Введение
В норме вагинальная микробиота характеризуется преобладанием видов Lactobacillus, на долю которых приходится 90—98% от общего состава микроорганизмов, содержащихся в слизистом отделяемом. Считается, что лактобактерии защищают экосистему влагалища, задействуя несколько механизмов: конкурентное устранение патогенных микроорганизмов, модуляцию иммунного ответа хозяина, выработку антибактериальных соединений, таких как молочная кислота, перекись водорода и бактериоцины, тем самым снижая риск развития инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), и бактериального вагиноза. Изменение микробной экосистемы влагалища здоровых женщин часто приводит к дефициту лактобактерий и обычно сопровождается избыточным ростом анаэробов [1—3].
На основании данных высокопроизводительного секвенирования вагинального микробиома было описано 5 основных групп бактериальных экосистем, обозначенных как I, II, III, IV и V [4]. Группы I—III, V характеризовались высоким содержанием лактобактерий с доминированием Lactobacillus crispatus, L. gasseri, L. iners и L. jensenii соответственно, тогда как группа IV отличалась низким содержанием видов Lactobacillus и увеличенным количеством и разнообразием анаэробных бактерий, таких как Gardnerella, Megasphera, Sneathia и Prevotella [2, 4, 5].
Помимо указанных 4 видов лактобактерий, которые могут доминировать в вагинальном микробиоме женщин, в некоторых работах были описаны и другие виды, такие как L. acidophilus, L. coleohominis, L. helveticus, L. plantarum, L. rhamnosus, L. salivarius и L. vaginalis [5—12]. Особенности распространения и индивидуальная роль разных видов лактобактерий в поддержании здоровья влагалищной экосистемы остаются неясными и продолжают быть предметом исследования. Было подмечено, что L. iners присутствует как у практически здоровых женщин, так и у женщин с вагинальным дисбактериозом, тогда как L. crispatus обычно определяют у здоровых женщин. Кроме того, основные виды вагинальных лактобактерий по-разному реагируют на экологические и физиологические состояния [3]. Таким образом, изучение распространения и количественная оценка лактобактерий на видовом уровне остаются актуальной задачей при изучении вагинальной экосистемы.
Следует отметить, что результативность исследований, посвященных анализу видового разнообразия лактобактерий, во многом зависит от методического подхода, использованного в исследовании, и особенностей применяемого инструментария. Информативность методов высокопроизводительного секвенирования ограничена в отношении минорных компонентов из-за узкого динамического диапазона технологии, а качество пробоподготовки сильно влияет на получаемый в результате состав. Эффективность методов ПЦР в реальном времени (qPCR), хорошо зарекомендовавших себя при обнаружении и количественном определении многих микроорганизмов, во многом зависит от выбора мишени и подбора праймеров [13]. Эти причины приводят к противоречивым данным, полученным разными исследователями, и оставляют неопределенность в оценке видового разнообразия и количественных пропорций вагинальных лактобактерий, что препятствует выяснению роли индивидуальных видов лактобактерий в поддержании здорового равновесия в вагинальном биоценозе.
В настоящем исследовании мы использовали метод количественной ПЦР для изучения распространения и количественного состава различных видов вагинальных лактобактерий у женщин РФ с различными физиологическими и дисбиотическими состояниями микробиоценоза влагалища.
Материал и методы
Проведено ретроспективное исследование вагинальных мазков, поступавших в лабораторию ООО «НаноДиагностика» (Москва, Россия) для детекции вагинальных инфекций методом ПЦР в 2013—2016 гг. Общий объем выборки составил 840 образцов, которые поступали из медицинских организаций гинекологического профиля нескольких городов центральной части России, которые включали в себя Москву (128), Королев Московской области (307), Иваново (153), Чебоксары (252). Мазки были взяты как у пациенток стационара, так и от практически здоровых женщин, проходивших профилактическое обследование. Не имели сопутствующей медицинской информации 499 мазков. Среди медицинских причин обращения к врачу были заболевания влагалища и органов малого таза различной природы, этиологии и локализации. Мы не ставили себе задачей изучение микробиот у женщин с какой-либо конкретной клинической патологией. Напротив, мы стремились включить в исследование пациенток с разнообразными патологическими состояниями.
Нуклеиновые кислоты из клинического материала выделяли методом лизиса с протеиназой K, как описано ранее [14].
Определение общего содержания бактерий — общей бактериальной массы (ОБМ), проводили методом количественной ПЦР в реальном времени с SYBR Green в реакции амплификации высоко консервативного участка гена 16S рРНК.
Относительное содержание лактобактерий оценивали с помощью лактобактериального индекса (ЛИ), который отражал отношение общего количества лактобацилл к ОБМ.
Детекцию и дифференциацию лактобактерий проводили методом ПЦР в реальном времени с использованием тест-систем для научного применения «Лактокомплекс», «Лактоспектр_rplK» и «Лактоспектр_tuf» (ООО «НаноДиагностика», Москва, Россия). Характеристика тест-систем приводится в табл. 1. Тест-система «Лактокомплекс» позволяет определять общее содержание вагинальных лактобактерий. Она содержит один Taqman-зонд, который гомологичен ДНК 8 видов лактобактерий. Тест-системы «Лактоспектр_rplK» и «Лактоспектр_tuf» амплифицируют разные мишени и сконструированы по мультиплексному принципу. Каждая из систем в 2 независимых реакциях с разной специфичностью позволяют определять в общей сложности 12 видов лактобактерий, потенциально способных колонизировать вагинальный микробиоценоз (см. табл. 1).
Таблица 1. Специфичность тест-систем для индикации и дифференциации лактобактерий
| Тест-система | Мишень | Зонды | Виды детектируемых лактобактерий | Источник |
| «Лактокомплекс» | rplK | PbLacAA | L. acidophilus L. crispatus L. gasseri L. helveticus L. iners L. jensenii L. johnsonii L. kefiranofaciens | Demkin и соавт., 2017 [14] |
| «Лактоспектр_rplK» | rplK | PbLcr | L. crispatus | Demkin, Koshechkin, 2017 [15] |
| PbLin | L. iners | |||
| PbLje | L. jensenii | |||
| PbLjoga | L. gasseri L. johnsonii | |||
| PbLaci | L. acidophilus | |||
| PbLhe | L. helveticus L. acetotolerans L. amylovorus L. gallinarum L. kefiranofaciens | |||
| «Лактоспектр_tuf» | tuf | Pb LcriCD | L. acidophilus L. amylovorus L. helveticus L. crispatus | Данная работа |
| Pb LinCIr | L. iners | |||
| Pb LjenCE | L. jensenii | |||
| Pb LgasCDCE | L. gasseri | |||
| Pb LjonCDCE | L. johnsonii | |||
| Pb LvagCDCR | L. vaginalis |
ПЦР проводили в объеме 30 мкл с использованием амплификатора BioRad CFX 96. Программа амплификации: 95 °C в течение 3 мин, затем 40 циклов по 95 °C в течение 10 с и 60 °C в течение 30 с.
Результаты
Тестирование 840 проб на ОБМ продемонстрировало широкий диапазон содержания бактериальной ДНК. Из них 16 проб имели низкое содержание ДНК (<104 копий/реакцию). Эти пробы в дальнейшем были исключены из общей статистики. Системой «Лактокомплекс» лактобактерии не были выявлены в 16 (1,9%) пробах, а в 824 пробах их содержание варьировало от 50 до 108 копий/реакцию. При этом во многих пробах без лактобактерий общее содержание бактерий было сравнимо с другими пробами, в которых лактобактерии уверенно детектировались, то есть отсутствие лактобактерий не было связано с качеством взятия и преаналитической обработкой образца. Более того, в 16 пробах с низким содержанием бактериальной ДНК в 12 случаях лактобактерии в последующем были выявлены и протипированы.
Лактоположительные пробы (824) типировали системой «Лактоспектр_rplK». Результаты приведены в табл. 2. Частоты выявления разных видов лактобактерий системой «Лактоспектр_rplK» приведены в табл. 3 и 4. Чаще всего выявляли L.iners (51,2%) и L.crispatus (43%). Заметно реже выявляли L. jensenii (18,3%) и L. gasseri/L. johnsonii (7,9%). Другие виды лактобактерий выявляли крайне редко (см. табл. 3). Четырнадцать проб, положительных с зондом группы L. helveticus, L. amylovorus, L. gallinarum, L. acetotolerans и L. kefiranofaciens (см. табл. 3), демонстрировали нетипичное проявление кривой флуоресценции. Во всех 14 положительных пробах сигнал проявлялся как дополнительная кривая с сигналами других видов лактобактерий (см. табл. 4), при этом форма кривой для зонда группы L. helveticus имела пологий вид с низким уровнем максимального разгорания на фоне высоких сигналов других видов лактобактерий и положительного контроля. Примечательно, что во всех 14 случаях доминирующим видом лактобактерий в этих пробах был L. crispatus, при этом в 3 случаях был выявлен еще 1 вид, а в 2 случаях — еще 2 вида лактобактерий.
Таблица 2. Пробы, в которых были выявлены лактобактерии
| Кол-во выявленных видов в пробе | Количество проб | % от общего количества проб |
| 1 вид | 617 | 74,9 |
| 2 вида | 168 | 20,4 |
| 3 вида | 15 | 1,8 |
| 4 вида | 2 | 0,2 |
| Не типировались | 22 | 2,7 |
| Всего проб | 824 | 100 |
Таблица 3. Частоты выявления видов лактобактерий (система «Лактоспектр_rplK»)
| Виды Lactobacillus | Количество образцов | % |
| L. iners | 422 | 51,2 |
| L. crispatus | 354 | 43,0 |
| L. jensenii | 151 | 18,3 |
| L. gasseri/ L. johnsonii | 65 | 7,9 |
| L. helveticus, L. amylovorus, L. gallinarum, L. acetotolerans и L. kefiranofaciens | 14 | 1,7 |
| L. acidophilus | 1 | 0,1 |
| L. vaginalis | 1 | 0,5* |
| Не типировались | 22 | 2,7 |
| Всего проб | 824 | 100 |
Примечание. * — частота выявления определена в исследовании с «Лактоспектр_tuf».
Таблица 4. Частоты выявления одновременно нескольких видов лактобактерий (система «Лактоспектр_rplK»)
| Виды Lactobacillus | Количество видов | Количество образцов | % |
| L. iners + L. jensenii | 2 | 80 | 9,7 |
| L. iners + L. gasseri/L. johnsonii | 2 | 5 | 0,6 |
| L. iners + L. crispatus | 2 | 51 | 6,2 |
| L. jensenii + L. gasseri/L. johnsonii | 2 | 3 | 0,4 |
| L. jensenii + L. crispatus | 2 | 16 | 1,9 |
| L. crispatus +L. gasseri/L. johnsonii | 2 | 4 | 0,5 |
| L. crispatus +группа L. helveticus | 2 | 9 | 1,1 |
| L. iners + L. jensenii + L. crispatus | 3 | 9 | 1,1 |
| L. iners + L. gasseri/ L. johnsonii + L. crispatus | 3 | 1 | 0,1 |
| L. iners + L. jensenii + L. gasseri/L. johnsonii | 3 | 1 | 0,1 |
| L. iners + L. crispatus+группа L. helveticus | 3 | 2 | 0,2 |
| L. jensenii + L. crispatus+группа L. helveticus | 3 | 1 | 0,1 |
| L. jensenii + L. gasseri/ L. johnsonii + L. crispatus | 3 | 1 | 0,1 |
| L. iners + L. jensenii+ L. crispatus + группа L. helveticus | 4 | 2 | 0,2 |
| Всего проб | — | 824 | — |
Около 3% проб в использованных системах не типировались, несмотря на наличие положительного сигнала при анализе системой «Лактокомплекс». При выявлении 2 и более видов в качестве одного из партнеров группы чаще всего выступал либо вид L.iners, либо вид L.jensenii (см. табл. 4).
В 75% случаев доминировал только один вид лактобактерий и в 25% — от 2 до 4 видов (см. табл. 2). В пробах с двумя видами лактобактерий в качестве одного из компонентов фигурировали L. iners (81%), L. jensenii (59%), L. crispatus (48%), а в пробах с тремя и четырьмя видами — L. iners (88%), L. jensenii (82%), L. crispatus (82%). L.gasseri одновременно с другими видами лактобактерий встречался относительно редко — в 7—18%.
Были дополнительно проанализированы тест-системой «Лактоспектр_tuf»202 пробы из общей выборки (данные не приведены). В большинстве случаев результаты определения видов лактобактерий системой «Лактоспектр_tuf» подтвердили данные, полученные системой «Лактоспектр_rplK». Различия касались нескольких случаев, когда одна из систем определяла предельно низкие концентрации L. iners, L. crispatus, и L. jensenii, а другая система их не определяла. Это, по-видимому, связано с незначительными различиями в чувствительности реакций. Пробы, положительные по L. gasseri+L. johnsonii в системе «Лактоспектр_rplK», все были положительными в системе «Лактоспектр_tuf» как L. gasseri. Другими словами, микроорганизм, который в системе «Лактоспектр_rplK» мы не могли дифференцировать между L. gasseri и L. johnsonii, в системе «Лактоспектр_tuf» всегда типировался как L. gasseri.
В дополнение к результатам «Лактоспектр_rplK» в системе «Лактоспектр_tuf» в одной пробе был выявлен в минорных количествах вид L. vaginalis, что составило 0,5% от тестированных проб.
Таким образом, результаты идентификации видов в двух системах в случаях заметного содержания лактобактерий практически совпали. Выявленные несовпадения касались только случаев, связанных с различиями в специфичности тест-систем (напр., L. acidophilus, L. vaginalis, группы видов L. helveticus, L. amylovorus, L. gallinarum, L. acetotolerans и L. kefiranofaciens), либо когда выявляемый в одной из систем вид присутствовал в предельно низкой концентрации, что позволяло объяснить конкордатные данные различиями в чувствительности тест-систем.
По результатам поиска корреляции видового разнообразия лактобактерий с возрастом или регионом проживания пациенток, зависимости не обнаружено.
Мы определили связь между частотой выявления отдельных видов лактобактерий (L. crispatus, L. iners, L. gasseri, L. jensenii) и вариантами микробиоценоза влагалища. На основании определения ЛИ пробы были классифицированы по трем категориям: нормоценоз, умеренный дисбиоз, выраженный дисбиоз. Использовали 2 варианта пороговых значений, разделяющих указанные категории: 80 и 20%, которые использовались ранее в некоторых исследованиях [9, 12], и 70 и 30%, которые, на наш взгляд, лучше соответствуют физиологическим и популяционным вариациям. Для обоих пороговых значениях были получены практически идентичные показатели. Данные для значений 70 и 30% приведены в табл. 5.
Таблица 5. Частоты выявления видов лактобактерий при разных состояниях вагинального микробиоценоза
| Биоценоз Лактоиндекс (Лакт/Бакт), % | Количество образцов | L.crispatus | L.iners | L.jensenii | L.gassery | Индекс L.crispatus/L.iners | Не типировались |
| Выраженный дисбиоз ЛИ <=30 | 142 | 34 | 92 | 14 | 13 | 2,7 | 14 |
| % | — | 0,24 | 0,65 | 0,10 | 0,09 | — | 0,10 |
| Умеренный дисбиоз ЛИ >=30 и <=70 | 155 | 53 | 97 | 31 | 15 | 1,8 | 2 |
| % | — | 0,34 | 0,63 | 0,20 | 0,10 | — | 0,01 |
| Нормоценоз ЛИ >=70 | 376 | 209 | 146 | 70 | 17 | 0,7 | 5 |
| % | — | 0,56 | 0,39 | 0,19 | 0,05 | — | 0,01 |
Анализ взаимосвязи между встречаемостью видов лактобактерий и различным состоянием вагинального биоценоза показал (табл. 5), что в образцах, отнесенных к категории нормоценоз (ЛИ >70%), преимущественно распространены L. crispatus, тогда как распространение L. iners было ассоциировано с умеренным и выраженным дисбиозом. Особенно это заметно при расчете индекса L.crispatus / L.iners, который меняется почти в 4 раза от 0,7 при нормоценозе к 2,7 при выраженном дисбиозе (см. табл. 5). Присутствие L. jensenii и L. gasseri с низкой частотой можно обнаружить во всех трех категориях с равной вероятностью (см. табл. 5).
Обсуждение
Лактобактерии являются ключевым компонентом вагинального биоценоза. Их высокое содержание рассматривается как показатель нормоценоза. Напротив, их снижение свидетельствует о дисбиотических процессах. В норме абсолютное количество лактобацилл практически не отличается от общего количества бактерий и составляет 106—108 клеток на мл.
В нашем исследовании наиболее распространенными видами лактобактерий были L. iners (51,2%) и L. crispatus (43%), которые с учетом совместного присутствия встречались в 85% образцов. Менее распространенными видами были L. jensenii (18,3%) и L. gasseri (7,9%). Остальные виды либо встречались редко, либо их содержание было настолько низким, что не определялось используемыми методами. В 2% вагинальных проб лактобактерии не были обнаружены. Выявленное распределение соответствует ранее опубликованным группам разнообразия вагинальных микробиот человека, обозначенным как I—V [4], и многочисленным работам, которые, несмотря на некоторые количественные различия для индивидуальных видов, в целом указывают на L. iners и L. crispatus как на самые распространенные в вагинальных биоценозах виды, и L. gasseri и L. jensenii как менее распространенные, но все же встречающиеся с заметной частотой [13].
Что касается других видов лактобактерий, то мы обнаружили только по 1 образцу, содержащему L. acidophilus (0,1%) и L. vaginalis (0,5%). Низкая распространенность как этих, так и других видов лактобактерий в вагинальных микробиотах продемонстрирована в большинстве работ, выполненных методами высокопроизводительного секвенирования [16—18]. Однако в ряде работ, наряду с упомянутыми основными видами, иногда сообщают о выявлении в вагинальном биоценозе и других видов лактобактерий, таких как L. vaginalis, L. acidophilus, L. helveticus и др. в достаточно высокой пропорции [5—8, 11], в том числе в популяции российских и белорусских женщин [9, 10, 12]. В частности, распространение L. vaginalis в популяции российских и белорусских женщин отмечалось на уровне 18,3% [9], 40% [12], 16,6% [10]. Мы считаем, что такие противоречивые данные вызваны методическими особенностями работ, в частности различиями в чувствительности и специфичности использованных тест-систем, и условиями выполнения анализа, а также особенностями контингентов обследованных женщин.
Тест-система «Лактоспектр_rplK», определяющая L. gasseri и L. johnsonii как один маркер, не позволяет дифференцировать эти виды. Однако типирование системой «Лактоспектр_tuf» показало, что все тестированные положительные образцы (31 образец) содержали лактобактерии вида L. gasseri, а не L. johnsonii. Таким образом, наши данные подтверждают, что именно L. gasseri является одним из основных лактобактериальных компонентов вагинального микробиоценоза.
В целом показатели частот встречаемости L. iners и L. crispatus были близки показателям, полученным другими исследователями при обследовании российских и белорусских женщин методом ПЦР в реальном времени [9, 10, 12]. Частота выявления L. jensenii и L. gasseri в нашем случае были близки показателям для нормоценоза в работе белорусских авторов [10], и значительно ниже, чем в работах российских авторов — 18,3 и 7,9% против 43 и 36% [12] и против 32,1, 19,2%, [9]. Эти различия могут быть объяснены совокупностью нескольких причин: географической удаленностью регионов проживания пациентов — Московский регион, Иваново, Чебоксары против Санкт-Петербурга [12] и Екатеринбурга [9], Минска [10], различиями в контингентах обследованных женщин, специфичностью использованных тест-систем.
В литературе активно обсуждается тема превалирования L.iners при вагинальных дисбактериозах и L.crispatus, напротив, при вагинальных нормоценозах. Наличие L. crispatus признано важным маркером здоровья влагалища, тогда как доминирование L. iners может служить индикатором нарушения биоценоза влагалища [1—3].
В наших исследованиях мы выявили статистически значимую связь между преобладанием видов L. iners и L. crispatus и уровнем лактобактерий, определяемую как показатель ЛИ. В образцах с высоким ЛИ преобладал вид L. crispatus, в то время как в образцах с низким ЛИ доминировал L. iners. Однако следует подчеркнуть, что эти данные отражают статистическое распределение встречаемости видов в группах пациентов с разным ЛИ, тогда как индивидуально L. iners встречается в образцах с высоким уровнем лактобактерий, а L. crispatus — в образцах с низким уровнем лактобактерий.
Мы также обнаружили, что вид L. iners практически всегда присутствует в микробиотах, в которых преобладает несколько видов лактобактерий (см. табл. 4). Вид L. jensenii чаще встречается в состоянии «умеренного дисбиоза», что позволяет предположить его временную роль и возможность доминирования только при отсутствии других видов, таких как L. crispatus или L. iners. Не удалось установить ассоциацию между присутствием L. gasseri и каким-либо критерием. Однако факт того, что он редко образует пары с другими лактобактериями, свидетельствует о его способности самостоятельно доминировать во влагалищной микрофлоре, что может играть определенную роль в микробиоценозе репродуктивной системы женщин.
Заключение
Состояние микробиоценоза влагалища у женщин репродуктивного возраста при всем многообразии регионов проживания, возраста и состояния здоровья органов малого таза характеризуются относительно скудным разнообразием доминирующих видов лактобактерий. В общей сложности у 97% женщин в составе вагинального биоценоза были выявлены только 4 вида лактобактерий — L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri. При этом наибольшая доля приходилась на виды L. iners и L. crispatus, в меньшей степени L. jensenii, и в еще меньшей степени L. gasseri. При относительно высоком содержании в микробиоте лактобактерий (ЛИ >70%) большее распространение имеет вид L. crispatus, в то время как в образцах с низким ЛИ (<30%) большее распространение имеет L. iners.
Финансирование работы. Финансирование работы отсутствует.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.