Нарушение биогенеза наружной мембраны ведет к аттенуации Yersinia pseudotuberculosis

Внешняя мембрана грамотрицательных бактерий представляет собой асимметричный липидный бислой, внутренняя часть которого состоит из фосфолипидов, а внешняя представлена в основном липополисахаридами (ЛПС) и мозаично расположенными белками внешней мембраны [1]. Белки внешней мембраны (БВМ) синтезируются в цитоплазме и транслоцируются в периплазматическое пространство через внутреннюю мембрану с помощью Sec-системы (General Secretory Pathway (GSP) или Sec pathway), при этом N-концевая сигнальная последовательность отрезается [2]. Периплазматические шапероны, такие как SurA или Skp (OmpH), связываются с незрелыми БВМ, обеспечивают им защиту от протеолиза, поддерживают в неденатурированном состоянии и направляют во внешнюю мембрану [3]. Третий шаперон, DegP, функционирует, главным образом, как протеаза, разрушая неправильно свернутые и агрегированные БВМ [4]. Существуют два пути переноса БВМ через периплазму шаперонами: с участием SurA или Skp/DegP [3]. Большинство БВМ переносятся шапероном SurA, но при этом могут использовать Skp/DegP в качестве запасного пути в стрессовых условиях [3, 5]. Показано, что часть белков, тесно связанных с патогенным потенциалом бактерий, ориентированы на взаимодействие с SurA для корректного встраивания во внешнюю мембрану [6—8]. Показано, что сборку и вставку белков с β-цилиндрической структурой во внешнюю мембрану осуществляет олигомерный мембран-ассоциированный белковый комплекс (β-barrel assembly machinery — BAM) [9]. У Escherichia coli этот мультибелковый комплекс состоит из пяти белков, из которых BamA и BamD являются существенными компонентами, а BamB, BamC и BamE- несущественными [3, 9]. Высказано предположение, что BamB увеличивает эффективность биогенеза БВМ. Этот белок представляет собой каркас внутри олигомерного мембран-ассоциированного белкового комплекса, на котором происходит сборка β-цилиндрической структуры БВМ [10].

Yersinia pseudotuberculosis — энтеропатогенная грамотрицательная бактерия, относящаяся к семейству Enterobacterales, вызывающая псевдотуберкулез — склонное к затяжному течению заболевание желудочно-кишечного тракта средней тяжести [11]. Это пищевая зоонозная инфекция природно-очагового характера с основным резервуаром среди диких и синантропных грызунов, домашних и сельскохозяйственных животных [11—13]. Патогенный потенциал Y. pseudotuberculosis определяют несколько факторов, наиболее важными из которых являются белки адгезин A (YadA) [14], инвазин (Inv) [15] и система секреции третьего типа [16]. YadA и Inv опосредуют связывание бактерии с клетками хозяина через белки внеклеточного матрикса и/или ß1-интегрины [15]. Помимо облегчения прикрепления к клеткам хозяина YadA также опосредует устойчивость к бактерицидной активности сыворотки крови путем взаимодействия с различными отрицательными регуляторами каскада активации комплемента [17].

Настоящее исследование направлено на определение роли несущественных компонентов комплекса биогенеза белков наружной мембраны (BamB, DegP, OmpH, SurA) в патогенности Y. pseudotuberculosis.

Штаммы и условия культивирования. Бактерии E. coli, Yersinia pestis или Y. pseudotuberculosis культивировали на жидких и плотных питательных средах, Хоттингера (ФБУН «ГНЦ ПМБ») или LB (Luria Bertani broth medium: триптон — 1%, дрожжевой экстракт — 0,5%, натрий хлористый — 1%).

Животные. В экспериментах использовали самцов и самок беспородных мышей массой 20±1 г. Условия содержания, ухода и проведения манипуляций с лабораторными животными полностью соответствовали требованиям СанПиН 3.3686—21 «Санитарно- эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней». Все исследования проводили в полном соответствии с этическими нормами после получения одобрения специализированного комитета по биоэтике ФБУН «ГНЦ ПМБ» (ВП2021/3 от 02.11.21).

Получение нокаутных мутантов. Замену кодирующих последовательностей генов surA, degP, bamB и ompH в штамме Y. pseudotuberculosis 85 pCad⁺ на маркер устойчивости к антибиотику проводили методом сайт-направленного мутагенеза с использованием суицидных векторов, сконструированных на основе плазмиды pCVD442 [18]. После инактивации генов DsurA::kan, DdegP::kan, DbamB::kan, DompH::cat удаление кассет устойчивости к антибиотику осуществляли с помощью плазмиды pCP20, как описано ранее [19]. Для подтверждения успешной замены генов использовали метод полимеразой цепной реакции.

Оценку экспериментальных штаммов по показателям скорости роста, чувствительности к антибиотикам, солям желчных кислот и додецилсульфату натрия проводили ранее описанными методами [20].

Выделение белков внешней мембраны. Фракции белков, локализованных во внешней мембране, получали способом, описанным ранее [21]. Пробы белков в равном объеме лизирующего буфера инкубировали при температуре 99 °C в течение 5 мин. Разделение белков полученных образцов проводили методом ДСН-ПААГ [22].

Определение вирулентности. Вирулентность мутантных штаммов Y. pseudotuberculosis 85DsurA, 85DdegP, 85DbamB и 85DompH для лабораторных мышей оценивали путем определения LD₅₀ в сравнении с исходным штаммом Y. pseudotuberculosis 85. Инфицирование животных осуществляли подкожно, внутрибрюшинно или перорально десятикратными разведениями культур, выращенных в течение 24 ч при температуре 28 °C в изотоническом растворе хлорида натрия (0,9 %). За состоянием животных наблюдали в течение 21 сут. Величины LD₅₀ и доверительные интервалы определяли по методу Kärber в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [23].

Чувствительность к бактерицидному действию нормальной человеческой сыворотки определяли по методике M.G. Barnes и соавт. [24]. Сравнивали жизнеспособность бактерий исследуемых штаммов с концентрацией 10⁷ КОЕ/мл после воздействия нормальной человеческой сыворотки (НЧС) и сыворотки с инактивированным комплементом (тНЧС).

Статистический анализ. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Для статистического анализа использовали GraphPadPrism 6 (GraphPadSoftware, LaJolla, CA) с применением однофакторного дисперсионного анализа ANOVA. Различия считали статистически значимыми при уровне достоверности p≤0,05.

При температуре 28 °C и температуре хозяина 37 °C изучены кривые роста штаммов Y. pseudotuberculosis 85 с индивидуальными нокаутами генов surA, degP, bamB и ompH (рис. 1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_02_031_add.zip). При температуре 28 °C выявлено замедление роста бактериальных штаммов с дефектами синтеза белков SurA, OmpH, DegP или BamB по сравнению со штаммом «дикого» типа. Различия в скорости роста становились заметными через 7—9 ч после инокуляции и сохранялись в течение всего эксперимента. При температуре культивирования 37 °C дефект скорости роста был наиболее выражен у штамма Y. pseudotuberculosis 85DbamB, скорость роста штаммов с мутациями DompH, DdegP занимала промежуточной положение, а для штамма DsurA не отличалась от исходного варианта Y. pseudotuberculosis 85.

В ходе исследования провели оценку чувствительности к рифампицину (Rif), энрофлоксацину (Enr), ванкомицину (Van), доксициклину (Do), азитромицину (Azm) нокаутных мутантов и исходного штамма Y. pseudotuberculosis, культивированных при температуре 28 °C, с целью изучения целостности и проницаемости наружной мембраны (рис. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2025_02_031_add.zip). Штамм Y. pseudotuberculosis 85ΔbamB обладал повышенной чувствительностью ко всем антибиотикам, кроме рифампицина. Штамм с мутацией ΔompH приобрел чувствительность к ванкомицину. Таким образом, индивидуальные нокауты генов bamB и ompH повышают эффективность отдельных антибиотиков в отношении возбудителя псевдотуберкулеза.

Для определения целостности наружной мембраны бактерий может быть использован анализ их устойчивости к детергентам, таким как ДСН и дезоксихолат натрия. Как показано в табл. 2, штамм DbamB демонстрирует неспособность к росту на среде, содержащей ДСН. Кроме того, этот штамм проявлял повышенную чувствительность к 0,05 % раствору дезоксихолата натрия. Аналогичную повышенную чувствительность к 0,05 % дезоксихолата натрия наблюдали у мутантных штаммов с делециями в генах surA и ompH.

Таблица 2. Чувствительность к солям желчных кислот и додецилсульфату натрия мутантных штаммов Y. pseudotuberculosis

Полученные данные в целом подтверждают выводы, сделанные при анализе чувствительности к антибиотикам, и свидетельствуют о том, что BamB и OmpH играют важную роль в поддержании структурной целостности клеточной оболочки у возбудителя псевдотуберкулеза.

Структурную целостность наружной мембраны определяет ее белковая композиция. Мы сравнили белковый состав фракций наружных мембран, полученных из эквивалентных количеств бактерий штамма «дикого» типа и мутантов ΔsurA, ΔdegP, ΔbamB и ΔompH, с применением ДСН-ПААГ и окрашивания Кумасси G-250 (рис. 3). В ходе исследования выявлено существенное снижение уровня синтеза большинства белков наружной мембраны у штаммов 85DsurA, 85DbamB и 85DompH. Утрата белка DegP сопровождалась значительным повышением уровня продукции белков наружной мембраны.

Рис. 3. Изменения в композиции белков при утрате SurA, OmpH, DegP, BamB Y. pseudotuberculosis.

1 — термолизат 85; 2 — термолизат ΔsurA; 3 — термолизат ΔdegP; 4 — термолизат ΔbamB; 5 — термолизат ΔompH; M — маркер Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Thermo Scientific, Литва); 6 — наружная мембрана 85; 7 — наружная мембрана ΔsurA; 8 — наружная мембрана ΔdegP; 9 — наружная мембрана ΔbamB; 10 — наружная мембрана ΔompH; М — маркер Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder (Thermo Scientific, Литва); 11 — белок SurA-His₆; 12 — белок DegP-His₆; 13 — белок BamB-His₆; 14 — белок OmpH-His₆.

Поверхностные структуры грамотрицательных бактерий (капсула, липополисахарид, белки наружной мембраны) играют важную роль во взаимодействии с системой комплемента нормальной человеческой сыворотки (НЧС). Исходный штамм Y. pseudotuberculosis 85 после культивирования при температуре 28 ◦C или 37 ◦C был способен противостоять действию комплемента НЧС, что проявлялось в незначительном снижении количества жизнеспособных бактерий после 1 ч инкубации в 80 %-ной НЧС по сравнению с тНЧС. В то же время штаммы Y. pseudotuberculosis 85 с делециями генов surA и bamB демонстрировали полную чувствительность к комплементу. После 1 ч инкубации в 80 %-ной НЧС жизнеспособные микробные клетки не были обнаружены, что указывает на критическую роль продуктов этих генов в устойчивости к комплементу сыворотки (рис. 4).

Рис. 4.Устойчивость к действию нормальной человеческой сыворотки мутантных штаммов Y. pseudotuberculosis.

В ходе эксперимента мыши, которым вводили максимальные дозы штаммов Y. pseudotuberculosis 85 с мутациями в генах surA, degP, bamB и DompH (10⁹ КОЕ при подкожном введении и 2×10⁸ КОЕ при внутрибрюшинном и оральном введении) не проявляли признаков заболевания. Штамм Y. pseudotuberculosis 85DompH показал сопоставимый уровень аттенуации со штаммами 85DsurA, 85DdegP и 85DbamB при подкожном и оральном введении. Однако при внутрибрюшинном введении он оказался менее аттенуирован (LD₅₀=6,3×10⁷ КОЕ) (табл. 3).

Таблица 3.Вирулентность мутантных штаммов Y. pseudotuberculosis при различных способах введения

После заражения исходным штаммом Y. pseudotuberculosis 85 все лабораторные мыши пали в течение 7 дней наблюдения (рис. 5).

Рис. 5. Выживаемость беспородных мышей после заражения мутантными штаммами Y. pseudotuberculosis.

Таким образом, установлено, что белки BamB и OmpH необходимы для поддержания целостности клеточной оболочки псевдотуберкулезного микроба, белки SurA и BamB необходимы для устойчивости к сыворотке крови. Утрата DegP ведет к накоплению в наружной мембране предположительно неправильно свернутых или поврежденных белков. Делеция генов surA, degP, bamB ведет к высокой степени аттенуации мутантных штаммов Y. pseudotuberculosis для беспородных мышей при подкожном, внутрибрюшинном и пероральном способах введения. Гены surA, degP, bamB представляют собой перспективные молекулярные мишени для создания вакцинных штаммов Y. pseudotuberculosis.

Финансирование. Исследование выполнено в рамках отраслевой научно-исследовательской программы Роспотребнадзора на 2021—2025 гг.: «Проблемно-ориентированные научные исследования в области эпидемиологического надзора за инфекционными и паразитарными болезнями».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.