Введение
Риккетсии — облигатные внутриклеточные грамотрицательные бактерии, являющиеся эндосимбионтами и/или паразитами клещей и ряда насекомых [1]. Род Rickettsia подразделяется на несколько групп — группы сыпного тифа (СТ) и клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ), а также базальные группы риккетсий (группы Rickettsia canadensis, «Candidatus Rickettsia mendelii» и Rickettsia bellii) [1, 2]. Самая многочисленная группа риккетсий — группа КПЛ, в ней насчитывается 29 видов, не менее 21 из которых являются патогенными для людей [1, 3]. Показано, что риккетсии могут с высокой степенью эффективности передаваться в клещах трансовариально и трансфазово [4, 5].
Распространенность разных видов риккетсий значительно варьирует в различных регионах (рис. 1). На территории Западной Сибири наиболее часто регистрируется сибирский клещевой тиф (СКТ), этиологическим агентом которого является Rickettsia sibirica subsp. sibirica [4, 6]. Также в регионе отмечены редкие случаи дальневосточного клещевого риккетсиоза, вызываемого Rickettsia heilongjiangensis [4, 7]. Обе инфекции имеют сходные клинические проявления, включая сыпь, первичный аффект на месте присасывания клеща, высокую температуру, головную и мышечную боль [4, 6]. Основными переносчиками R. sibirica и R. heilongjiangensis являются клещи Dermacentor spp. и Haemaphysalis concinna, соответственно. В редких случаях R. sibirica выявляется также в клещах H. concinna и Ixodes persulcatus, а R. heilongjiangensis — в I. persulcatus, I. pavlovskyi и Dermacentor nuttalli [8-13].
Рис. 1. Места сбора клещей на территории Западной Сибири и Республики Казахстан.
В последние годы на территории Западной Сибири были установлены случаи нетипичных для данного региона риккетсиозов, вызванных инфицированием Rickettsia raoultii, Rickettsia slovaca, Rickettsia aeschlimannii и «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» [14—16]. Среди «нетипичных» риккетсиозов наиболее часто наблюдались случаи инфицирования людей R. raoultii. Так, в Новосибирской области встречаемость риккетсиоза, вызываемого R. raoultii, была схожа со встречаемостью СКТ (32,1 и 43,4% от общего числа пациентов, инфицированных риккетсиями, соответственно), в то время как остальные риккетсиозы выявлялись в единичных случаях [15]. Клинические проявления риккетсиоза, вызванного R. raoultii, в основном неспецифичны; это объясняет, почему данный риккетсиоз ранее не был обнаружен на территории России. Как в случае инфицирования R. raoultii, так и в случае СКТ, у пациентов наблюдается лихорадка; сыпь и/или первичный аффект достоверно более часто были обнаружены у пациентов с СКТ, а неврологические симптомы — у пациентов, инфицированных R. raoultii [15].
Rickettsia raoultii выявляются преимущественно в клещах рода Dermacentor; также отмечены редкие находки данного вида в H. concinna, I. persulcatus и I. pavlovskyi [8, 10—12, 17]. Первоначально на основании анализа гена gltA было установлено три генотипа R. raoultii, прототипными штаммами для которых являются Marne (генотип RpA4), Elanda-23/95 (генотип DnS28) и Khabarovsk (генотип DnS14) [18, 19]. Позднее было показано, что на территории Дальнего Востока в Dermacentor silvarum широко распространен еще один генотип R. raoultii — Var-Ds [11].
В Казахстане также известны эндемичные регионы по клещевым риккетсиозам; наибольшая встречаемость зарегистрирована в Кызылординской и Северо-Казахстанской областях. В среднем заболеваемость риккетсиозами колеблется от 0,4 до 1,8 на 100 тыс. человек в год (~может превышать 300 случаев в год) [20—22]. Информация о видовом разнообразии риккетсий в Казахстане ограничена; к настоящему времени имеются данные лишь по нескольким областям Казахстана. Во всех исследованных областях в клещах рода Dermacentor была обнаружена R. raoultii [21—24]. Кроме того, в южном Казахстане в Dermacentor marginatus была выявлена ДНК R. slovaca, а в Haemaphysalis punctata — ДНК риккетсий, схожих с Rickettsia aeschlimanni [21, 24].
Клещи семейства Ixodidae играют важную роль в поддержании циркуляции риккетсий в природе и в инфицировании риккетсиями людей и других видов позвоночных. Входящие в данное семейство клещи рода Dermacentor являются основными переносчиками двух возбудителей риккетсиозов на территории Сибири — R. sibirica и R. raoultii. На территории Западной Сибири встречаются 4 вида Dermacentor spp. — D. reticulatus, D. marginatus, D. silvarum и D. nuttalli [25, 26]. Изучение инфицированности риккетсиями клещей данного рода имеет ключевое значение для установления эндемичных по клещевым риккетсиозам природных очагов на территории Западной Сибири.
Цель данной работы — изучение видовой принадлежности и генетического разнообразия риккетсий, выявляемых в клещах рода Dermacentor на территории Западной Сибири и Северного Казахстана.
Материал и методы
В исследование включили 571 клеща, включая 144 из Республики Алтай (136 D. nuttalli и 8 D. silvarum), 47 из Омской области (8 D. marginatus и 39 D. reticulatus), 181 из Новосибирской области (все D. reticulatus) и 199 из Костанайской области, Казахстан (13 D. marginatus и 186 D. reticulatus) (см. рис. 1). Dermacentor reticulatus из Омской области были сняты с мелких млекопитающих и претерпевали метаморфоз из стадии личинки в стадию нимфы в лабораторных условиях; 40 клещей из Костанайской области были сняты с животных (собаки и коровы). Все остальные клещи были собраны с растительности на флаг.
Видовая принадлежность клещей была установлена на основании морфологических признаков [26]. У ряда образцов вид клещей был дополнительно подтвержден на основании результатов секвенирования фрагмента внутреннего транскрибируемого спейсера ITS2, как описано ранее [12].
Выделение ДНК проводили с использованием коммерческого набора «Проба НК» (ДНК-технология, Москва) в соответствии с инструкцией производителя. ДНК риккетсий выявляли методом двухраундовой ПЦР в присутствии родоспецифичных праймеров из области гена gltA. Для положительных образцов был проведен второй раунд ПЦР в присутствии праймеров, специфичных к «Ca. R. tarasevichiae» и к риккетсиям из группы КПЛ, как описано ранее [11]. Идентификацию R. sibirica и R. raoultii проводили методом двухраундовой ПЦР в присутствии видоспецифичных праймеров из области гена поверхностного белка OmpA [11]. Для некоторых образцов R. raoultii были дополнительно определены нуклеотидные последовательности генов ompA (общей длиной 3266 н.п.) и ompB (4851 н.п.), в соответствии с методикой, описанной ранее [27, 28].
Полученные продукты ПЦР были очищены с использованием GTG-агарозы. Секвенирующие реакции проводили в объеме 30 мкл с использованием «BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit» («Applied Biosystems», США) в соответствии с инструкцией производителя. Продукты секвенирующей реакции были очищены GFX Columns («Amersham Biosciences», США). Нуклеотидные последовательности были определены с использованием ABI 3500 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», USA) и проанализированы с помощью программы BLASTN. Филогенетический анализ проводили с помощью пакета филогенетических программ MEGA7.0 с использованием метода максимального правдоподобия (ML). Достоверность полученных дендрограмм оценивали с помощью бутстрэп-анализа.
В базу данных GenBank были депонированы последовательности gltA, ompA и ompB генов R. raoultii (ON515499—ON515544), gltA гена R. aeschlimannii и R. aeschlimannii-like (ON515523, ON515524), а также gltA и ompB генов нового генотипа Rickettsia spp. Ko-97-Dr из группы КПЛ (ON515522, ON533890).
95% доверительный интервал (ДИ) уровня инфицированности клещей риккетсиями был рассчитан в программе MS Excel.
Результаты и обсуждение
Выявление ДНК риккетсий
На наличие ДНК риккетсий были исследованы образцы от 571 клещей рода Dermacentor (406 D. reticulatus, 136 D. nuttalli, 21 D. marginatus и 8 D. silvarum), собранных на территории четырех регионов Западной Сибири и Северного Казахстана. ДНК Rickettsia spp. была обнаружена во всех исследованных видах клещей; для разных видов уровень инфицированности варьировал от 47,6 до 87,5% и был наибольшим для D. nuttalli (табл. 1).
Таблица 1. Встречаемость различных видов риккетсий в клещах рода Dermacentor
| Вид клеща | N | N (%) клещей, содержащих ДНК риккетсий | |||||||
| все виды | Rr | Rs | Rr + Rs | Rt | Rr + Rt | Ra | R.sp | ||
| D. reticulatus | 406 | 196 (48,3) | 191 (47,0) | — | — | 1 (0,3) | — | 3 (0,7) | 1 (0,3) |
| D. nuttalli | 136 | 119 (87,5) | 90 (66,2) | 1 (0,7) | 27 (19,9) | — | 1 (0,7) | — | — |
| D. marginatus | 21 | 10 (47,6) | 8 (38,0) | — | 1 (4,8) | — | — | 1 (4,8) | — |
| D. silvarum | 8 | 6 (75,0) | 6 (75,0) | — | — | — | — | — | — |
| Все виды | 571 | 331 (58,0) | 295 (51,7) | 1 (0,1) | 28 (4,9) | 1 (0,1) | 1 (0,1) | 4 (0,7) | 1 (0,1) |
Примечание. N — количество клещей; Rr — R. raoultii; Rs — R. sibirica; Rt — «Ca. R. tarasevichiae»; Ra — R. aeschlimannii; R.sp. — Rickettsia spp.
Для всех выявленных образцов риккетсий была определена их видовая принадлежность; всего в клещах была обнаружена ДНК четырех видов: R. raoultii, R. sibirica, R. aeschlimannii, «Ca. R. tarasevichiae», а также нового генотипа Rickettsia spp. Ko-97-Dr. Все исследованные виды клещей наиболее часто были инфицированы R. raoultii; уровень инфицированности составил 47,0% (95% ДИ 42,2—51,9), 86,8% (95% ДИ 80,1—91,5), 42,8% (95% ДИ 24,5—63,5) и 75,0% (95% ДИ 40,9—92,9) (включая случаи смешанного инфицирования) для D. reticulatus, D. nuttalli, D. marginatus и D. silvarum, соответственно (табл. 1). Полученные результаты согласуются с литературными данными о высокой встречаемости R. raoultii в клещах Dermacentor spp. [8, 11, 17].
Известно, что Республика Алтай имеет одни из наиболее высоких показателей заболеваемости СКТ в РФ. В 2022 г. заболеваемость СКТ в Республике Алтай составила 66,5 на 100 тыс. населения в год, что существенно выше, чем, например, в соседней Новосибирской области (6,4 на 100 тыс.) [29, 30]. В настоящей работе ДНК R. sibirica была обнаружена в 20,6% D. nuttalli из Республики Алтай и в одном D. marginatus из Омской области; при этом за одним исключением R. sibirica была выявлена в виде микст-инфекции с R. raoultii. Интересно, что высокий уровень инфицированности D. nuttalli возбудителем СКТ наблюдался в одном участке в Усть-Коксинском районе (5/31; 16,1%; 95% ДИ 7,1—32,6) и в двух участках в Кош-Агачинском районе (16/35; 45,7%; 95% ДИ 30,5—61,8 и 7/40; 17,5%; 95% ДИ 8,8—47,0), в то время как на третьем участке в Кош-Агачинском районе ДНК R. sibirica не была обнаружена ни в одном из 30 исследованных D. nuttalli. Полученные результаты свидетельствуют о наличии природных очагов СКТ на территории Усть-Коксинского и Кош-Агачинского районов.
Помимо R. raoultii и R. sibirica, в единичных случаях в исследуемых клещах были выявлены нетипичные для Dermacentor spp. риккетсии. ДНК «Ca. R. tarasevichiae» была обнаружена в одном D. reticulatus из Омской области и одном D. nuttalli из Республики Алтай, а ДНК R. aeschlimannii — в трех D. reticulatus и одном D. marginatus из Костанайской области (Казахстан). Основными переносчиками для «Ca. R. tarasevichiae» являются I. persulcatus [8, 12], а для R. aeschlimannii — клещи рода Haemaphysalis. В частности, R. aeschlimannii были обнаружены в единичных Haemaphysalis на Дальнем Востоке [11], а R. aeschlimannii-like — в H. punctata на юге Казахстана [21, 24]. Нахождение R. aeschlimannii на севере Казахстана наряду с недавним выявлением R. aeschlimannii в клинических образцах пациентов в Новосибирской области [15] свидетельствует о возможном расширении ареала этого патогенного для людей вида риккетсий. Кроме того, в одном D. reticulatus из Костанайской области был обнаружен новый генотип риккетсий (Kos-97-Dr), существенно отличающийся от известных видов (табл. 1).
Генетическая характеристика выявленных риккетсий
Выявленные образцы R. sibirica были генотипированы по вариабельному гену ompA. Определенные последовательности гена ompA (длиной 488 н.п.) были идентичны для 22 проанализированных образцов и соответствовали последовательности Rickettsia sibirica subsp. sibirica (U83455).
Остальные виды риккетсий были генотипированы по гену gltA. Определенные последовательности гена gltA «Ca. R. tarasevichiae» соответствовали последовательности штамма Podgorodka-29/2003 (DQ168983) и другим известным последовательностям данного вида. Последовательности гена gltA R. aeschlimannii из трех D. reticulatus длиной 607 н.п. соответствовали последовательности штамма Stavropol (DQ235776), а последовательность R. aeschlimannii-like из D. marginatus (607 н.п.) отличалась от нее тремя нуклеотидными заменами, две из которых являлись несинонимичными. Проведенный филогенетический анализ показал, что последовательности R. aeschlimannii и R. aeschlimannii-like с высоким уровнем поддержки образуют общий кластер на дендрограмме (рис. 2).
Рис. 2. Дендрограмма, построенная ML методом на основе нуклеотидных последовательностей фрагмента гена gltA (610 п.н.) Rickettsia spp.
В узлах дендрограммы указаны индексы поддержки.
— D. nuttalli; ■ — D. silvarum; ▲ — D. marginatus; ♦ — D. reticulatus.
Новый генотип риккетсий (Kos-97-Dr) был охарактеризован по gltA и ompB генам. Данный изолят по фрагменту гена gltA (882 н.п.) был наиболее схож с R. raoultii штамм Khabarovsk (СР010969), уровень сходства составлял 95,3%; по фрагменту гена ompB (414 п.н.) наибольшее сходство (90,2%) наблюдалось с последовательностью «Candidatus Rickettsia uralica» (OM293672). Филогенетический анализ, проведенный по обоим генам, показал, что новый генотип Kos-97-Dr относится к группе КПЛ, но при этом существенно отличается от известных последовательностей и образует отдельную ветвь на дендрограммах (рис. 2).
Выявленные образцы R. raoultii отличались наиболее высокой генетической вариабельностью. На основании анализа фрагмента гена gltA длиной 610 н.п. было идентифицировано семь сиквенс-вариантов R. raoultii, различающихся между собой 1—4 нуклеотидными заменами. Из них четыре варианта соответствовали описанным ранее генотипам R. raoultii (RpA4, DnS14, DnS28 и Var-Ds), а три новых варианта были наиболее схожи с генотипом DnS28 и отличались от него 1—2 заменами (рис. 3). Результаты по встречаемости разных генотипов R. raoultii в разных видах клещей представлены в табл. 2. В D. nuttalli были идентифицированы два генотипа (DnS14 и DnS28), а в D. reticulatus из Западной Сибири — только один генотип — RpA4 (табл. 2). Аналогично, ранее генотипы DnS14 и DnS28 были выявлены в D. nuttalli на территории Алтая и Красноярского края, а генотип RpA4 — в D. reticulatus из различных областей Урала и Сибири [8, 17, 23]. Интересно, что наиболее высокое генетическое разнообразие R. raoultii наблюдалось в D. reticulatus из Северного Казахстана. В этих клещах были выявлены все варианты гена gltA, за исключением Var-Ds; при этом генотип RpA4 доминировал (табл. 2). Таким образом, некоторые генотипы R. raoultii чаще выявлялись в определенных видах клещей, однако эта ассоциация не является строгой. Проведенный филогенетический анализ по гену gltA показал, что все выявленные в данной работе варианты R. raoultii образуют общий кластер с прототипными штаммами (рис. 2).
Рис. 3. Конденсированное выравнивание последовательностей фрагмента гена gltA основных геновариантов и некоторых исследованных образцов R. raoultii.
Нуклеотидные позиции приведены по последовательности штамма R. raoultii Khabarovsk (AF120028)
Таблица 2. Распространение разных геновариантов Rickettsia raoultii в разных видах клещей из различных регионов
| Вид клеща (регион) | N клещей с ДНК R. raoultii | N генотипированных изолятов | N изолятов, принадлежащих геноварианту | ||||
| RpA4 | DnS14 | DnS28 | Var-Ds | новые генотипы | |||
| D. reticulatus (Омская область) | 23 | 23 | 23 | — | — | — | — |
| D. reticulatus (Новосибирская область) | 64 | 22 | 22 | — | — | — | — |
| D. reticulatus (Костанайская область) | 104 | 67 | 43 | 7 | 14 | — | 3 |
| D. marginatus (Омская область) | 5 | 5 | 1 | — | 1 | 3 | — |
| D. marginatus (Костанайская область) | 4 | 4 | 3 | 1 | — | — | — |
| D. nuttalli (Республика Алтай) | 118 | 39 | — | 19 | 20 | — | — |
| D. silvarum (Республика Алтай) | 6 | 6 | — | 1 | - | 5 | — |
Генетическая характеристика R. raoultii по протяженным фрагментам генов ompA и ompB
Поскольку основные генотипы R. raoultii различаются лишь единичными заменами по консервативному гену gltA, остается открытым вопрос, соответствуют ли разные генотипы отдельным филогенетическим кластерам по вариабельным генам поверхностных белков. Для ответа на этот вопрос некоторые изоляты R. raoultii, принадлежащие к четырем основным генотипам по gltA гену и выявленные в различных исследованных регионах, были дополнительно охарактеризованы по протяженным фрагментам генов ompA и ompB.
Для 18 образцов были определены последовательности двух фрагментов гена ompA общей длиной более 3282 н.п. Длина первого фрагмента, расположенного на 5’-конце гена, составила 450—540 п.н., а второго фрагмента — 2832—2841 н.п. Определенные последовательности гена ompA образцов, относящихся к генотипам DnS14 (n=5), RpA4 (n=7), DnS28 (n=3) и Var-Ds (n=3) были идентичны для каждого генотипа. Последовательности генотипов DnS28 и Var-Ds были наиболее схожи между собой и различались одной заменой, в то время как генотипы DnS14, RpA4 и DnS28 по исследуемому фрагменту различались 10—12 заменами. Сравнение определенных последовательностей с соответствующими последовательностями прототипных штаммов показало 100% сходство со штаммами Khabarovsk (генотип DnS14) и Marne (генотип RpA4) и 99,97% сходство (1 замена) со штаммом Elanda-23/95 (генотип DnS28). Проведенный филогенетический анализ по гену ompA показал наличие трех кластеров, соответствующих генотипам DnS14, RpA4 и DnS28-Var-Ds (рис. 4).
Рис. 4. Дендрограмма, построенная ML методом на основе нуклеотидных последовательностей фрагмента гена ompA (3266 п.н.) Rickettsia raoultii. В узлах дендрограммы указаны индексы поддержки.
— D. nuttalli; ■ — D. silvarum; ▲ — D. marginatus; ♦ — D. reticulatus.
Последовательности гена ompB длиной 4839—4851 н.п. были определены для 10 образцов. Определенные последовательности образцов, относящихся к генотипам DnS14 (n=2), DnS28 (n=2) и Var-Ds (n=2), были одинаковыми для каждого генотипа, но отличались от соответствующих последовательностей прототипных штаммов из базы данных GenBank. Последовательности образцов, относящихся к генотипам DnS28 и Var-Ds, были наиболее схожи и различались одной заменой. На основании анализа гена ompB генотип DnS14 является наименее вариабельным; проанализированные в данной работе образцы из Республики Алтай полностью соответствовали штамму BIME (СР098324) из Китая, но отличались пятью нуклеотидными заменами от других штаммов с Дальнего Востока (штамм Khabarovsk (DQ365798)) и Китая (штамм IM16 (СР019435)). Образцы, относящиеся к генотипу RpA4, показали наибольшее генетическое разнообразие. Всего было идентифицировано 13 вариантов последовательностей, относящихся к генотипу RpA4 (4 из данной работы и 9 из базы GenBank), различающихся между собой 1—8 нуклеотидными заменами, а также делециями в 3 и 9 н.п. Интересно, что последовательность одного образца из Омской области (Om-44-Dr) полностью соответствовала последовательности образца из Калининградской области (Kaliningrad-31), несмотря на значительное расстояние между этими областями (рис. 5).
Рис. 5. Дендрограмма, построенная ML методом на основе нуклеотидных последовательностей фрагмента гена ompB (4855 п.н.) Rickettsia raoultii. В узлах дендрограммы указаны индексы поддержки.
— D. nuttalli; ■ — D. silvarum; ▲ — D. marginatus; ♦ — D. reticulatus.
Сравнение всех известных последовательностей исследуемого фрагмента гена ompB (10 из данной работы и 13 из базы данных GenBank) показало, что они различаются между собой 1—23 нуклеотидными заменами, а также наличием делеций в 3 и 9 н.п. Проведенный филогенетический анализ изолятов R. raoultii по гену ompB также показал наличие трех кластеров. Первый кластер включает образцы, относящиеся к генотипу RpA4; второй кластер состоит из образцов генотипа DnS14 и штамма Elanda-23/95, являющегося прототипным для генотипа DnS28; третий кластер включал образцы из данной работы, относящиеся к генотипам DnS28 и Var-Ds (рис. 5).
Таким образом, проведенный анализ последовательностей ompA и ompB генов R. raoultii достоверно показал наличие трех генетических групп, которые в основном соответствуют различным генотипам по консервативному гену gltA. Исключение составляют генотипы Var-Ds и DnS28, которые образуют общие кластеры по ompA и ompB генам (см. рис. 4, 5); это позволяет рассматривать Var-Ds как один из вариантов генотипа DnS28. Интересно, что штамм Elanda-23/95 относится к разным филогенетическим кластерам по ompA и ompB генам (рис. 4, 5). Мы полагаем, что штамм Elanda-23/95 не следует рассматривать как типовой штамм для генотипа DnS28, поскольку последовательность гена ompB этого штамма значительно отличается от последовательностей других изолятов данного генотипа.
Заключение
Таким образом, в клещах рода Dermacentor, обитающих на территории Западной Сибири и Северного Казахстана, были обнаружены как типичные для Dermacentor spp. виды риккетсий (R. sibirica и R. raoultii), так и нетипичные виды (R. aeschlimannii, «Ca. R. tarasevichiae»). Показано существование природных очагов СКТ на территории Республики Алтай. В одном D. reticulatus был обнаружен новый генотип Kos-97-Dr, который нельзя отнести ни к одному из известных видов группы КПЛ.
На основании анализа фрагмента гена gltA было идентифицировано 7 различных аллельных вариантов R. raoultii, 4 из которых соответствовали описанным ранее генотипам. В D. nuttalli были идентифицированы два генотипа (DnS14 и DnS28), а в D. reticulatus преобладал генотип — RpA4. Проведенный анализ ряда изолятов R. raoultii по протяженным фрагментам генов ompA и ompB показал наличие трех генетических групп, которые в основном соответствуют различным генотипам по консервативному гену gltA: 1). DnS14; 2). RpA4; 3). DnS28-Var-Ds. Исключение составляет штамм Elanda-23/95, относящийся к группе DnS28-Var-Ds по гену ompA и к группе DnS14 по гену ompB.
Финансирование работы
Работа поддержана проектом Государственного задания ИХБФМ СО РАН (№121031300043-8).
Соблюдение этических стандартов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.