Введение

Свободноживущие, способствующие росту растений бактерии рода Azospirillum, используемые в сельскохозяйственных биотехнологиях, обладают выраженной фенотипической пластичностью [1, 2]. Так, некоторые азоспириллы, включая A. baldaniorum Sp245 (ранее A. brasilense [3]), отвечают на смену механических свойств среды обитания изменениями длины клеток, характера их жгутикования (синтезируют только конститутивный полярный жгутик [Fla] или Fla и индуцибельные латеральные жгутики [Laf], например, при наличии в среде 0,4% и более высоких концентраций агара) и образа жизни (плавание или коллективное роение, образование биопленок) [4—7]. У этих и других микробов механосенсорные функции могут выполнять жгутики, первыми вступающие в контакт с микроокружением бактерий [4, 7]. Жгутики имеют консервативную структуру и состоят из базального тела, крюка и филамента. Базальное тело выполняет функции якоря жгутика в оболочке клетки, мотора и экспортной машины и включает кольцевые белковые комплексы, стержень и систему секреции III типа [8]. Одним из компонентов системы секреции является белок FlhB, авторасщепление которого необходимо для конформационных изменений в аппарате экспорта и переключения его субстратной специфичности — с тем, чтобы белки стержня и крюка экспортировались до этапа полимеризации белков, образующих сочленение крюка и филамента, и белков-флагеллинов филамента и белка кэпа [8].

В геноме штамма Sp245 есть два предполагаемых гена flhB, расположенных на хромосоме (flhB1 (AZOBR_150177)) и на плазмиде AZOBR_p4 в кластере предполагаемых генов Laf системы (flhB2 (AZOBR_p410073)) [5, 9]. Предполагаемый белок FlhB2 состоит из 366 аминокислотных остатков и обладает 43% идентичностью и 61% сходством с белком FlhB1. В геноме A. brasilense Sp7 гены AMK58_10035 и AMK58_26270, являющиеся соответственно гомологами AZOBR_150177 и AZOBR_p410073 тоже локализованы в хромосоме и плазмиде ABSP7_p3.

Хромосомный ген flhB1 необходим для образования и Fla, и Laf. Так, штамм Sp245-flhB1::Omegon-Km имел Flaˉ/Lafˉ фенотип, а возобновление у комплементированных клеток этого мутанта способности к образованию Fla устраняло дефекты биосинтеза Laf [5]. Восстановление структуры Fla у комплементанта могло восстановить гипотетический механосенсорный аппарат, необходимый для индуцибельной сборки нормальных Laf. В то же время, описанное выше влияние приобретения гена flhB1 на жгутикование комплементанта мутанта Sp245-flhB1::Omegon-Km может быть связано с участием белка FlhB1 в процессах сборки жгутиков двух видов. Анализ подвижности и жгутикования мутантов азоспирилл с инактивированным геном flhB2 позволит точнее охарактеризовать функции FlhB1 и FlhB2.

Материал и методы

Штаммы бактерий, питательные среды и условия культивирования. Штаммы бактерий, использованные в работе, представлены в табл. 1, праймеры для ПЦР — в табл. 2. Бактерии выращивали в малатно-солевой среде (МСС [18]) или Luria-Bertani (LB [13]) при 30 °C. При необходимости в среду вносили Бакто агар (20 г/л для плотных сред), канамицин (Km) (30—50 мкг/мл), тетрациклин (Tc) (25 мкг/мл).

Таблица 1. Штаммы бактерий, плазмиды, использованные в работе

Таблица 2. Пары праймеров для ПЦР-амплификации

Планктонные культуры выращивали в жидких средах при интенсивном покачивании (140 об/мин) на Excella E24 («New Brunswick Scientific», США). Каждые 2 ч измеряли ОП₅₉₀ бактериальной культуры. Морфологию клеток исследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии на Libra 120 («Carl Zeiss», Германия) [5]. Подвижность бактерий оценивали при различных условиях культивирования: через 18 ч инкубации в жидкой среде на качалке (с использованием фазово-контрастной микроскопии); после инокуляции уколом в содержащую 0,4—0,6% Бакто агара среду (МСС) и последующей инкубации в течение 24—96 ч (с измерением диаметра зоны распространения роящихся бактерий в среде). Среднюю скорость движения подвижных клеток определяли с помощью компьютерного анализа видеоизображения способом, описанным в работе [19].

Выделение и очистка ДНК и РНК, манипуляции с ними, ОТ-ПЦР и РВ-ПЦР. Геномную ДНК выделяли из жидких бактериальных культур с использованием набора GeneJET Genomic DNA Purification Kit («ThermoScientific», США). Для амплификации ДНК использовали готовую смесь экстра-микс для ПЦР HS-Taq PCR («Диаэм», Россия) или высокоточную ДНК полимеразу iProof High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad). ПЦР ставили в термоциклере T100 («BioRad Laboratories», США) не менее чем в трех независимых повторностях. Продукты ПЦР визуализировали с помощью электрофореза в геле [13]. Ампликоны и плазмиды очищали с использованием наборов GeneJet PCR Purification и GeneJet Plasmid Miniprep Kits («ThermoScientific», США), соответственно. Гидролиз ДНК эндонуклеазами, лигирование ДНК, клонирование рекомбинантных ДНК в клетках E. coli осуществляли общепринятыми методами [13]. Для анализа нуклеотидных последовательностей и подбора праймеров использовали базы данных, представленные на серверах Национального центра биотехнологической информации США (NCBI).

Для выделения РНК бактериальные клетки с агаризованной среды собирали, отмывали 50 мМ фосфатным буфером (ФБ, pH 7) и суспендировали в нем до ОП₅₉₀=1. РНК выделяли, используя NucleoZOL («Macherey-Nagel», Германия), обрабатывали ДНКазой I («ThermoFS», США). Концентрацию РНК определяли с помощью набора Qubit RNA BR Assay Kits на флуориметре Qubit 4 («ThermoFS», США). кДНК синтезировали (ОТ-ПЦР), используя набора MMLV RT kit («Евроген», Россия) с добавлением ингибитора рибонуклеаз Ribolock («ThermoFS», США). Чистоту РНК проверяли ПЦР на РНК и полученной кДНК с использованием праймеров (табл. 2) для амплификации гена домашнего хозяйства (ген rpoD) [20]. ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) проводили с использованием набора для ПЦР qPCRmix-HS SYBR+HighROX («Евроген», Россия) на приборе Applied Biosystems 7300 («Applied Biosystems», США) при следующих условиях: 5 мин при 95 °C, затем 40 циклов по 15 с при 95 °C, 30 с при 60 °C и 30 с при 72 °C. В качестве эндогенного контроля использовали ген rpoD [20]. Профили экспрессии генов-мишеней определяли относительно уровня экспрессии rpoD с использованием метода 2^-ΔΔCT [21].

Получение мутантов. Праймеры для ПЦР-амплификации ДНК Sp245 и плазмиды, использованные в работе, представлены в табл. 1 и 2. Работа по мутагенезу включала клонирование в векторе pJET1.2 ампликона, содержащего CDS AZOBR_p410073 из Sp245. Клонирование осуществляли по SalI сайту AZOBR_p410073 гена устойчивости к канамицину из pUC4K (aphAI) в pJET1.2-p410073. Затем p410073-SKm переклонировали в вектор pEX18Tc, неспособный к автономной репликации в клетках азоспирилл. CDS AZOBR_p410073 (плюс 163 п.н. до и 111 п.н. после CDS) была также наработана в ПЦР на ДНК штамма Sp245 (ампликон 1375 п.н.) и клонирована в экспрессионном векторе pRK415 под контролем его lac промотора. Для соблюдения правильной ориентации клонирование проводили по сайтам рестрикции XbaI и EcoRI, которые были заложены в дизайн праймеров. Плазмиды pRK415-p410073 и pEX18Tc-p410073-SKm трансформировали в E. coli DH5a. Введение рекомбинантной плазмиды pEX18Tc-p410073-SKm в клетки азоспирилл для направленного мутагенеза исследуемых генов или введение в бактерии плазмид pRK415, pRK415-p410073 и pRK415-150177 проводили с помощью трехродительского скрещивания с плазмидой-помощником pRK2013, как описано ранее [5]. В случае направленного мутагенеза отбирали устойчивые к канамицину, но чувствительные к тетрациклину клоны азоспирилл (клоны, в которых прошла двойная рекомбинация между плазмидой pEX18Tc-p410073-SKm и целевой ДНК). Для подтверждения вставки гена aphAI в AZOBR_p410073 использовали праймеры к aphAI в парах с праймерами к последовательностям ДНК, прилегающим к AZOBR_p410073, секвенирование фрагментов ДНК, прилегающих к aphAI.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента (доверительные интервалы даны для 95% уровня значимости) и однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) (при уровне значимости p≤0.05). Для статистической обработки использовали пакет программ Microsoft Office Excel 2010.

Результаты

Анализ скорости роста, жгутикования и подвижности бактерий. Получен мутант A. baldaniorum Sp245.0001 (Sp245-flhB2::Km), у которого в CDS AZOBR_p410073 размером 1101 п.н. за 994 п.н. клонирован ген устойчивости к канамицину (aphAI). У Sp245.0001 сохранялся синтез функционирующего Fla, но были нарушены синтез и функционирование Laf (Lafˉ фенотип), снижены скорость движения и распространения роящихся клеток в полужидких агаризованных средах (рис. 1, табл. 3). Более 80% клеток родительского штамма Sp245 с плотной агаризованной среды имели многочисленные Laf, в случае Sp245.0001 клетки были лишены Laf, и только 20% бактерий несли на своей поверхности редкие или единичные Laf (рис. 1). Введение плазмиды pRK415-p410073 в клетки Sp245.0001 приводило к восстановлению утраченных признаков у комплементанта Sp245.0001(pRK415-p410073), что подтверждает влияние AZOBR_p410073 на исследованые признаки (табл. 3). Плазмиды pRK415 и pRK415-150177 (pRK415, содержащая хромосомный ген flhB1, комплементирующий FlaˉLafˉ фенотип мутанта Sp245-flhB1::Omegon-Km (Sp245.1063 [5]), введенные в Sp245.0001, не влияли на жгутикование и роение этих производных мутанта (табл. 3).

Рис. 1. Просвечивающая электронная микроскопия клеток A. brasilense Sp245 (А), Sp245.1063 (Б), Sp245.0001 (В).

Бактерии выращивали при 30 °C в жидкой МСС 18 ч (1) или на агаризованной МСС 42 ч (2). У Sp245 86% клеток с плотной агаризованной среды имели многочисленные Laf (А2), в случае Sp245.0001 клетки были лишены Laf и только 20% клеток, несли на своей поверхности редкие или единичные Laf (В2). Масштабная линейка соответствует 1 мкм.

Таблица 3. Подвижность бактерий в жидкой и полужидкой минимальных синтетических средах (МСС)

Примечание. Бактерии инкубировали 24 ч в жидкой или 48 ч в полужидкой МСС; диаметр зоны инокуляции бактерий в полужидкой среде составлял 5,1±0,3 мм; н.п. — не перемещаются; приведены средние значения ± доверительные интервалы для 95% уровня значимости; буквами в столбцах обозначены статистически значимые различия (а и А — минимальные значения), выявленные с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA; p<0.05).

Жгутикование и подвижность, характерные для A. baldaniorum Sp245.0001, были аналогичны фенотипу Lafˉ мутанта A. brasilense Sp7 Sp7.0001 (табл. 3). У Sp7.0001 произведена замена гена flhB AMK58_26270, локализованного в кластере генов биосинтеза Laf плазмиды ABSP7_p3, на последовательность AZOBR_p410073, содержащую вставку гена aphAI (flhB2::Km). Гены AMK58_26270 и AZOBR_p410073 являются гомологами (97% идентичности). Хромосомная копия гена flhB AMK58_10035 (гомолог flhB1 Sp245 (AZOBR_150177)) осталась неизменной у Sp7.0001.

Анализ транскрипции генов flhB и генов fliC и laf1, кодирующих соответственно флагеллины Fla и Laf. В клетках Laf^– мутанта Sp245.0001 (flhB2::Km) транскрипция laf1 была снижена, а в случае fliC (гены AZOBR_70032/AZOBR_p1160045) и flhB1 сохранялась на уровне Sp245 (рис. 2). Продукты трансляции хромосомной CDS AZOBR_70032 и CDS AZOBR_p1160045, локализованной на плазмиде AZOBR_p1, были обнаружены в протеоме клеток штамма Sp245, выращенных в жидкой минимальной среде при интенсивной аэрации или в микроаэробных условиях [22]. Поскольку в жидкостях A. baldaniorum продуцируют только Fla, белки, кодируемые AZOBR_70032 и AZOBR_p1160045, по-видимому, образуют филамент Fla [22]. В клетках Fla^–Laf^– flhB1::Omegon-Km мутанта Sp245.1063 мы наблюдали низкий уровень транскрипции генов fliC, flhB2 и laf1 (рис. 2).

Рис. 2. Результаты анализа транскрипции flhB1 (AZOBR_150177 (панель А)), fliC (AZOBR_70032/AZOBR_p1160045 (панель В)), flhB2 (AZOBR_p410073 (панель Б)) и laf1 (AZOBR_p410056 (панель Г)) в клетках A. baldaniorum.

Относительный уровень транскрипции (ОУТ) — отношение результатов ПЦР в реальном времени с кДНК исследуемых генов штаммов Sp245.1063 и Sp245.0001 к аналогичным результатам Sp245. * — сигнал отсутствовал.

Обсуждение

Процесс сборки жгутиков предполагает последовательную и своевременную экспрессию генов флагеллярных компонентов [8, 23—25]. Низкий уровень транскрипции flhB2 у Sp245.1063 или отсутствие FlhB2 у Sp245.0001 очевидно влияют на экспрессию генов, белковые продукты которых необходимы для сборки органеллы позже, что согласуется с низким уровень транскрипции laf1 и Laf^– фенотипом мутантов.

Таким образом, инактивация гена flhB2, локализованного на плазмидах AZOBR_p4 у Sp245 и ABSP7_p3 у Sp7, приводила к дефектам в сборке многочисленных Laf, снижению скорости движения роящихся бактерий и не оказывала влияния на синтез и функционирование Fla.

Анализ полученных результатов дает основание предположить, что FlhB1, обладающий 43% идентичности и 61% сходства с FlhB2, может участвовать в процессах сборки жгутиков двух видов, поскольку у 20% клеток Sp245.0001 кроме Fla присутствовали единичные Laf. Однако 80% бактерий этого мутанта были лишены Laf. Мы наблюдали, что экспрессия flhB1 у Sp245.0001 и родительского штамма не отличались, оба штамма синтезировали Fla и, вероятно, из-за отсутствия «достаточного» количества FlhB1, используемого для синтеза Fla, клетки Sp245-flhB2::Km мутанта были не способны к сборке многочисленных Laf. В то же время приобретение штаммом Sp245.0001 дополнительной копии flhB1 в составе pRK415-150177 не приводило к восстановлению у Sp245.0001(pRK415-150177) фенотипа, характерного для Sp245 (Fla⁺Laf⁺), в отличие от комплементанта Sp245.1063(pRK415-150177), являющегося производным FlaˉLafˉ мутанта Sp245-flhB1::Omegon-Km (см. табл. 3 и [5]). В последнем случае возобновление синтеза Fla, выполняющего механосенсорные функции [4, 7], у комплементанта Sp245.1063, содержащего pRK415-150177, способствовало восстановлению процессов механосенсинга и механотрансдукции, индуцирующих транскрипцию генов биогенеза Laf.

Таким образом, наличие единичных Laf у 20% клеток Sp245.0001 является результатом случайных событий, не зависящих от и экспрессии гена flhB1.

Заключение

В геноме штаммов Sp245 и Sp7 присутствуют два предполагаемых гена flhB, расположенных в хромосоме (flhB1) и, соответственно штаммам, на плазмидах AZOBR_p4 или ABSP7_p3 (flhB2). Нами установлено, что экспрессия гена flhB2 необходима для сборки Laf. Транскрипция flhB2 регулируется механосигналом, восприятие и генерация которого обеспечивается функционирующим Fla, очевидно с участием белка FlhB, кодируемого хромосомным геном flhB1.

Благодарность. Авторы выражают признательность Центру коллективного пользования научным оборудованием в области физико-химической биологии и нанобиотехнологии «Симбиоз» ИБФРМ РАН (Саратов, Россия) за допуск к работе на приборах Leica DM6000 B и Libra 120.

В ходе исследования эксперименты на людях или животных не проводились.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.