Различные клетки и ткани человеческого организма стареют неравномерно. Кожа — одна из структур, на которой внешне отмечается появление первых возрастных признаков. Это выражается в истончении дермального слоя, нарушении его связи с эпидермисом, обеднении кровеносными сосудами дермы и гиподермы, атрофии подкожной жировой клетчатки [5, 7]. На клеточном и субклеточном уровне изменения проявляются в нарушении синтеза фибробластами компонентов межклеточного матрикса (коллаген, эластин, гиалуроновая кислота), химическом ремоделировании зрелого коллагена с нарушением его свойств, а также в уменьшении количества капилляров и их перераспределении в слоях кожи [2, 6]. Фенотипически возрастные изменения характеризуются появлением тусклого цвета кожи, снижением ее тургора и образованием морщин. Соответственно большинство антивозрастных методик ставят своей целью стимуляцию синтеза коллагена и улучшение микроциркуляции. По данным большинства исследований [1], такой эффект оказывает имплантация в субдермальный слой монофиламентных нитей из различных материалов. Монофиламентные нити также называют биостимулирующими [4].

Методика подкожного введения нитей из различных материалов с целью уплотнения кожи и коррекции возрастных изменений была изобретена сравнительно недавно. В Европе первоначально для коррекции возрастных изменений кожи использовали нити из инертных металлов (золото, платина) [13], а в азиатских странах первыми начали внедрять в косметологию шовный материал полидиоксанон [11, 12]. Когда методика прочно вошла в арсенал эстетической медицины, внимание исследователей привлек полиэфир L-молочной кислоты, имеющий долгую историю применения в травматологиии, ортопедии, общей хирургии, регенеративной медицине и множестве других медицинских отраслей [3]. Поли-L-лактид обладает биосовместимостью (т.е. не вызывает реакции отторжения в тканях), инертен и полностью биодеградирует в тканях примерно через 12 мес [14, 15]. Биодеградация происходит до углекислого газа и воды, с предшествующей деполимеризацией с образованием молочной кислоты [9].

На сегодняшний день нерассасывающиеся нити отходят в прошлое из-за наличия серьезных побочных эффектов (миграция нитей, хроническое гранулематозное воспаление, хронический болевой синдром) [8], в то время как нити из биодеградируемых материалов приобретают все большую популярность. В связи с этим возникает необходимость детального изучения влияния рассасывающихся нитей на окружающие их ткани живого организма. Имеется сравнительно небольшое количество публикаций, количественно оценивающих прирост коллагена и изменения микроциркуляторного русла в различные периоды после имплантации нитей из поли-L-молочной кислоты (Poly-L-Lactic Acid — PLLA) [14, 15].

Цель настоящего исследования — попытка детально оценить гистологические изменения, происходящие вокруг имплантированных нитей, с помощью иммуногистохимических методов (ИГХ).

Конструкция для процедуры имплантации состояла из инъекционной иглы-проводника и нити из полимолочной кислоты, половина которой была помещена в полость иглы, а вторая половина находилась снаружи и была зафиксирована пенопластовым держателем. Игла-проводник вводилась параллельно поверхности кожи на всю длину. После установки нити в ткань на обратном ходе иглы нить отделялась от проводника, оставаясь в тканях. Уровень постановки нитей — субдермально. Длина иглы-носителя — 38 мм, нити — 45 мм, диаметр иглы — 27G.

Настоящее исследование было проведено на 8 белых крысах-самках 3-месячного возраста. В область спины, справа от позвоночного столба, на 2 см выше хвоста животным было имплантировано по 4 нити из PLLA параллельно друг другу на расстоянии 1—1,5 мм. Шерсть в области имплантации сбривали, правила асептики и антисептики были соблюдены. Для выявления динамики морфологических изменений 4 крысы были гуманно умерщвлены спустя 21 сут эксперимента и оставшиеся 4 крысы — через 90 сут. Из мест введения нитей для гистологического исследования были изъяты фрагменты кожи размером 1,5×1,5 см, в качестве контроля были взяты интактные образцы кожи с противоположной стороны от позвоночного столба.

Было изготовлено 16 парафиновых блоков с кусочками кожи и подкожной клетчатки. Окраску всех гистологических препаратов производили гематоксилином и эозином. Отдельно оценивали параметры в зоне вокруг нитей, пограничной зоне и дерме кожи.

Для оценки степени неокапиллярогенеза использовали ИГХ-метод. ИГХ-окрашивание выполняли на срезах с парафиновых блоков, используя авидин-биотиновый пероксидазный метод с антителами к CD31 (DAKO), Factor VIII (DAKO) (для визуализации эндотелия сосудов) с помощью автоматизированного окрашивания на аппарате Ventana Benchmark. Для выявления коллагеновых и эластических волокон применялось трихромное окрашивание по Маллори.

Для объективизации исследования использовали количественный метод оценки плотности сосудов и метод компьютерной морфометрии. Морфометрические исследования осуществляли с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Leica DM400B, цифровой камеры Leica DFC420 C, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения компьютерного анализа изображения Leica Qwin Standart V.3.1.0.

В каждом случае анализировалось 20 полей зрения при увеличении ×200.

Для оценки выраженности конкретного показателя (фиброза) рассчитывали занимаемую им относительную площадь.

Для количественной оценки неоангиогенеза и плотности васкуляризации сосудов определяли среднее количество капилляров в 1 мм². Для определения выраженности воспалительного инфильтрата и вызревания грануляционной ткани изучали 20 полей зрения при большом увеличении (×400), рассчитывали количество и относительную долю следующих клеток: лимфоцитов, плазмоцитов, нейтрофилов, макрофагов.

Полученные данные обрабатывали статистически посредством электронных таблиц Microsoft Excel и Биостатистика. Вычисляли средние арифметические, стандартное отклонение. Нормальность распределения признаков определяли по критерию Шапиро—Уилка. Обработку результатов проводили с использованием непараметрических критериев для множественных выборок Краскела—Уоллиса и Ньюмена—Кейлса. Различия считались статистически значимыми при p<0,05

В микроскопических препаратах, взятых из тканей интактной стороны как на 21-е, так и на 90-е сутки, ни в коже, ни в подлежащих тканях не было выявлено дистрофических и некротических изменений. В гистологических препаратах, полученных из экспериментальных тканей животных, умерщвленных на 21-е сутки после начала эксперимента, вокруг введенных нитей из PLLA были выявлены продуктивные изменения с формированием очаговых слабовыраженных воспалительных инфильтратов, представленных преимущественно лимфоцитами и плазмоцитами с примесью макрофагов (рис. 1).

В гистологических препаратах, полученных из тканей, в которые вводили нити, на 90-е сутки в пограничной зоне была выявлена неравномерная пролиферация гистиогенных элементов и эндотелиальных клеток, формирующих множественные капилляры. В пограничных участках обнаруживались единичные макрофаги и тучные клетки. В зоне вокруг нитей наблюдалась минимальная слабовыраженная продуктивная воспалительная инфильтрация (рис. 2).

Известно, что макрофаги и тучные клетки благодаря выработке биологически активных веществ играют большую роль в неоангиогенезе [10]. Присутствие единичных макрофагов в инфильтрате свидетельствует о модуляции пролиферативной и синтетической функции фибробластов, а также активизации миграции и пролиферации эндотелиоцитов, что является предпосылкой к образованию новых сосудов. Вырабатываемая макрофагами триптаза оказывает митогенное действие на эндотелиоциты, гистамин — на фибробласты, стимулируя секрецию коллагена. Тучные клетки выделяют эндотелин-1, влияющий на пролиферацию фибробластов.

При оценке реактивного разрастания волокон фиброзной ткани в целом в участках вокруг нитей и пограничных зон отмечалась узкая зона зрелой соединительной ткани с умеренно выраженным коллагеногенезом и наличием дифференцированных фиброцитов. Анализ результатов окрашивания по Маллори показал увеличение удельной площади соединительной ткани в препаратах из экспериментальных тканей животных по сравнению с контрольными препаратами. При этом с течением времени с 21-х по 90-е сутки отмечалось нарастание относительной площади эластических волокон по отношению к коллагеновым (рис. 3, 4,

При анализе неоангиогенеза с помощью ИГХ-метода исследования с антителами к CD31 и Factor VIII и количественной оценки плотности распределения новообразованных сосудов также были выявлены различия между контрольными и исследуемыми образцами (табл. 3).

По сравнению с контрольными интактными тканями в местах введения биостимулирующих нитей через 21 сут в пограничной зоне и в дерме у крыс было выявлено большее количество сосудов, в том числе новообразованных, а в тканях, окружающих нити, отмечалась пролиферация эндотелиальных клеток, формирующих единичные зрелые капилляры (рис. 5).

При исследовании препаратов из мест введения нитей на 90-е сутки (рис. 6)

Настоящее исследование показало, что субдермальное введение биостимулирующих нитей из PLLA не вызывает экссудативного воспаления в окружающих тканях (отсутствие нейтрофильных лейкоцитов), аллергической реакции (отсутствие эозинофилов в инфильтрате), образования гранулем, выраженного фиброзирования стромы с разрастанием грубой рубцовой соединительной ткани. Воспалительный инфильтрат представлен слабовыраженными очагами продуктивного воспаления с уменьшением площади воспалительных очагов в динамике.

Анализ результатов окрашивания на различные типы волокон соединительной ткани, образующейся в ответ на введение подкожно биостимулирующих нитей, демонстрирует коллагеностимулирующий эффект нитей из PLLA, при этом со временем наблюдается изменение соотношения коллагеновых и эластических волокон в пользу последних, что имеет благоприятное значение для формирования более мягкого и гладкого контура в месте введения нитей.

Данные морфологического исследования показывают, что использование нитей из PLLA обладает хорошо выраженным стимулирующим действием на неоангиогенез, поскольку на протяжении всего опыта отмечалось возрастание сосудистой плотности. Это заключение подтверждается ИГХ-исследованием, при котором выявлено статистически достоверное увеличение плотности капилляров перифокально в участках вокруг нитей, а также в дерме кожи, в строме мышечной ткани, что способствует улучшению насыщения кислородом и питательными веществами мягких тканей вокруг введенных нитей и, таким образом, усилению регенеративных возможностей этих тканей.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Автор, ответственный за переписку: Масляков В.В. —
e-mail: maslyakov@inbox.ru