Введение

Вирусы леса Семлики (SFV) и чикунгунья (CHIKV) относятся к семейству Togaviridae, род Alphavirus (Viruses; Riboviria; Orthornavirae; Kitrinoviricota; Alsuviricetes; Martellivirales; Togaviridae; Alphavirus https://ictv.global/taxonomy). Семейство Togaviridae включает в себя небольшие РНК-содержащие вирусы, геном которых состоит из одноцепочечной (+) РНК размером 9.7—11.8 kb [1]. Род Alphavirus в настоящее время состоит из 32 видов вирусов, которые переносятся комарами, патогенны для позвоночных хозяев и способны вызывать заболевания как человека, так и домашних животных. Представители рода разделяются на 7 основных комплексов: восточного энцефалита лошадей, Венесуэльского энцефалита лошадей, западного энцефалита лошадей, леса Семлики, Миддельбург, леса Барма, Ндуму (https://ictv.global/report/chapter/togaviridae/togaviridae). Филогения подразделяет эти вирусы на три основных клады [2, 3]. Причем к одной из клад относятся вирусы четырех комплексов, включая комплекс вирусов леса Семлики и вирус чикунгунья.

Вирус чикунгунья первоначально был обнаружен и выделен в 1952—1953 гг. в восточной Африке на территории южной Танганьики (современная Танзания) во время вспышки денге-подобного заболевания [4—6]. Вирус вызывает у человека лихорадку, сопровождающуюся кожной сыпью, болями в мышцах и артральгиями. Инкубационный период составляет 4—7 дней. Заболевание могло продолжаться до месяца [7, 8]. Исход, как правило, доброкачественный, но у пожилых людей, имевших сопутствующие заболевания, регистрировались летальные исходы [9—12]. Вспышки лихорадки CHIKV у человека начали регистрироваться с 1958 г. в странах Африки. В качестве переносчиков выступали несколько видов комаров Aedes: A. taylori, A. furcifer, A. dalzieli, A. vittatus, A. africanus, и A. luteocephalus. До 2004 г. CHIKV привлекал мало внимания, поскольку было известно, что он вызывал небольшие локальные вспышки заболеваний. Позднее случаи заболевания лихорадкой чикунгунья стали регистрироваться в Индии, Юго-Восточной Азии и островах Индийского океана, где их возникновение предположительно ассоциировалось с комарами A. aegypti, а затем и с A. albopictus. Крупная вспышка лихорадки CHIKV была зарегистрирована на островах Индийского океана и Индийского субконтинента в 2005—2006 гг., и именно после этой вспышки возникло повышенное внимание к этому вирусу. В настоящее время случаи заболевания регистрируются фактически глобально в странах Африки, Юго-Восточной Азии, Южной и Центральной Америки, в том числе и на Карибских островах. В Северной Америке и Европе преимущественно регистрируются завозные случаи [3, 13—15]. Первые вспышки лихорадки чикунгуньи в Азиатском регионе в 1963 и 1973 гг., вероятно, были связаны с появлением новых геновариантов вируса, способных более эффективно реплицироваться в комарах [16]. Вторая волна заболеваний в 2005—2006 гг. ассоциируется с появлением новых мутаций, обеспечивших репликацию вируса в комарах A.albopictus и A.aegypti, что привело к практически глобальному распространению азиатского генотипа CHIKV [14, 17]. В последние десятилетия комары рода Aedes стали обнаруживаться в ряде стран Черноморского бассейна (Болгария, Грузия, юг Российской Федерации, Румыния, Турция).

Вирус леса Семлики был выделен в 1942 г. в Уганде из пула комаров рода Aedes [18—20]. При этом было продемонстрировано наличие антител к этому вирусу у местных жителей, однако первоначально выявить случаи заболевания у человека не удалось. Несколько позднее были описаны первые случаи заболевания человека со смертельным исходом [21]. Тем не менее SFV считается относительно безопасным вирусом для человека и широко используется для проведения научных исследований с целью создания диагностических препаратов, вакцин, противоопухолевых препаратов, а также в качестве вектора для генной терапии.

Цель настоящей работы — попытка восстановить архивные штаммы CHIKV и SFV, датируемые серединой прошлого века, исследовать их культуральные свойства и патогенность для лабораторных животных, провести определение полногеномных последовательностей этих изолятов, выполнить анализ их филогенетических взаимоотношений с современными изолятами CHIKV и SFV. Эти данные могут быть полезны для понимания особенностей эволюции альфавирусов и их геномов в современном мире, а также оценки потенциальных угроз для общественного здравоохранения.

Материал и методы

Вирусы. Вирус леса Семлики, штамм Smithburn, выделенный в 1942 г. в Уганде в лесу Семлики (Semliki Forest) от комаров, и вирус Chikungunya, штамм Ross late (4669), выделенный в 1953 г. в южной провинции Танганьики (Танзания с 1964 г.) от человека, были любезно предоставлены Dr. J. Casals (США) в 1960 и 1964 гг. соответственно. Ампулы с лиофильно высушенными вируссодержащими материалами были приготовлены в 1961 и 1965 гг. после пассажа на сосунках белых мышей массой тела 6—7 г. Далее ампулы хранились без их вскрытия в низкотемпературном холодильнике. С 1991 г. их хранение проводилось при температурном режиме –70 °C до момента проведения настоящего исследования в ГНЦ ВБ «Вектор».

Клеточные культуры. Культивирование вирусного материала осуществлялось на клетках C6/36, Vero E6, 293 и СПЭВ из коллекции культур клеток ГНЦ ВБ «Вектор» с использованием среды DMEM (Gibco, UK), содержащей 10% сыворотки плода коровы (Gibco, UK) и 80 мкг/мл сульфата гентамицина. Инфекционная активность вирусных препаратов определялась на клетках C6/36 через 2 сут, как описано нами ранее [22].

Животные. Мыши линии BALB/c массой тела 20—25 г были подкожно инфицированы различными дозами вирусов с использованием 5 животных для каждого разведения вирусного препарата. Животные были получены из вивария ГНЦ ВБ «Вектор». Все манипуляции с животными проводили с использованием общей анестезии в соответствие с решением биоэтического комитета (ГНЦ ВБ «Вектор», протокол 02—05 от 15 мая 2020 г.)

Проведение ОТ ПЦР. Выделение РНК проводилось из 100 мкл вируссодержащего материала с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК/РНК (НПФ «Литех», Россия). Реакция обратной транскрипции была выполнена с помощью набора «Реверта-L» («АмплиСенс», Россия) согласно инструкции производителей. ПЦР проводилась с помощью Taq-ДНК-полимеразы (BIORON, Германия) в соответствующем буфере. Для выявления вирусной РНК использовались оригинальные олигонуклеотидные праймеры, специфичные для генома SFV и CHIKV (таблица). Реакция проводилась в амплификаторе Т100 ThermalCycler (Bio-Rad, США) со следующими температурными параметрами: 95 °C — 2 мин, 94 °C — 15 с, 52—60 °C — 20 с, 72 °C — 30—50 с (40 циклов), 72 °C — 5 мин. Анализ продуктов амплификации проводился в 2% агарозном геле в однократном буфере TAE (40 мМТрис, 1 мМNa₂ЭДТА, уксусная кислота). Для выделения продуктов амплификации из геля использовался набор для элюции ДНК из агарозного геля (ООО «БиоСилика», Россия).

Олигонуклеотидные праймеры, использованные в исследовании

Определение нуклеотидных последовательностей ДНК. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводилось с использованием автоматического секвенатора ABI PRISM3500 GeneticAnalyzer (AppliedBiosystems, США) и набора реактивов BigDyeTerminatorv3.1 CycleSequencingKit (AppliedBiosystems, США). Вторую цепь ДНК готовили NEBNext набором # E7530 (NEB) и образцы анализировали NGSMiSeq с использованием технологии Illumina. Cutadapt (версия 1.18) и SAMtools (версия 0.1.18) использовали для удаления адаптеров Illumina и повторного чтения. Геномные последовательности были собраны de novo с использованием ассемблера MIRA (версия 4.9.6).

Нуклеотидные последовательности сравнения были взяты из базы данных GenBank. Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили при помощи приложения AlignX программного пакета Vector NTI 11 (InforMax). Филогенетический анализ проводили при помощи программы Mega 7 [23].

Световая и электронная микроскопия. Для анализа использовались культуры клеток и головной мозг инфицированных животных. Микроскопия проводилась, как описано нами ранее [24]. Все исследования проводили с соблюдением правил биобезопасности, регламентированных в СанПиН 3.3686—21.

Результаты и обсуждение

Культивирование и идентификация вируса. Образец CHIKV после хранения более 55 лет был использован для инфицирования культур клеток C6/36. Наблюдался выраженный цитопатический эффект (ЦПД) через 24—48 ч после инфицирования клеток. С помощью ОТ ПЦР было подтверждено наличие в образце CHIKV. При культивировании образца на клетках Vero E6 ЦПД наблюдалось уже через 24 ч. Проведение ОТ ПЦР с праймерами для консервативной области генома альфавирусов позволило обнаружить фрагмент гена nsP4 SFV. Методом предельных разведений на культуре Vero E6 был выделен изолят SFV, названый нами штаммом Tanzania 53. Этот штамм вызывал развитие ЦПД на культурах клеток Vero E6 и СПЭВ уже через 24 ч, а после инфицирования клеток C6/36 и HEK 293 — через 48 ч.

Гистологические исследования. Выделенным изолятом SFV были заражены мыши линии BALB/c для оценки его возможной патогенности. При подкожном заражении мыши заболевали с клинической картиной, характерной для поражения центральной нервной системы, а именно с развитием парезов и параличей у инфицированных животных. Гистологическое исследование выявило умеренное поражение печени и значительные патоморфологические изменения в тканях головного мозга (рис. 1).

Рис. 1. Гистологическое исследование органов мышей, инфицированных подкожно штаммом Tanzania 53 вирусом леса Семлики. Окраска гематоксилином и эозином.

а — вакуолизация цитоплазмы в ткани печени мыши, инфицированной дозой вируса 107 ТЦПД50/мл, 4 сут после заражения мышей. Использовали 400-кратное увеличение; б — вакуолизация цитоплазмы в ткани головного мозга мыши, инфицированной дозой вируса 106 ТЦПД50/мл. SFV, 7 сут. 200-кратное увеличение; в — очаги периваскулярной инфильтрации в ткани головного мозга мыши, инфицированной дозой вируса 106 ТЦПД50/мл SFV, 10 сут. 200-кратное увеличение; г — очаг некроза в ткани головного мозга мыши, инфицированной дозой вируса 106 ТЦПД50/мл. SFV, 10 сут. 100-кратное увеличение.

В тканях мозга наблюдалась вакуолизация серого вещества, рассеянные диффузные и периваскулярные инфильтрации в различных отделах мозга. При этом обнаружены очаги некроза и деструкции ткани серого и белого веществ головного мозга. Ранее было описано, что многие альфавирусы, в том числе CHIKV и SFV, способны реплицироваться в клетках нервной ткани млекопитающих [10, 11]. При этом некоторые штаммы SFV вызывают тяжелые энцефалиты при инфицировании животных и людей [21]. Наблюдаемые поражения головного мозга мышей соответствовали описанной ранее картине заболевания для этой инфекции.

Определение нуклеотидных последовательностей и их анализ. Наличие генетического материала CHIKV в исследуемом архивном образце было первоначально подтверждено ОТ ПЦР. Полученные ампликоны частично секвенировали методом Сэнгера, а полный геном NGS секвенированием (MG280943). Анализ полногеномной последовательности показал фактическую идентичность со штаммами Ross-секвенированными в Великобритании (AF490259) и США (HM045811). История английского изолята не опубликована, а американский вариант был выделен в 1953 г. от больного человека и прошел небольшое количество пассажей в лаборатории [25]. Характерной особенностью генома этих изолятов является наличие внутреннего поли-A-сайта на 3’-UTR генома различной протяженности для различных клонов одного штамма вируса. Внутренний поли-A-сайт также был найден в изоляте S27 (AF369024), выделенного от больного человека с использованием C6/C36 клеток комара, и изолята A301 (HM045821), который был изолирован 1963 г. от рукокрылых [25, 26]. У изолята A301 CHIKV его длина составляет 51 нуклеотид, а максимальная его длина может составлять 106 н.о. Уровень гомологии этих изолятов составлял 98,2—99,82%, что говорит о высоком консерватизме генома CHIKV, учитывая при этом возможную вариабельность длины внутреннего поли-A-сайта. Интересно отметить, что поиск внутреннего поли-A-сайта на 3’-UTR генома показал его отсутствие для 80 выделенных позднее изолятов CHIKV [25]. Нам также не удалось выявить мутаций в генах E1 (K211E, A226V) и E2 (V264A) с которыми ассоциируется появление у CHIKV способности более эффективно реплицироваться в комарах A. albopictus и A. aegypti. Была высказана гипотеза, что именно эти мутации обеспечили быстрое распространение CHIKV в бассейне Индийского океана и в странах Азии, прилегающих к нему [3].

Результаты проведенного филогенетического анализа представлены на рис. 2. Секвенированный изолят CHIKV был получен от больного человека в 1953 г. [6]. Его полногеномная последовательность кластеризуется с несколькими ранними африканскими изолятами периода 50—60 годов прошлого столетия и, безусловно, относится к африканскому генотипу CHIKV [3, 25, 27]. Африканский генотип подразделяется на две основные группы изолятов: западно-африканский и юго-восточный африканский генотип (ECSA, East/Central/South African) CHIKV. Секвенированный нами архивный изолят CHIKV генотипируется как один из ранних вариантов ECSA генотипа. Именно с этой группой ECSA изолятов филогенетически близко связана группа более ранних изолятов индийского генотипа, датируемая началом шестидесятых годов прошлого века.

Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное по полногеномным последовательностям CHIKV методом объединения ближайших соседей с использованием 2-параметрической модели Кимура.

Секвенированный нами штамм CHKIV обозначен символом ▲. Номера депонированных в GenBank последовательностей представлены в скобках. ?* — последовательность депонирована в 2002 г., обновлена в 2011 г.; ** — штаммы CHIKV, изолированные во время последней вспышки лихорадки.

Существование общего предшественника для этих двух африканских генотипов предположительно соотносят с 1713 (1573—1840) годом [25]. Методом молекулярных часов предшественник ECSA-вариантов датируется 1935 г., а в 1964 г. уже были обнаружены изоляты ECSA без внутреннего поли-A-сайта в 3’-UTR. Видимо, произошло отделение азиатского варианта CHIKV, который позднее был ассоциирован с первой большой вспышкой лихорадки CHIKV в Индии в 2005—2008 гг. [3]. Именно эти ECSA-варианты широко распространились в Африке, Азии, Европе и Америке, фактически предопределив глобальное распространение CHIKV [28]. Приблизительно 10 лет спустя в Азии возникла вторая большая вспышка лихорадки CHIKV, вызванная вариантами ECSA-генотипа [29]. Интересно отметить, что она была вызвана вариантами CHIKV, лишенными мутации A226V в гене E1 CHIKV.

Нами также были определены полные нуклеотидные последовательности генома SFV для штаммов Tanzania 53 (MK280688) и Smithburn (MT121983). Штамм Tanzania 53 был изолирован из архивного образца, содержащего CHIKV после более чем 55-летнего хранения, а штамм Smithburn через 59 лет хранения без проведения пассажей. Филогенетический анализ полногеномных последовательностей SFV показал, что эти штаммы относятся к двум различным филогенетическим ветвям внутри африканского генотипа SFV (рис. 3). При этом полногеномные последовательности SFV, выделенные в восточной Африке (Кения) в 2009—2010 гг., также формируют отдельную филогенетическую группу в пределах африканского генотипа SFV. Это позволяет предположить наличие не менее трех различных филогенетических групп в пределах африканского генотипа SFV, циркулирующих в странах центральной и восточной Африки. Выделенный нами штамм Tanzania 53 SFV филогенетически обособлен от других известных вирусов и наиболее близок к предполагаемым вирусам-предшественникам, которые циркулировали на территории Восточной Африки в середине прошлого века. Этот изолят, по всей вероятности, может претендовать на роль вероятного вируса-предшественника для азиатского генотипа SFV. Это позволяет заключить, что два секвенированных африканских штамма SFV являются оригинальными и могут претендовать на роль вирусов-предшественников для африканского и азиатского генотипов SFV.

Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное по полногеномным последовательностям SFV методом объединения ближайших соседей с использованием 2-параметрической модели Кимура.

SFV, штаммы Tanzania 53 и Smithburn обозначены символом ▲, в качестве внешней группы сравнения использован CHIKV (MG280943). Номера депонированных в GenBank последовательностей представлены в скобках. * — время депонирования штамма в GenBank; ** — наличие вставки длиной 122 но в 3’-UTR; *** — M. Ferguson и соавт., 2015 [10].

Заключение

В ходе данной работы было проведено восстановление архивного штамма Ross late CHIKV после более чем 55-летнего хранения без проведения пассажей. Вирус был изолирован во время первой описанной вспышки лихорадки чикунгунья в восточной Африке в 1953 г. Установлено, что образец содержал два различных альфавируса: CHIKV и SFV. Вирусы были способны реплицироваться в культурах клеток C6/36, Vero E6, СПЭВ, HEK 293 с развитием ЦПД и сохранили свою патогенность для мышей BALB/c. Методом предельных разведений штамм SFV Tanzania 53 был отделен от штамма Ross late CHIKV. Типичная картина заболевания, вызываемая SFV у лабораторных животных, была подтверждена гистологическими исследованиями.

Определены полногеномные последовательности этих двух альфавирусов и восстановленного архивного образца SFV, датируемого 1942 г. Проведен их филогенетический анализ, который показал, что изолированные штаммы двух альфавирусов генотипируются как африканские и формируют отдельные ветки в пределах африканских генотипов на филогенетических деревьях CHIKV и SFV. Архивный CHIKV-изолят был отнесен к ECSA-генотипу.

Финансирование. Исследование выполнено в рамках государственного задания ФБУН «ГНЦ ВБ "Вектор"» Роспотребнадзора.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.