Влияние инактивации гена гибридной гистидинкиназы на морфологию клеток у бактерий Azospirillum baldaniorum и Azospirillum brasilense

Альфапротеобактерии рода Azospirillum известны как ризосферные микроорганизмы, стимулирующие рост и развитие растений [1, 2]. Эффективность взаимодействия азоспирилл с растениями определяется подвижностью, хемо- и аэротаксисом, прикреплением бактерий к корням и дальнейшей их адаптацией к существованию в этой экологической нише [1, 3]. Определенную роль в восприятии бактериями сигналов окружающей среды и приспособлении к изменяющимся условиям играют двухкомпонентные системы передачи сигнала (TCS, two component signal transduction systems) [3, 4]. TCS участвуют в регуляции экспрессии генов адаптации ризосферных бактерий к динамичным условиям почвы [3, 5]. Геном A. baldaniorum Sp245 содержит не менее 259 предполагаемых генов двухкомпонентных сенсорных систем, включая 129 гистидинкиназ — 74 классических и 55 генов предполагаемых гибридных сенсорных гистидинкиназ ( HSHK—RR, hybrid sensor histidine kinase/response regulator [3]. В целом, это свидетельствует о сложной организации путей передачи сигналов, влияющих на активность генов у азоспирилл [3, 5]. На хромосоме A. baldaniorum Sp245 в кластере генов биогенеза Fla находится ген, кодирующий белок HSHK—RR [6]. Этот белок содержит два трансмембранных участка в пределах своей N-концевой области и, таким образом, связан с цитоплазматической мембраной, а наличие в сенсорной части трех сенсорных PAS доменов предполагает, что это мультисенсорный белок [3, 6]. Домены PAS могут воспринимать широкий спектр сигналов. Кроме гистидинкиназного домена белок также содержит промежуточный домен REC регулятора ответа (RR). Очевидно, мультисенсорный белок HSHK-RR, способный аккумулировать широкий диапазон сигналов, модулирует несколько клеточных процессов. В хромосоме A. brasilense Sp7 ген, кодирующий похожий белок, также связан с кластером генов биогенеза Fla.

У азоспирилл гены, опосредующие синтез жгутиков, подвижность и хемотаксис, диспергированы по геному. Например, у Sp245 гены биогенеза Laf распределены на плазмиде AZOBR_p4, а гены, необходимые для синтеза Fla, локализованы на хромосоме, AZOBR_p1 и AZOBR_p3 [2, 6—8]. Процессы, запускающие изменение морфологии бактерий и активацию подвижности при участии Fla и Laf (роение), позволяют Sp245 и Sp7 приспосабливаться к стрессу, вызванному повышением плотности окружающей среды [6—10]. Получены данные об участии в этих процессах у Sp245 HSHK-RR [6, 11].

Целью данной работы являлась проверка гипотезы о влиянии расположенного на хромосоме гена HSHK-RR, кодирующего гибридную мультисенсорную гистидинкиназу, на морфологию бактерий рода Azospirillum.

Бактериальные штаммы, среды и условия культивирования. Использованные в работе штаммы бактерий представлены в табл. 1. Бактерии культивировали при 30 °C или 37 °C на малатно-солевой среде (МСС) [12] и LB [13]. При необходимости в среды добавляли канамицин (Km; 50 мкг/мл), тетрациклин (Tc; 25 мкг/мл) и Бакто агар (1,8, 0,4 и 0,2%).

Таблица 1. Штаммы бактерий, плазмиды и праймеры, использованные в работе

Выделение и очистка ДНК и РНК, ОТ-ПЦР и РВ-ПЦР. Геномную ДНК выделяли с использованием набора GeneJET Genomic DNA Purification Kit (ThermoScientific, США). Праймеры для ПЦР (см. табл. 1) синтезировали в компании Синтол (Москва, Россия). ПЦР проводили в термоциклере T100 (BioRad Laboratories, США). Для выделения РНК бактериальные клетки с агаризованной среды собирали, отмывали 50 мМ фосфатным буфером (ФБ, pH 7) и суспендировали в нем до ОП₅₉₀=1. РНК выделяли, используя NucleoZOL (Macherey-Nagel, Германия), обрабатывали ДНКазой I (ThermoFS, США). Концентрацию РНК определяли с помощью набора Qubit RNA BR Assay Kits на флуориметре Qubit 4 (ThermoFS, США). кДНК синтезировали (ОТ-ПЦР), используя набор MMLV RT kit (Евроген, Россия) с добавлением ингибитора рибонуклеаз Ribolock (ThermoFS, США). Чистоту РНК проверяли ПЦР на РНК и полученной кДНК с использованием праймеров (см. табл. 1) для амплификации гена rpoD [18]. ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) проводили с использованием набора для ПЦР qPCRmix-HS SYBR+HighROX (Евроген, Россия) на приборе Applied Biosystems 7300 (Applied Biosystems, USA) при следующих условиях: 5 мин при 95 °C, затем 40 циклов по 15 с при 95 °C, 30 с при 60 °C и 30 с при 72 °C. В качестве эндогенного контроля использовали ген rpoD [18]. Профили экспрессии генов-мишеней определяли относительно уровня экспрессии rpoD с использованием метода 2^-ΔΔCT [19].

Проведение мутагенеза. Для мутагенеза CDS AZOBR_150176 (Sp245) и CDS AMK58_10030 (Sp7) использована конструкция pEX18Tc-HSHKDRR-Km [11], в которой вместо внутреннего PstI-фрагмента гена AZOBR_150176 длиной 666 п.н. был клонирован ген устойчивости к канамицину из pUC4K (aphAI). Введение в клетки азоспирилл pEX18Tc-HSHKDRR-Km проводили с помощью трехродительского скрещивания (с использованием плазмиды-помощника pRK2013) способом, описанным ранее [11]. Для подтверждения присутствия гена aphAI вместо PstI-фрагмента гена AMK58_10030, у полученных мутантов Sp7-HSHKDRR-Km (Sp7.10030) проводили ПЦР с праймерами к aphAI в парах с праймерами к последовательностям ДНК, прилегающим к AMK58_10030, с последующим секвенированием полученных фрагментов ДНК.

Анализ скорости роста и движения клеток, жгутикования и подвижности бактерий. Для изучения скорости роста планктонные культуры разводили до значений ОП₅₉₀=0,05—0,10 (l=0,5 см) жидкой МСС и инкубировали при 140 об/мин, измеряя ОП₅₉₀ каждые 2 ч. Скорость движения клеток в жидких средах определяли способом, описанным ранее [11]. Подвижность на полужидких средах оценивали, измеряя диаметр колоний, сформированных через 24—72 ч. Размер клеток и наличие жгутиков определяли, анализируя результаты электронной микроскопии способом, описанным ранее [6]. Электронную микроскопию клеток выполняли на микроскопе Libra 120 (“Carl Zeiss”, Германия), находящегося в ЦКП «Симбиоз» ИБФРМ РАН (Саратов, Россия).

Статистическая обработка результатов. Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости. Статистически значимые различия выявляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) при уровне значимости 0,05.

Нуклеотидные последовательности AZOBR_150176 и AMK58_10030, кодирующие HSHK‒RR, расположены среди генов биогенеза Fla, соответственно, на хромосомах Sp245 и Sp7. Сравнение нуклеотидных последовательностей AZOBR_150176 или AMK58_10030 показало наличие гомологии (95%). Для поиска промоторов, расположенных перед AZOBR_150176 и AMK58_10030, была использована программа iPromoter-2L (https://bliulab.net/iPromoter-2L/server [20]. Мы обнаружили область, содержащую последовательности промоторов σ⁷⁰ и σ³² [20—22], которая располагались на 38 п.н. выше AZOBR_150176 или AMK58_10030. Следующий участок, содержащий последовательности промоторов σ⁷⁰ и σ³², был обнаружен выше гена flgB. Это позволяет предположить, что ген AZOBR_150176 может транскрибироваться независимо от генов flgB, flgC, fliE, fliQ2, fliR и flhB1, которые транскрибируются в том же направлении и, повидимому, образуют оперон. Последовательности σ³²- и σ⁷⁰-зависимых промоторов могут перекрываться [22].

В результате трехродительского скрещивания был получен мутант штамма Sp7 — Sp7.10030. У мутанта Sp7.10030 произошла замена гена AMK58_10030 на конструкцию HSHKDRR-Km. Можно было ожидать, что мутантный белок Sp7.10030 сохранит трансмембранные участки N-концевой области, PAS домены сенсорной части HSHK—RR и 64 аминокислотных остатка (домен His_Kin) гистидинкиназного домена (His_Kin), остальная часть белка будет утрачена, как и в случае HSHKDRR-Km мутанта штамма Sp245 (Lafˉ мутант Sp245.1062 [11]). Результаты РВ-ПЦР с использованием праймеров к утраченной части гена HSHK—RR (из последовательности гена было удалено 666 п.н. [11]) показали, что у Sp7.10030, как и у Sp245.1062 отсутствовал сигнал (рис. 1, 2). У родительских штаммов Sp7 и Sp245 относительный уровень транскрипции (ОУТ) HSHK—RR не отличался (см. рис. 2 а). В клетках Lafˉ мутанта Sp245.1062 транскрипция laf1 снижалась в 7,2 раза, а в случае Sp7.10030 в 2,3 раза(см. рис. 2 б). У штаммов Sp7 и Sp245 laf1 транскрибировался одинаково (см. рис. 2 б). Снижение уровня транскрипции laf1 позволяет ожидать нарушение биогенеза Laf и у мутанта Sp7.10030.

Рис. 1. Результаты РВ-ПЦР: а — схема участка хромосомной ДНК A. baldaniorum Sp245/A. brasilense Sp7/

Широкие горизонтальные стрелки указывают положение и ориентацию CDS; у мутантов HSHKDRR-Km произведена замена внутреннего фрагмента PstI (заштрихованный прямоугольник гена HSHK-RR) на кассету Km^R; б — доменная организация прогнозируемых продуктов трансляции гена HSHK-RR (HSHK-RR, гибридная сенсорная гистидин-киназа/регулятор ответа; 841 аминокислотный остаток): PAS, сенсорные домены PAS; His_Kin, домен гистидинкиназы; Resp_reg, принимающий домен регулятора ответа в системе передачи сигнала; в — результаты электрофореза в 2% агарозном геле продуктов РВ-ПЦР с кДНК Sp245 (дорожка 1), Sp245.1062(pRK415-150176) (дорожка 2), Sp245.1062 (дорожка 3), Sp7.10030 (дорожка 4), Sp7 (дорожка 5) с праймерами к области удаленного фрагмента ДНК (заштрихованный прямоугольник гена HSHK—RR (А)). Дорожка М — маркеры молекулярной массы GeneRuler 100 bp Plus (Fermentas) (набор из фрагментов длиной 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1031, 1200, 1500, 2000, 3000 н.п.).

Рис. 2. Результаты анализа транскрипции HSHK—RR ((панель А) AZOBR_150176 (Sp245) и AMK58_10030 (Sp7)) и laf1 ((панель Б) AZOBR_p410056 (Sp245) и AMK58_26185 (Sp7)) в клетках A. baldaniorum и A. brasilense.

Относительный уровень транскрипции (ОУТ) — отношение результатов ПЦР в реальном времени с кДНК исследуемых генов штаммов Sp245.1062, Sp7 и Sp7.10030 к аналогичным результатам Sp245 или Sp7. * — сигнал отсутствовал.

Мутанты Sp7.10030 и Sp245.1062 не отличались от родительских штаммов скоростью роста. Клетки мутантов синтезировали длинный Fla, при помощи которого плавали в жидких средах со скоростью, характерной для Sp7 или Sp245 (табл. 2). В среде с 0,2% агара мутанты, так же, как и родительские штаммы, формировали колонии одинакового размера. На средах с концентрацией агара 0,4% роящиеся клетки Laf^–-мутанта Sp245.1062 двигались медленнее клеток Sp245 и имели тенденцию к образованию колоний значительно меньшего диаметра. Такая же тенденция наблюдалась и в случае Sp7.10030 (см. табл. 2).

Таблица 2. Подвижность бактерий в жидкой и полужидкой малатно-солевых средах (МСС)

Примечания: бактерии инкубировали 24 ч в жидкой или 48 ч в полужидкой MCC; диаметр зоны инокуляции бактерий в полужидкой среде составлял 5.1±0.3 мм. Приведены средние значения±доверительные интервалы для 95% уровня значимости; различными буквами в столбцах обозначены статистически значимые различия (а и А — минимальные значения), выявленные с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA; P< .05).

У азоспирилл на средах, содержащих от 0.4% агара, происходит индукция синтеза Laf [5, 10]. Клетки штаммов Sp245 и Sp7, выросшие на плотных агаризованных средах, несут многочисленные Laf (рис. 3). В популяции Sp245.1062 13—18% клеток синтезировали редкие или единичные Laf, в случае Sp7.10030 доля таких особей составляла 42-45%. Остальные клетки Sp7.10030 были лишены Laf (см. рис. 3). Оба мутанта сохраняли синтез Fla. Клетки мутантов были короче клеток Sp245 и Sp7 (см. табл. 2).

Рис. 3. Просвечивающая электронная микроскопия клеток A. brasilense Sp7 и его мутанта Sp7.10030.

Бактерии выращивали при 30 °C в жидкой МСС 18 ч (1) или на агаризованной МСС 42 ч (2). Масштабная линейка соответствует 1 мкм. Электронную микроскопию клеток выполняли на микроскопе Libra 120 (Carl Zeiss, Германия).

В данной работе представлены результаты, свидетельствующие о сложной организации регуляторных сетей TCS у Azospirillum. Так, наличие в популяции Sp7.10030 и Sp245.1062 разной доли клеток, синтезирующих единичные Laf, может являться результатом пересечения HSHK—RR- зависимого пути с другими путями передачи сигналов TCS [4]. В геноме штамма A. brasilense Sp7 имеются четыре гомолога CheY, контролирующие плавание, реакции хемо- и аэротаксиса, влияющие на размер клеток, синтез Laf и роение [8]. Результаты мутагенеза N-концевого трансмембранного домена гистидинкиназы CheA1 из хемотактического пути Che1 показали его участие в регуляции длины клеток Sp7 в жидких средах [23]. Наличие N-концевого трансмембранного домена у CheA1 A. brasilense Sp7 является штамм-специфичной чертой, не выявленной у A. baldaniorum Sp245. Более того, в случае Sp245 мутация в гомологе гена cheA1 не оказала влияния на среднюю длину клеток этого штамма [23]. Анализ фенотипа полученных нами мутантов позволяет полагать, что исследуемая HSHK—RR является частью пути, контролирующего синтез многочисленных Laf и удлинение клеток. Например, одной из конечных мишеней передачи сигнала с участием HSHK—RR может являться регулятор ответа, положительно влияющий на синтез laf1. Эти процессы необходимы для эффективного роения азоспирилл — перемещения по полужидким средам, что позволяет им адаптироваться к механическому стрессу (повышению вязкости/плотности среды). Подобная морфологическая дифференциация характерна для A. baldaniorum, A. brasilense и других видов бактерий [8, 24, 25].

Финансирование. Финансирования не было.

Соблюдение этических стандартов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

В ходе исследования эксперименты на людях или животных не проводились.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.