Оценка ассоциации генетических вариантов генов и с развитием рака яичников

Сегодня в многочисленных исследованиях представлено 2 гена, наследуемые мутации в которых приводят к возникновению семейных форм рака молочной железы (РМЖ) и рака яичника (РЯ) — BRCA1 и BRCA2. У всех родственников в семье, имеющих один и тот же патологический вариант гена, повышается риск развития онкологического заболевания, по некоторым сведениям он приближается к 90%. Данные мировой статистики за последние 10 лет говорят о том, что носительство этих мутаций повышает риск развития заболевания в молодом возрасте в 10 раз [1—5]. Зачастую в одной семье обнаруживаются случаи РМЖ и Р.Я. Выявление мутаций с последующей диспансеризацией пациенток позволяет предотвратить развитие заболевания не только у больных, но и их родственниц. Однако следует понимать, что генетическая природа этих форм рака показана только в 15% от общего числа случаев, что говорит о многофакторности их патогенеза [6—8].

Согласно данным некоторых авторов, ассоциированность с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 при РЯ составляет более 90% от всех форм наследственного рака. Поэтому задачей данного исследования явилось изучение частоты и вклада мутаций BRCA при различных формах РЯ, включая спорадические случаи.

Цель исследования — изучить особенности распределения частот генотипов и аллелей генов BRCA1 и BRCA2 у больных РЯ и здоровых женщин; определить вклад указанных генов в формирование основных форм, течение и эффективность лечения данного заболевания.

Проведено генотипическое обследование образцов ДНК от 208 пациенток узбекской этнопринадлежности, жительниц Андижанской области, с диагнозом РЯ, наблюдавшихся в гинекологическом отделении Андижанского областного онкологического диспансера в период 2008—2015 гг. Кроме того, были обследованы 80 здоровых женщин первой линии родства (дочери, родные сестры и матери) больных РЯ для изучения его наследственных форм.

Для проведения исследований аллельных вариантов генов BRCA1 и BRCA2 использовали опухолевый материал на парафиновых блоках (2008—2012) и образцы периферической венозной крови (2013—2015). В г. Андижане осуществляли сбор материала, который в последующем доставляли для проведения молекулярно-генетических исследований на базу Научно-диагностического центра «Immunogen Test» при Институте иммунологии АН РУз. (pcr.gl.uz).

Анализ последовательности ДНК в режиме реального времени, основанный на технологии пиросеквенирования, и Q-PCR HRM осуществляли с помощью проведения полимеразной цепной реакции. Для этого брали ДНК с приблизительной концентрацией 0,1 мкг/мл, разбавленную деионизированной водой, и соответствующие праймеры с концентрацией 10 пмоль/мкл.

Из парафиновых блоков делали срезы толщиной 20 мкм, с которыми проводили дальнейшее выделение ДНК:

— добавляли 100—120 мкл 0,5% раствора Твин 20;

— нагревали 15 мин при +90 °С;

— вливали 50 мкл протеиназы К при +55 °С;

— добавляли 100 мкл 5% раствора Челекс 100;

— вливали 5 мкл 0,5 М Трис и 1 М ЭДТА;

— термостатировали 15 мин при +100 °С;

— центрифугировали при 10 500 об/мин с последующим охлаждением;

— удаляли парафин с последующим нагревом осадка с хлороформом до +45 °C;

— центрифугировали при 10 500 об/мин;

— переносили супернатант 5 мкл 5 М хлористого натрия и 500мкл этилового спирта;

— центрифугировали при 10 500 об/мин 30 мин;

— промывали спиртом;

— повторно центрифугировали;

— после полного высушивания спирта добавляли 30—50 мкл dTE.

При генотипировании вариантов BRCA1 (BRCA1_4153delA, BRCA1_185delA, BRCA1_300T>G (Cys61GLY), BRCA1_3875delA, BRCA2_2080delA 6174delT, BRCA1_3819delGTAAA, BRCA1_2080delA, BRCA1_5382insC) во всех изученных образцах общее наличие мутации было обнаружено в 24 (9,3%) из 208 случаев. Выявлены достоверные различия в характере распределения генотипических вариантов между больными РЯ и их ближайшими родственницами.

Однако были установлены достоверно значимые различия (χ²=3,92, р=0,05) между группой раковых больных и группой здоровых обследованных, что составило 11,1 и 1,25% соответственно. В группе здоровых среди 80 женщин мутации обнаружены в 1,25% случаев, в то время как среди больных РЯ — в 11,1%.

Среди всех изученных 8 вариантов выявлено 5мутаций — 4153delA, 5382insC, Cys61Gly, 2080delA, 3819delGTAAA, однако превалирующими оказались 5382insC (BRCA1) в 8,7% и BRCA1_4153delA в 2,9% от всех больных Р.Я. По данным других авторов, мутации BRCA1_4153delA также идентифицированы как рисковые для РЯ, но не РМЖ [9].

Низкую частоту выявления показали 3 варианта BRCA 1, BRCA 2 — BRCA1_300T>G (Cys61GLY) найден в 1% случаев в группе больных РЯ и не обнаружен среди здоровых; BRCA1_2080delA и BRCA1_3819delGTAAA выявлены по 1,4% среди больных Р.Я. Среди родственниц больных РЯ был выявлен вариант BRCA_1 5382insC у 2% женщин (рис. 1).

К примеру, по данным возможной связи гена BRCA с развитием РМЖ и РЯ в России показана значимость мутации BRCA1_185delAG, BRCA2_6174IT и BRCA1_3875 delGTAAA [8, 10], однако в представленном исследовании эти варианты не были выявлены ни в одном случае, что указывает на нецелесообразность включения этих вариантов в наши генодиагностические панели для РЯ.

Таким образом, BRCA1_5382insC имеет большую значимость в возникновении наследственной формы РЯ, чем BRCA1_4153delA. Мутации аллеля BRCA1_5382insC можно использовать как критерий прогноза РЯ и включить его для скрининговых исследований.

Нами впервые был установлен характер генотипической вариабельности гена BRCA в Андижанском регионе как среди больных РЯ, так и среди здоровых женщин. Аналогичные результаты были представлены в других странах, где также преобладающим прогностически значимым вариантом был идентифицирован BRCA1_5382insC [9, 11].

Анализ полученных результатов показал, что мутация BRCA1_4153delA встречалась у 6 (2,9%) больных РЯ, р>0,05. В наибольшем количестве в исследуемой группе выявлена мутация BRCA1_5382insC — 18 (8,7%) эпизодов, в группе здоровых ближайших родственниц эта мутация обнаружена у 1 (1,25%) женщины, р>0,05. Мутация BRCA1_300T>G (Cys61GLY) зафиксирована у 2 (1%) женщин, BRCA1_3819delGTAAA — у 3 (1,4%) пациенток, BRCA1_2080delA — у 2 (1,4%) обследованных, p>0,05 (табл. 1).

Кроме того, был проведен анализ показателей отношения шансов (OR) и относительного риска (RR) с целью изучения возможного рискового вклада мутаций BRCA в развитие РЯ (табл. 2).

Для определения вклада мутаций в гене BRCA в целях прогноза течения заболевания был проведен анализ носительства мутаций при различных стадиях процесса РЯ в зависимости от стадии заболевания — с I по IV. Основная мутация BRCA1_5382insC была выявлена на всех стадиях заболевания, но с наибольшей частотой на IV стадии — 40%. В целом анализ показал, что частота встречаемости всех мутаций BRCA среди больных РЯ с I стадией составила 46,2%, среди пациенток с IV стадией — 40%. Достоверных отличий встречаемости мутаций в зависимости от наследственных форми стадии процесса выявлено не было.

Больные с I стадией процесса имели следующие виды мутаций — BRCA1_4153delA — у 2 (15,4%) женщин, BRCA1_5382insC — у 4 (30,8%) пациенток, а также мутации BRCA1_3819delGTAAA, BRCA1_300T>G (Cys61GLY), BRCA1_2080delA составили по 1 (7,7%) соответственно. Среди больных со II—III стадиями заболевания были обнаружены мутации BRCA1_5382insC у 9 (6,4%) и 3 (6%) женщин соответственно (табл. 3).

В рамках представленного исследования был проведен анализ носительства мутаций гена BRCA при различных морфологических формах. В ходе анализа данных по встречаемости различных морфологических форм в зависимости от возрастных групп было обнаружено, что в возрасте 46—55 лет (пременопауза) наиболее часто встречались опухоли эпителиального характера. Серозная форма опухоли диагностирована у 43 (16,7%), сосочковая — у 57 (22,1%), недифференцированная — у 26 (10,1%) пациенток. Среди лиц молодого возраста (до 17 лет) серозная форма зафиксирована лишь у 1 (1,8%) больной. Недифференцированная гистологическая форма при РЯ, как и при других формах злокачественной опухоли, является самым неблагоприятным фактором в прогнозе ее течения. Из всех гистологических форм недифференцированный рак составил 26 (10,1%) случаев. Это означает, что пациентки с данной гистологической формой опухоли имеют плохой прогноз в плане общей выживаемости и безрецидивного периода течения заболевания. Продолжительность жизни за счет удлинения безрецидивного промежутка времени с применением самых современных методов лечения играет огромную роль у онкологических больных.

Изучение возрастного состава обследованных женщин с мутацией в гене BRCA1 показало, что среди них были 2 (5,5%) молодые пациентки (до 35 лет), 11 (48,6%) женщин среднего (35—59 лет) возраста и 10 (45,9%) женщин пожилого (60 лет —74 года) возраста (рис. 2).

Интерес также представляет наличие мутаций в различных гистологических группах. Среди больных с папиллярной формой опухоли встречаемость мутаций была обнаружена у 10 (41,7%) пациенток; светлоклеточной формы опухоли — у 1 (4,2%) женщины; в дисгерминоме — у 2 (8,3%) обследованных; в эмбриональной опухоли — у 1 (4,2%) женщины; в недифференцированной форме — у 3 (12,5%) пациенток; в тератобластоме и гранулезоклеточной опухоли — у 1 (4,2%) и 1 (4,2%) пациенток соответственно. Из сказанного следует, что встречаемость мутаций в генах BRCA1, BRCA2 чаще характерна для эпителиальных опухолей (обнаружены у 18 (78,2%) пациенток) по отношению к неэпителиальным опухолям (выявлены в 5 (21,7%) случаях). Примечателен тот факт, что у всех пациенток с мутацией в гене BRCA1 морфологически определяли эпителиальную (папиллярную) форму опухоли (табл. 4).

Таким образом, частота встречаемости серозной, сосочковой, недифференцированной формы в группе узбекской популяции превалирует над другими морфологическими типами опухоли. Анализ показал, что наличие мутации в гене ВRCA1 может привести к возникновению эпителиального РЯ, так как у пациенток с эпителиальной формой рака был обнаружен большой процент мутаций.

Из 208 больных РЯ у 11,1% обследованных были выявлены 5 из 8 мутаций гена BRCA1/2 — 4153delA, 5382insC, Cys61Gly, 2080delA, 3819delGTAAA, превалирующими явились 5382insC (BRCA1) в 8,7% и BRCA1_4153delA в 2,9% от всех больных Р.Я. Среди 80 здоровых родственниц был выявлен вариант BRCA_1 5382insC у 2% женщин.

Изучение вклада мутаций BRCA в развитие РЯ показало, что неблагоприятный генотип имеет высокий, статистически значимый коэффициент риска развития РЯ: RR составил 8,9567 при p=0,0305 и OR — 9,8216 при p=0,0266.

Наличие мутации в гене BRCA1 у больных РЯ ассоциируется с прогностически неблагоприятным течением заболевания, общая эффективность 0%, а у больных без мутации — 70,1%. Анализ RR среди прооперированных больных с наличием мутации в гене BRCA и без таковой показал, что наличие мутации достоверно ассоциировано с прогрессированием заболевания: RR=1,2245 при р-value <0,0025.

Среди лиц — носителей мутаций прогрессирование заболевания было достоверно хуже, RR=2,5444 при p<0,0001. Случаи с ранним рецидивированием у лиц с мутациями в гене BRCA достоверно отличались среди пациенток без мутаций: RR=7,7516 при p<0,0001.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Мамарасулова Дилфузахон Закиржановна — д.м.н., доцент, заведующая кафедрой онкологии и медцинской радиологии Андижанского государственного медицинского института, Республика Узбекистан; e-mail: dilya2580559@gmail.com

Мамадалиева Яшнар Мамасалиевна — д.м.н., доцент, заведующая курсом ультразвуковой диагностики ТАШ ИУВ, Республика Узбекистан

Азизов Юрий Далиевич — д.м.н., проф., заведующий кафедрой микробиологии Андижанского государственного медицинского института, Республика Узбекистан

Якуббекова Сохиба Садыковна — ассистент кафедры онкологии и медицинской радиологии Андижанского государственного медицинского института, Республика Узбекистан