Новые генетические варианты возбудителя холеры и их распространение в эндемичных странах и России

Читать метаданные

На протяжении трех волн 7-й пандемии холеры геном возбудителя претерпел значительные изменения, вследствие которых в последнее десятилетие возникли его новые генетические варианты с высоким патогенным и эпидемическим потенциалом.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение геномного разнообразия возбудителя холеры и распространенности новых генетических вариантов в эндемичных по холере регионах и в России, выявление их филогенетических связей.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для поиска новых вариантов возбудителя проведен био-информационный анализ нуклеотидных последовательностей полных геномов 124 штаммов V. cholerae Эль Тор, полученных нами ранее и взятых из базы данных NCBI Gen Bank и European Nucleotide Archive. Филогенетические связи 115 различных штаммов, выделенных в Азии, Африке, России и Украине во время трех волн пандемии, установлены на основе SNP-анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ геномов штаммов (91 штамм), изолированных с 2007 по 2019 г. в семи эндемичных странах, показал, что по набору мутантных генов вирулентности и эпидемичности, локализованных в мобильных генетических элементах (профаг CTXφ, остров патогенности VPI-1 и остров пандемичности VSP-II) и коровой части, 74,7% из них являются новыми генетическими вариантами возбудителя. При анализе геномов токсигенных штаммов из России и Украины (1970—2014 гг.) выявлено пять групп, различающихся между собой мутациями в ключевых генах, связанных с вирулентностью, эпидемическим потенциалом и лекарственной устойчивостью. Среди штаммов, завезенных из эндемичных регионов в последние годы (2010—2014 гг.), 80,0% по спектру мутантных генов отнесены к новым вариантам.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ филогенетических связей, проведенный на основе SNP-типирования 115 штаммов, показал филогенетическое сходство новых вариантов из России и Украины с таковыми, циркулирующими в последнее десятилетие в Африке и Азии. Полученные результаты позволили выявить молекулярные механизмы и динамику изменения важнейших генетических свойств этого патогена, а также могут быть использованы для разработки способов генодиагностики новых вариантов возбудителя.

Ключевые слова:

Vibrio cholerae

новые генетические варианты

вирулентность

эпидемический потенциал

мутации

филогения

Авторы:

Смирнова Н.И.

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумной институт "Микроб"»

Рыбальченко Д.А.

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумной институт "Микроб"»

Плеханов Н.А.

ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет»

ORCID: 0000-0001-8945-775X

Лозовский Ю.В.

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"»

Федоров А.В.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр хирургии им. А.В. Вишневского» Минздрава России;
ООО «Российское общество хирургов»

ORCID: 0000-0002-8456-8685

Кутырев В.В.

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумной институт "Микроб"»

Дата поступления:

02.02.2022

Дата принятия в печать:

15.04.2022

Список литературы:

Kaper JB, Morris JG, Levine MM. Cholera. Clin Microbiol Rev. 1995;8(1):48-86. https://doi.org/10.1128/cmr.8.1.48
Chun J, Grim CJ, Hasan NA, Lee JH, Choi SY, Haleyet BJ, et al. Comparative genomics reveals mechanism for short-term and long-term clonal transitions in pandemic Vibrio cholerae Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106(36):15442-15447. https://doi.org/10.1073/pnas.0907787106
Olsvik O, Wahlberg J, Petterson B, Uhlén M, Popovic T, Wachsmuthet IK, et al. Use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit B in Vibrio cholerae O1 strains. J Clin Microbiol. 1993;31(1):22-25. https://doi.org/10.1128/jcm.31.1.22-25.1993
Kim EJ, Lee D, Moon SH, Lee CH, Kim DW. CTX prophages in Vibrio cholerae O1 strains. J Microbiol Biotechnol. 2014;24(6):725-731. https://doi.org/10.4014/jmb.1403.03063
Mutreja A, Kim DW, Thomson N. Evidence for multiple waves of global transmission within the seventh cholera pandemic. Nature. 2011;477(7365):462-465. https://doi.org/10.1038/nature10392
Weill F, Domman D, Njamkepo E, Tarr C, Rauzier J, Fawal N, et al. Genomic history of the seventh pandemic of cholera in Africa. Science. 2017;358(6364):785-789. https://doi.org|10.1126/science.aad5901
Monakhova EV, Ghosh A, Mutreja A, Weill F, Ramamurthy T. Endemic Cholera in India and Imported Cholera in Russia: What is Common? Problems of Particularly Dangerous Infections. 2020;3:17-26. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2020-3-17-26
Safa A, Nair GB, Kong RY. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010;18(1):46-54. https://doi.org/10.1016/j.tim.2009.10.003
Nair GB, Faruque SM, Bhuiyan NA, Kamruzzaman M, Siddique AK, Sack DA. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J Clin Microbiol. 2002;40(9):3296-3299. https://doi.org/10.1128/JCM.40.9.3296-3299.2002
Смирнова Н.И., Заднова С.П., Шашкова А.В., Кутырев В.В. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, завезенных на территорию России в современный период. Мол генетика, микробиол., вирусол. 2011;4:11-18. https://doi.org/10.3103/S0891416811030062
Mironova LV, Gladkikh AS, Ponomareva AS, Feranchuk SI, Bochalgin NO, Basov EA, et al. Comparative genomics of Vibrio cholerae El Tor strains isolated at epidemic complications in Siberia and at the Far East. Infect Genet Evol. 2018;60:80-88. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2018.02.023
Reimer AR, Domselaar GV, Stroika S, Walker M, Kent H, Tarr C, et al. Comparative Genomics of Vibrio cholerae from Haiti, Asia, and Africa. Emerg Infect Dis. 2011;17(11):2113-2121. https://doi.org/10.3201/eid1711.110794
Talkington D, Bopp C, Tarr C, Parsons MB, Dahour G, Freeman M, et al. Characterization of toxigenic Vibrio cholerae from Haiti, 2010—2011. Emerg Infect Dis. 2011;17(11):2122-2129. https://doi.org/10.3201/eid1711.110805.
Ghosh P, Sinha R, Samanta P, Saha DR, Koley H, Dutta S, al. Haitian variant Vibrio cholerae O1 strains manifest higher virulence in animal models. Front Microbiol. 2019;(10):111. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00111
Naha A, Mandal SR, Samanta P, Saha RN, Shaw S, Ghosh A, et al. Deciphering the possible role of ctxB7 allele on higher production of cholera toxin by Haitian variant Vibrio cholerae O1. PLoS Negl. Trop. Dis. 2020;14(4):e0008128. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0008128
Bhandari M, Jennison AV, Rathnayake IU, Huygens F. Evolution, distribution and genetics of atypical Vibrio cholerae — A review. Infect Genet Evol. 2021;89:e:104726. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2021.104726
Dziejman M, Balon E, Boyd D, Fraser CM, Heidelberg JF, Mekalanos JJ. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99(3):1556-1561. https://doi.org/10.3410/f.1004686.53905
Murphy SG, Johnson BA, Ledoux CM, Dörr T. Vibrio cholerae’s mysterious Seventh Pandemic island (VSP-II) encodes novel Zur-regulated zinc starvation genes involved in chemotaxis and cell congregation. PLoS Genet. 2021;17(6):e1009624. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009624
Taviani E., Grim C.J., Choi J. Chun J, Haley B, Hasan NA et al. Discovery of novel Vibrio cholerae VSP-II genomic islands using comparative genomic analysis. FEMS Microbiol. Lett. 2010;308(2):130-137. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2010.02008.x.
Okada K, Roobthaisong A, Nakagawa I, Hamada S, Chantaroj S. Genotypic and PFGE/MLVA analyses of Vibrio cholerae O1: geographical spread and temporal changes during the 2007—2010 cholera outbreaks in Thailand. PLoS ONE. 2012;8(1):1-10. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0030863
Смирнова Н.И., Заднова С.П., Агафонов Д.А. Шашкова А.В., Челдышова Н.Б., Черкасов А.В. Сравнительный молекулярно-генетический анализ мобильных элементов природных штаммов возбудителя холеры. Генетика. 2013;49(9):036-1047. https://doi.otg/10.7868/S0016675813090087
Dolores J, Satchell KJ. Analysis of Vibrio cholerae genome sequences reveals unique rtxA variants in environmental strains and an rtxA-null mutation in recent altered El Tor isolates. Mbio. 2013;4(2):1-9. https://doi.org/10.1128/mBio.00624-12
Kim HB, Wang M, Ahmed S, Park CH, LaRocque RC, Faruque ASG, et al. Transferable Quinolone Resistance in Vibrio cholerae. Antimicrob Agents Chemother. 2010;54(2):799-803. https://doi.org/10.1128/AAC.01045-09
Samanta P, Mandal RS, Saha RN, Shaw S, Ghosh P, Dutta S, et al. A Point Mutation in carR Is Involved in the Emergence of Polymyxin B-Sensitive Vibrio cholerae O1 El Tor Biotype by Influencing Gene Transcription. Infect Immun. 2020;88(5):e00080-20. https://doi.org/10.1128/IAI.00080-20
Hasan NA, Choi SY, Eppinger M, Clark PW, Chen A, Alam M, et al. Genomic diversity of 2010 Haitian cholera outbreak strains. Proc Natl Acad Sci. USA. 2012;109(29):2010-2017. https://doi.org/pnas.1207359109
Das MM, Bhotra T, Zala D, Singh DV. Phenotypic and genetic characteristics of Vibrio cholerae O1 carrying Haitian ctxB and attributes of classical and El Tor biotypes isolated from Silvassa, India. J Med Microbiol. 2016;65(8):720-728. https://doi.org/10.1099/jmm.0.000282
Хайтович А.Б., Петренко Е.В., Алексеенко В.В. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Vibrio cholerae O1/non O1, выделенных от людей при различных эпидемических процессах: Сборник трудов IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА 2017». Т. 1. М. 2017;343-344.
Ekeng E, Tchatchouang S, Akenji B, Issaka BB, Akintayo I, Chukwu C, et al. Regional sequencing collaboration reveals persistence of the T12 Vibrio cholerae O1 lineage in West Africa. Elife. 2021;18(10):e65159. https://doi.org/10.7554/eLife.65159
Son MS, Megli CJ, Kovacikova G, Qadri F, Taylor RK. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J Clin Microbiol. 2011;49(11):3739-3749. https://doi.org/10.1128/JCM.01286-11
Satchell KJF, Jones CJ, Wong J, Queen J, Agarwal S, Yildiz FH. Phenotypic Analysis Reveals that the 2010 Haiti Cholera Epidemic Is Linked to a Hypervirulent Strain. Infect Immun. 2016;84(9):2473-2481. Print 2016 Sep. https://doi.org/10.1128/IAI.00189-16

Закрыть метаданные

Семь известных пандемий холеры были вызваны токсигенными штаммами Vibrio cholerae серогруппы O1, относящимися к разным биотипам — классическому и Эль Тор. Возбудитель первых шести (1817—1923 гг.) был классического биотипа, тогда как текущая седьмая пандемия (с 1961 г. по настоящее время) связана с V. cholerae биотипа Эль Тор [1, 2]. Одно из основных различий биотипов состоит в том, что в состав их профагов CTXφ с опероном ctxAB, кодирующим холерный токсин (CT, от Cholera Toxin), входят различные аллели гена ctxB, определяющего биосинтез B-субъединицы CT. У вибрионов Эль Тор присутствует аллель ctxB3, у классических — ctxB1 [3, 4].

Холера Эль Тор эндемична в более чем 60 странах Азии, Африки и Америки. Эпидемии и вспышки холеры на этих территориях создают реальные риски ее завоза в другие регионы, включая Россию. Первичным очагом холеры Эль Тор и местом формирования нескольких генетических вариантов возбудителя считают Индийский субконтинент [5—7], откуда впоследствии происходило ее распространение по всему миру тремя перекрывающимися волнами [5]. На протяжении трех волн пандемии геном возбудителя холеры претерпел значительные изменения за счет горизонтального переноса генетического материала, геномных перестроек и точечных мутаций. Если первая волна пандемии холеры (1961—1990 гг.) была вызвана типичными штаммами возбудителя, содержащими профаг CTXφ^El ^Tor, то во время второй волны (1991—2001 гг.) доминирующими стали варианты с иной структурой генов вирулентности, относящиеся к генетически измененным, или атипичным штаммам [8]. Первые изменения возникли в результате приобретения типичными штаммами Эль Тор при горизонтальном переносе генов либо всего генома профага холерных классических вибрионов CTXφ^Class, либо его гена ctxB1 [9—11]. Однако в период 3 волны доминирующими стали штаммы, у которых дополнительная точечная мутация в гене ctxB1 (С58A) привела к появлению нового аллельного варианта ctxB7 [12]. Более того, после 2-й волны пандемии стали возникать атипичные штаммы, несущие мутации в генах разных мобильных элементов. Наиболее значимой для вирулентности оказалась мутация в гене tcpA, кодирующем основной белок ключевого фактора колонизации возбудителем тонкого кишечника (токсин-корегулируемых пилей, TCP от Toxin-Coregulated Pilus) и входящим в состав острова патогенности VPI-1 (от Vibrio Pathogenicity Island). В геноме ряда штаммов в результате замены A266G появился аллель гена tcpA — tcpA^CIRS¹⁰¹ [13]. Изменение структуры ключевых генов патогенности генетических вариантов привело к значительному усилению их вирулентности [14—16]. Нестабильным оказался и остров пандемичности VSP-II (от Vibrio Seventh Pandemic island), содержащий 30 генов (vc0498 — vc0517), с присутствием которого связывают способность штаммов к эпидемическому (пандемическому) распространению [17, 18]. Наряду со штаммами с интактным VSP-II в начале 3-й волны пандемии стали появляться атипичные штаммы, содержащие VSP-II с делецией ряда его генов [19—21]. Помимо мутаций в генах мобильных элементов у атипичных штаммов обнаружили мутации коровой области. Оказалось, что штаммы из 3-й волны отличались от изолятов из предыдущих волн, имеющих прототипный rtxA, кодирующий многофункциональный самопроцессирующий цитотоксин MARTX, присутствием в хромосоме его аллеля rtxA4 с null-мутацией, которая привела к образованию стоп-кодона и утрате биосинтеза этого токсина [22]. Кроме того, возникли две точечные мутации в генах gyrA (G248T) и parC (C254T), кодирующих топоизомеразу II (ДНК-гиразу) и топоизомеразу IV, что обеспечило формирование у патогена резистентности к налидиксовой кислоте [23]. К тому же мутация в регуляторном гене carR (G265A) привела к утрате устойчивости к полимиксину B — фенотипического маркера вибрионов Эль Тор [24].

Последовательное накопление этих мутаций в отдельных геномах привело к формированию новых вариантов возбудителя, возникших в последние несколько лет. Характерной их особенностью является сочетание точечных мутаций в генах ctxB, tcpA, rtxA, gyrA, parC с протяженной делецией в VSP-II. Следствием такой комбинации мутантных генов стало усиление вирулентности штаммов и высокая скорость их распространения, что обусловило вытеснение ими ранее возникших атипичных штаммов [14—16]. Впервые такие штаммы были обнаружены во время эпидемии холеры на Гаити в 2010 г. [25]. Однако позднее установили их присутствие в Индии в 2006 г. [26]. К настоящему времени новые варианты возбудителя обнаружены во многих эндемичных регионах. Учитывая нестабильность генома V. cholerae, представлялось важным исследовать генетическое разнообразие штаммов, выделенных в неблагополучных по холере странах, а также в России для понимания динамики изменения патогенного и эпидемического потенциала возбудителя, поскольку имеющиеся сведения остаются неполными. Кроме того, при реальном риске завоза из зарубежных стран новых вариантов в Россию представляло интерес изучить их распространение в последнее десятилетие в неблагополучных по холере регионах Азии и Африки, а также на территории нашей страны и прилежащих государств.

Цель работы — изучение геномного разнообразия возбудителя холеры и распространенности новых генетических вариантов в эндемичных по холере регионах и России, выявление их филогенетических связей.

Материал и методы

В работе использовали секвенированные нуклеотидные последовательности полных геномов 124 штаммов V. cholerae Эль Тор, полученных нами ранее (29 штаммов) и взятых из базы данных NCBI Gen Bank и European Nucleotide Archive (табл. 1). 29 штаммов были выделены в России (1970—2014 гг.) и Украине (1994 г., 1995 г., 2010 г., 2011 г.) [27], относящимся к неэндемичным по холере территориям, а 95 штаммов — в эндемичных странах Азии и Африки (1962—2019 гг.). Для проведения секвенирования штаммы получали из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб», где они хранились в лиофилизированном состоянии. Бактерии культивировали в бульоне и агаре LB при 37 °C.

Выделение и очистку геномной ДНК выполняли согласно протоколу производителя из бактериальной суспензии с использованием коммерческого набора Axy Prep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit. Клетки предварительно обрабатывали мертиолятом натрия до конечной концентрации 1:10 000 (0,01%) и прогреванием при 56 °C в течение 30 мин. Секвенирование полных геномов холерных вибрионов осуществляли на платформе Ion PGM (Ion Torrent, США) с использованием стандартных протоколов подготовки проб и программного обеспечения.

Биоинформационный анализ полногеномных последовательностей штаммов проводили относительно последовательности генома референсного штамма V. cholerae N16961. Для выравнивания полногеномных последовательностей и выявления делеций и инсерций использовали программу Mauve (https://darlinglab.org/mauve/mauve.html). Поиск единичных точечных мутаций (SNPs) и контроль достоверности результатов осуществляли картированием ридов и собранных в контиги фрагментов генома исследуемых штаммов посредством программы Snippy (https://github.com/tseemann/snippy). Визуализацию результатов картирования производили при помощи программы Ugene (https://ugene.net/ru/).

Для SNP-типирования использовали алгоритм Байесовского филогенетического анализа с применением программы BEAST v.2.5.1. Построение филогенетического дерева провели на основе SNP-матрицы, полученной путем попарного сравнения с геномом референсного штамма при помощи программы Snippy.

Результаты и обсуждение

Распространение новых мутаций в генах вирулентности, пандемичности и лекарственной устойчивости среди штаммов, выделенных в Азии и Африке

На протяжении 44 лет (1970—2014 гг.) эпидемические вспышки и спорадические случаи холеры в России были результатом ее завоза в основном из стран Азии и Африки [7, 10, 11]. Для прогнозирования эпидемиологической ситуации по холере в России, связанной с завозом патогена, необходимы сведения о генетических свойствах штаммов, циркулирующих в последнее десятилетие на этих территориях. Мы сопоставили геномы 91 штамма V. cholerae Эль Тор, выделенных в период 3-й волны с 2007 по 2019 г. на территории Вьетнама, Индии, Бангладеш, Йемена, Танзании, Уганды и Кении. Кроме того, изучили геномы недавно выявленных штаммов в Камеруне и Нигерии [28]. Для сравнения в качестве референсных были взяты штаммы CRC711, 6/67, N16961, MJ-1236, изолированные в Азии в 1-ю и 2-ю волны пандемии в 1962—1994 гг. (табл. 1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_012_add.zip). Проведенный биоинформационный анализ секвенированных участков геномов, содержащих профаг CTXφ, остров патогенности VPI-1 и остров пандемичности VSP-II, в состав которых входят ключевые гены патогенности и эпидемичности, выявил заметные изменения их структуры у изученных штаммов, изолированных в последнее десятилетие по сравнению с таковыми, выделенными в более ранний период пандемии. Одно из важнейших — появление новых аллелей структурного гена ctxB, который определяет биосинтез B-субъединицы CT (CTB) и входит в состав профага CTXφ, содержащего оперон ctxAB, кодирующий холерный токсин, — ключевой фактор патогенности. Известны три аллельных варианта гена ctxB (ctxB3, ctxB1 и ctxB7), связанных с изменением уровня продукции CT [29, 30]. Оказалось, штамм из 1-й волны (CRC711, 6/67, N16961) содержали аллель ctxB3, что характерно для типичных штаммов возбудителя (см. таблицу, рис. 1, а, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_013_add.zip). Новая аллель ctxB1 с двумя заменами (T115C и T203C) была обнаружена у атипичного штамма MJ-1236, являющегося представителем изолятов из 2-й волны пандемии (рис. 1, б, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_013_add.zip). Эти нуклеотидные замены привели к смене триплетов TAT и ATT на CAT и ACT и кодируемых аминокислот тирозин и изолейцин на гистидин и треонин в 39 и 68 положениях полипептидной цепи белка CtxB. В отличие от них среди штаммов, циркулирующих на территории Азии и Африки в последнее десятилетие, 68 изолятов (или 74, 7%) имели в геноме аллель ctxB7 с тремя несинонимичными заменами (T115C, T203C и C58A) и дополнительной заменой гистидина на аспарагин в положении 20 в CtxB (см. таблицу, рис. 1, в, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_013_add.zip). В то же время 23 штамма (или 25,3%), в основном из Бангладеш, сохранили аллель ctxB1. Другой не менее важной для патогенеза стала мутация в гене tcpA, расположенном в VPI-1 и кодирующем основную субъединицу TCP. Штаммы, выявленные в 1-ю волну пандемии, и значительная часть штаммов из 2-й волны несли аллель tcpA^El ^Tor, характерный для типичных штаммов, тогда как все изученные штаммы из последнего десятилетия (3 волна) имели аллель tcpA^CIRS¹⁰¹, несущий несинонимичную замену А266G (см. таблицу, см. рис. 1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_013_add.zip).

Мутации типа делеций затронули остров пандемичности VSP-II. Прототип VSP-II присутствует в геномах штаммов лишь из 1-й и 2-й волн пандемии. Однако у штаммов периода 2-й волны были выявлены штаммы, у которых в составе VSP II были делеции 4—12 генов: Δvc0495 — vc0498, Δvc0495 — vc0502, Δvc0490 — vc0502 (см. рис. 1, б, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_013_add.zip). В то же время у всех изученных штаммов 3 волны делеция в VSP-II была более значительна и затронула 21 ген (VSP-IIΔ(vc0495 — vc051), см. рис. 1, в). Такая перестройка острова пандемичности, видимо, обеспечивала этим штаммам селективные преимущества, поскольку варианты с VSP-IIΔ(vc0495 — vc0512) вытеснили штаммы с прототипным VSP-II во многих очагах холеры [16].

Одновременно с изменением ключевых генов вирулентности и эпидемичности, входящих в состав мобильных элементов, у возбудителя холеры возникли мутации и в коровых генах. Одна из них появилась в гене rtxA, кодирующем цитотоксин MARTX [22]. При анализе нуклеотидных последовательностей гена rtxA 91 изучаемого штамма было обнаружено отсутствие мутации в этом гене у 23 изолятов, выделенных в основном в Бангладеш. Однако 68 штаммов (или 74,7%) имели аллельный вариант rtxA4 с нуклеотидной заменой G13602A (см. таблицу, см. рис. 1, в, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_013_add.zip). Такая мутация привела к образованию стоп-кодона, определяющего преждевременное завершение синтеза этого токсина. В результате укороченный на 12 аминокислотных остатков токсин утратил цитотоксическую и актин-связывающую активность по отношению к эукариотическим клеткам. В качестве примера на рис. 2, а (см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_013_add.zip) приведена нуклеотидная последовательность мутантного гена rtxA4 и аминокислотная последовательность его белка у штамма IND085.

Другими значимыми мутациями стали точечные мутации в генах gyrA и parC, а также в гене carR, изменивших устойчивость к налидиксовой кислоте и полимиксину B соответственно. Если у изолятов из 1-й и 2-й волн нуклеотидная последовательность генов gyrA и parC была идентичной таковой референсного штамма N16961, то все изученные штаммы последнего десятилетия имели мутации в генах gyrA (G248T) и parC (С254T). Точечные замены, приводящие к смене серина (Ser) на изолейцин (Ile) в позиции 83 A-субъединицы ДНК-гиразы и серина (Ser) на лейцин(Leu) в позиции 85 C-субъединицы ДНК-топоизомеразы IV привели к устойчивости к налидиксовой кислоте (см. рис. 2, б, в, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_013_add.zip). Были обнаружены также штаммы Pol^S. Причиной утраты резистентности к полимиксину B явилась нуклеотидная замена G265A в регуляторном гене carR, которая привела к биосинтезу мутантного белка CarR с пониженной транскрипционной активностью в отношении оперона almEFG, принимающего участие в модификации липида A (см. рис. 2, г, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_013_add.zip).

Анализ приведенных данных свидетельствует о циркуляции в эндемичных регионах разных популяций возбудителя, различающихся по генотипу. Среди них нами выделены 2 основные группы, имеющие различный набор мутантных генов вирулентности и эпидемичности. В 1-ю группу вошли атипичные штаммы (23 изолята, или 25,3%) из Бангладеш с генами ctxB1, tcpA^CIRS¹⁰¹, rtxA, gyrA, parC, carA, но отличающиеся между собой размером делеции в VSP-II, затронувшей в основном 4—12 генов (см. таблицу, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_012_add.zip). Штаммы из 2-й группы (68 изолятов или 74,7%) были отнесены к новым вариантам, поскольку содержали в геноме весь спектр характерных для них мутаций. Их геномы содержали аллели генов патогенности ctxB7, tcpA^CIRS¹⁰¹, rtxA4, мутации в генах gyrA и parC, обусловившие устойчивость к налидиксовой кислоте, а также делетированный остров пандемичности VSP-IIΔvc0495—0512 (см. таблицу, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_012_add.zip). Более того, 46 изолятов, или 67,4%, имели недавно возникшую мутацию в гене carR. Именно такие штаммы были выделены от больных в Индии (2012—2017 гг.), Бангладеш (2016—2018 гг.), Уганде и Кении (2015—2016 гг.), а также в Йемене (2016—2017 гг.). Таким образом, последовательное накопление мутантных генов вирулентности, эпидемичности и лекарственной устойчивости привело к значительному изменению генома возбудителя холеры и появлению в последнее десятилетие его новых вариантов. Особенно важен тот факт, что эти штаммы отличаются повышенным патогенным потенциалом за счет усиления вирулентности в результате появления в штаммах аллеля ctxB7. Так, недавно было установлено, что аллель ctxB7 играет четко выраженную роль в 4—5-кратном повышении продукции CT новыми вариантами по сравнению со штаммами с аллелем ctxB1 [15]. Кроме того, у этих вариантов высокий эпидемический потенциал, о чем свидетельствует вытеснение ими ранее возникших атипичных штаммов в эндемичных по холере регионах [16]. Такая ситуация позволяет прогнозировать появление новых вариантов на территории России в результате заноса.

Геномное разнообразие атипичных штаммов возбудителя холеры из России и сопредельных стран и распространение новых вариантов

Поскольку геном возбудителя холеры претерпел значительные изменения в процессе эволюции, мы сочли возможным оценить геномное разнообразие токсигенных штаммов, завезенных на территории России (1970—2014 гг.) и Украины (1994—1995 гг., 2010—2011 гг.) [27], представляющих единое эпидемиологическое пространство. Для этого был проведен биоинформационный анализ секвенированных участков геномов 29 штаммов, содержащих важнейшие гены вирулентности и эпидемичности в составе мобильных генетических элементов. Оказалось, что исследованные штаммы в зависимости от времени выделения несли в геномах разные аллельные варианты ключевых генов патогенности ctxB и tcpA. У штаммов из 1-й волны (4 изолята) нуклеотидная последовательность ctxB была идентична таковой референсного штамма N16961 и, следовательно, аллель этого гена относился к ctxB3 (см. таблицу, см. рис. 1, а, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_013_add.zip). Аллель ctxB1 с двумя заменами (T115C и T203C) имели лишь атипичные штаммы (15 изолятов), выделенные в основном во время 2 волны пандемии (см. рис. 1, б, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_013_add.zip). Новый аллель ctxB7 с тремя несинонимичными заменами (T115C, T203C и C58A) был выявлен только у штаммов (8 изолятов) из 3-й волны пандемии (см. таблицу, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_012_add.zip). Что касается гена tcpA острова VPI-1, то все штаммы, выявленные в 1-ю и 2-ю волны пандемии (16 изолятов), содержали tcpA^El ^Tor, тогда как в период 3-й волны более 90,0% штаммов (12 из 13) имели аллель tcpA^CIRS¹⁰¹ с характерной заменой A266G (см. таблицу, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_012_add.zip).

Нестабильность другого мобильного элемента VSP-II привела к недавнему появлению его вариантов, отличающихся от прототипного утратой ряда генов. Данные анализов геномов штаммов по типу VSP-II позволили разделить их на 3 группы. Первая включала 15 штаммов с прототипным VSP-II, 14 из них были выделены в 1-ю и 2-ю волны пандемии в 1970—2001 гг. (см. таблицу, см. рис. 1, а, б, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_013_add.zip). Вторая группа была представлена двумя штаммами (I-1263, P17644) из 2-й волны (1997 г.) с короткой делецией в VSP-II, затрагивающей 4 гена (Δvc0495 — vc0498). В отличие от них почти у всех штаммов (12 изолятов) из 3-й волны пандемии (2004—2014 гг.) в геномах присутствовала делеция, захватывающая 21 ген (Δvc0495 — vc0512) (см. рис. 1, в, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_013_add.zip). Это может означать, что процесс редукции генома VSP-II происходил на протяжении 2-й и 3-й волн пандемии.

Помимо изменения ключевых генов вирулентности и эпидемичности, входящих в состав мобильных элементов, у исследуемых штаммов возбудителя обнаружили мутации и в коровых генах. Одна из них обнаружена у штаммов 3-й волны в гене rtxA, кодирующем цитотоксин MARTX. Было установлено, что в 12 штаммах нуклеотидная замена G13602A в аллельном варианте rtxA4 привела к образованию стоп-кодона и преждевременному завершению синтеза этого токсина.

Другими значимыми для лекарственной устойчивости или идентификации биотипа возбудителя стали точечные мутации в генах gyrA и parC, а также в гене carR. Среди 16 штаммов из 1-й и 2-й волн пандемии у 12 (или 75,0%) нуклеотидная последовательность генов gyrA и parC была идентична таковой референсного штамма. Лишь 4 штамма (I-1187, I-1263, Р17844 и М1344) имели мутацию в гене gyrA (G248T). Однако в период 3-й волны ситуация изменилась. У 12 из 13 изученных штаммов были выявлены нуклеотидные замены в gyrA (G248T) и parC (С254T), которые привели к изменению аминокислотных последовательностей A-субъединицы ДНК-гиразы и C-субъединицы ДНК-топоизомеразы IV, что обусловило устойчивость к налидиксовой кислоте. У двух штаммов (M1509 и 3265/80), занесенных в Россию во время 3-й волны пандемии, выявлена нуклеотидная замина G265A в гене carR. В результате этой мутации появились штаммы Pol^S, утратившие один из основных фенотипических признаков, используемых для дифференциации биотипов холерных вибрионов. Таким образом, на протяжении трех волн пандемии на территорию России и Украины были занесены как типичные, так и атипичные штаммы возбудителя с мутациями в различных генах, значимых для развития инфекционного и эпидемического процесса при холере.

Для поиска новых вариантов мы сравнили геномы исследованных атипичных штаммов. Оказалось, они представлены пятью различными генетическими группами, отличающимися друг от друга по составу измененных генов патогенности, эпидемичности и резистентности к антибиотикам. В 1-ю и 2-ю группы входили штаммы с генотипом ctxB1, tcpA^ElTor, VSP-II, rtxA, gyrA, parC, carA и ctxB1, tcpA^ElTo^r, VSP-II(Δvc0495 — vc0498), rtxA, gyrA, parC, carA (1993 — 2001 гг.). Третья состояла из штаммов ctxB1, tcpA^CIRS¹⁰¹, VSP-II(Δvc0495 — vc0512), rtxA4, gyrA(G248T), parC(С254T), carA (2004 — 2006 гг.). Четвертую и пятую образовали штаммы ctxB7, tcpA^CIRS¹⁰¹, VSP-II(Δvc0495 — vc0512), rtxA4, gyrA(G248T), parC(С254T), carA, ctxB7, tcpA^CIRS¹⁰¹, VSP-II(Δvc0495 — vc0512), rtxA4, gyrA(G248T), parC(С254T), carA(C254T). Две последние группы представляли особый интерес, поскольку по генетическим маркерам относились к новым вариантам, отличающимся от предыдущих присутствием ранее неизвестных мутаций в гене ctxB (аллель ctxB7) и в ряде случаев в гене carR, контролирующем резистентность к полимиксину B.

Из представленных данных очевидно, что новые варианты были завезены в Россию и Украину в 2010—2014 гг. (см. таблицу, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_012_add.zip). Обнаружено восемь штаммов, содержащих в геномах весь спектр дополнительных мутаций и по генетическим маркерам не отличающихся от новых вариантов, циркулирующих в эндемичных регионах. Их геномы содержали аллельные варианты генов патогенности (ctxB7, tcpA^CIRS¹⁰¹, rtxA4), мутации в генах gyrA и parC, а также протяженную делецию в VSP-II. Кроме того, среди них было выявлено два изолята с мутацией в гене carR, которая привела к потере одного из маркеров биотипа Эль Тор. Структура геномов этих штаммов полностью совпадает с таковой новых вариантов возбудителя, выделенных в последнее десятилетие в Азии и Африке, что подтверждает возможность завоза таких штаммов в Россию и Украину из эндемичных по холере регионов.

Филогенетические связи штаммов возбудителя холеры, изолированных в России и эндемичных странах Азии и Африки

Филогенетические связи изучаемых штаммов были установлены на основе SNP-анализа 115 штаммов, представленных 29 изолятами из России и Украины и 86 штаммами, выделенными в Азии и Африке во время трех волн пандемии (рис. 3, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_015_add.zip). При сравнении полных геномов исследуемых штаммов с референсной последовательностью штамма N16961 выявлено 1879 одиночных нуклеотидных замен, или SNPs (от Single Nucleotide Polymorphism), в коровых генах, локализованных на обеих хромосомах. На основе их анализа построено филогенетическое дерево, которое четко разделилось на три кластера (см. рис. 3, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_015_add.zip). Типичные штаммы возбудителя из 1-й волны (1962—1975 гг.), несущие аллель ctxB3 (7 изолятов), независимо от места выделения входили в состав кластера I, отличаясь от референсного на 67—95 SNPs. Кластер II сформировали 13 атипичных штаммов с аллелью ctxB1, выделенных в период 2-й волны и отличающихся от референсного на 98—155 SNPs. В кластер III вошли штаммы из 3-й волны (95 изолятов), имеющие высокий уровень гетерогенности — разные аллели генов ctxB и rtxA, разные размеры делеций в VSP-II, а также появление мутации в хромосомном гене carR (см. рис. 3, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_015_add.zip). Различия в SNPs между ними и референсным штаммом достигали 158—217 SNPs. Следствием генетического разнообразия стало формирование ими двух основных подгрупп «а» и «б», а в пределах последней подгруппы еще нескольких ветвей. Подгруппу «а» образовали 23 атипичных штамма из Бангладеш (2009—2017 гг.) с ctxB1, rtxA и разными длинами делеций в VSP-II, а также с мутациями в хромосомных генах gyrA и parC. Другая последовательно ветвящаяся подгруппа «б» объединила штаммы (62 изолята), выделенные как в эндемичных очагах холеры, так и занесенные оттуда в Россию и Украину. В ее состав вошли 4 атипичных штамма с аллелью ctxB1, также 58 новых вариантов, имеющих в геноме весь набор характерных для них мутаций. Среди отдельных ветвей этой подгруппы большой интерес представляли 1-я и 2-я. Первую образовали новые варианты из Бангладеш (2010—2012 гг.), Индии (2009 — 2012 гг.), России (2010 г.) и Украины (2011 г.). Наиболее тесная филогенетическая связь таких штаммов из России и Украины с изолятами из Индии может служить указанием на их завоз на территорию нашей страны из этого региона. Другую ветвь сформировали также новые варианты возбудителя из России (2012 г., 2014 г.), Индии (2013—2016 гг.) и Бангладеш (2016 г.). Однако в отличие от ветви 1 эти штаммы несли мутации в гене carR, что означает потерю ими значимого диагностического признака биотипа Эль Тор (см. рис. 3, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_01_015_add.zip). Что касается ветвей 3 и 4, то в их состав вошли штаммы новых вариантов также с мутацией в гене carR, но выделенные преимущественно в более поздний период в странах Азии и Африки. Таким образом, новые варианты возбудителя холеры, выделенные в России и Украине, имеют большое филогенетическое сходство с таковыми, циркулирующими в последнее десятилетие в странах Азии и Африки. Данный факт подтверждает их завоз в нашу страну из этих эндемичных регионов.
В заключение следует отметить, что проведен анализ геномов штаммов (91 штамм) V. cholerae Эль Тор, выделенных с 2007 по 2019 г. в семи эндемичных по холере странах Азии и Африки, с территории которых наиболее часто может происходить завоз холеры в нашу страну. Показано, что преимущественная часть штаммов (74,7%) по набору мутантных генов вирулентности, эпидемичности и лекарственной устойчивости отнесена к новым вариантам атипичных штаммов возбудителя с усиленной вирулентностью и высоким эпидемическим потенциалом. Глобальное распространение таких штаммов в странах Азии и Африки в последнее десятилетие создает реальные риски дальнейшего их завоза в Россию в результате усиливающихся миграционных процессов. Анализ геномов токсигенных штаммов V. cholerae Эль Тор, выделенных на территории России и Украины в течение 44 лет (1970—2014 гг.), показал их большое генетическое разнообразие и подтвердил наличие завоза атипичных штаммов возбудителя на протяжении двух последних волн пандемии (1993—2014 гг.). Установлено, что эти штаммы образуют 5 групп, различающихся между собой набором мутаций в ключевых генах вирулентности, эпидемичности и лекарственной устойчивости, локализованных как в мобильных элементах, так и в коровой части генома. Среди них, завезенных в последние годы (2010—2014 гг.), обнаружены штаммы, отнесенные по спектру мутаций к новым вариантам возбудителя.

Анализ филогенетических связей на основе SNP-типирования 115 штаммов показал, что, несмотря на генетическое разнообразие атипичных штаммов, геномы которых очень динамичны за счет возникающих новых мутаций, все они принадлежат к одной филогенетической линии. Особенно важен тот факт, что новые варианты возбудителя, выделенные в России и Украине, имеют большое филогенетическое сходство с таковыми, циркулирующими в последнее десятилетие в странах Азии и Африки. Эти данные свидетельствуют об их заносе в нашу страну из этих регионов.

В результате проведенного исследования выявлены молекулярные механизмы и динамика изменения важнейших генетических свойств этого патогена. Сведения об особенностях генома новых вариантов могут быть использованы для разработки новых средств их генодиагностики.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare that there is not conflict of interests.