гормонов в комбинации, характерной для I—II триместра беременности, нивелирует самостоятельное влияние как лептина, так и грелина на экспрессию CD25 Тh-клетками. Однако в сочетаниях, сопоставимых с таковыми в II—III триместре беременности, гормоны увеличивают процент Т-клеток CD4+CD25dim, что свидетельствует о доминирующем влиянии грелина (табл. 1).

При исследовании регуляторного влияния лептина и грелина, а также их сочетаний на количество Т-клеток CD4+CD25bright (Treg) статистически значимых эффектов не выявлено (см. табл. 1).

Альтернативным исходом Т-клеточной активации является инициация апоптоза. При беременности апоптоз является одним из факторов контроля активации Т-лимфоцитов и индукции периферической толерантности к полуаллогенному трофобласту [12]. Установлено, что грелин в концентрации, характерной для I—II триместра беременности, увеличивает процент лимфоцитов, находящихся в поздней стадии апоптоза (AnV+/PI+). Лептин, напротив, в исследуемых дозах проявляет антиапоптотическое действие, снижая количество AnV+/PI+ лимфоцитов. Результатом совместного действия лептина и грелина в сочетаниях, характерных для разных триместров беременности, является отмена модулирующих влияний гормонов на апоптоз лимфоцитов (табл. 2).

Таким образом, в дозах, характерных для беременности, грелин и лептин меняют направленность регуляторных эффектов на противоположную. Так, грелин, оказывая, по данным литературы, противовоспалительное действие, в концентрациях, отражающих его уровень в разные триместры беременности, проявляет провоспалительную активность, стимулируя активацию и апоптоз лимфоцитов. Лептин в свою очередь, являясь провоспалительным гормоном, оказывает противовоспалительное действие, снижая количество активированных Тh-клеток и апоптоз лимфоцитов. Сочетанное действие грелина и лептина на уровне лимфоцитов нивелирует самостоятельные эффекты каждого гормона и приводит к формированию новых кооперативных эффектов в зависимости от триместра беременности, что, возможно, обусловлено антагонизмом внутриклеточных эффекторных молекул различных сигнальных путей, активируемых при связывании гормонов с рецепторами. Помимо этого, грелин, по-видимому, способен блокировать эффекты лептина путем модуляции экспрессии его рецепторов и/или увеличения продукции эндогенного грелина [6].

Учитывая важную роль NK- и NKТ-клеток при беременности как эффекторов неспецифической резистентности организма, мы посчитали необходимым оценить регуляцию гормонами их фенотипа [12, 16]. Следует отметить, что NK- и NKT-клетки периферической крови конститутивно экспонируют на мембране CD56, тогда как экспрессия CD16 ассоциирована с терминальной стадией их дифференцировки и приобретением наибольшей цитолитической активности [19, 20]. Установлено, что грелин в дозах, характерных для беременности, не влияет на процент NK- и NKT-клеток, экспрессирующих CD16. Лептин, напротив, оказывает разнонаправленное дозозависимое действие на экспрессию молекулы CD16 на NK- и NKT-клетках. Так, в дозе, характерной для I триместра беременности, гормон повышает процент CD16+NK-клеток и не влияет на количество CD16+NKT-лимфоцитов. Однако в концентрации, сопоставимой с таковой в II—III триместре, лептин снижает содержание CD16+NK-клеток и увеличивает процент CD16+NKT-клеток. При одновременном внесении с лептином грелин меняет направленность его эффектов. Так, в комбинации, характерной для I—II триместра беременности, гормоны не влияют на процент CD16+NK- и CD16+NKT-клеток. Однако в дозах, сопоставимых с таковым II—III триместре, гормоны повышают содержание NK-клеток и не влияют на процент NKT-лимфоцитов, экспрессирующих молекулу CD16 (табл. 3).

Несмотря на то что прямых данных литературы [6—8], касающихся экспрессии рецепторов к грелину на NK- и NKТ-клетках нет, выявленные нами эффекты свидетельствуют о возможной модуляции грелином их фенотипа как непосредственно, так и опосредованно, возможно, путем регуляции количества рецепторов к лептину, как это показано для других субпопуляций лимфоцитов.

В целом полученные данные свидетельствуют о том, при беременности грелин и лептин проявляют реципрокные регуляторные эффекты на активацию и апоптоз лимфоцитов, а также фенотип NK- и NKT-клеток, не влияя на уровень Treg. Изменение направленности эффектов лептина и грелина в дозах, характерных для беременности, по-видимому, обусловлено особенностью взаимодействия низких физиологических доз гормонов с клеткой, поскольку основные регуляторные эффекты лептина и грелина исследованы в патофизиологических концентрациях, значительно превышающих содержание гормонов в крови при беременности. Сочетанное влияние лептина и грелина на уровне лимфоцитов в дозах, соответствующих таковым в I—II триместре беременности, нивелирует самостоятельное действие каждого гормона, что важно для сохранения баланса про- и противовоспалительных иммунных реакций на ранних этапах беременности, когда риск развития реакций иммунного отторжения против полуаллогенного плода особенно велик [12]. В то же время преобладание модулирующих эффектов грелина при одновременном внесении гормонов в дозах, характерных для II—III триместра беременности, по-видимому, может стимулировать провоспалительные реакции, что в этот период необходимо для поддержания резистентности организма матери и способствует родам.

Выводы

1. Лептин в дозах, характерных для беременности, снижает процент Т-клеток CD4+CD25dim и апоптоз лимфоцитов, а также оказывает разнонаправленное дозозависимое действие на содержание CD16+56+NK- и CD16+56+NKT-клеток, не влияя на количество T-лимфоцитов CD4 +CD25bright.

2. Грелин в исследуемых концентрациях дозозависимо повышает уровень Т-клеток CD4+CD25dim и апоптоз лимфоцитов, не оказывая действия на количество CD16+56+NK-, CD16+56+NKT-клеток и T-лимфоцитов CD4+CD25bright.

3. При одновременном внесении лептин и грелин в комбинации, характерной для I—II триместра беременности, не влияют на процент Т-клеток CD4+CD25dim и апоптоз лимфоцитов, а также на количество CD16+56+NK- и CD16+56+NKT-клеток, а в сочетании, сопоставимом с таковым в II—III триместре беременности, стимулируют экспрессию молекулы CD25 на Тh-клетках и CD16 на NK-клетках.

Работа выполнена при поддержке федеральной целевой программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail