Введение

Хантавирусы, принадлежащие роду Orthohantavirus семейства Hantaviridae, широко распространены во многих регионах мира и являются возбудителями двух клинических форм заболевания человека: геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) и хантавирусного кардио-легочного синдрома (ХЛС) [1, 2]. В настоящее время для обозначения заболеваний человека, вызванных хантавирусами, международным сообществом предлагается использовать термин «хантавирусное заболевание» вместо терминов ГЛПС и ХЛС [3]. Это связано с накоплением данных об общей природе нарушений в организме человека, вызванных разными видами хантавирусов. Установлено, что на территории Евразии возбудителями хантавирусного заболевания являются вирусы Хантаан (HTNV), Сеул (SEOV), Добрава/Белград (DOBV), Пуумала (PUUV) и Тула (TULV).

Долгое время TULV относили к непатогенным для человека хантавирусам. Основанием для этого служило отсутствие зарегистрированных случаев хантавирусного заболевания, вызванных TULV, а также использование отличающегося от других патогенных хантавирусов рецептора, отвечающего за связывание и проникновение TULV в клетку [4]. Однако со временем в литературе стали накапливаться данные, которые давали основания предполагать патогенность TULV для человека. Исследование более 500 образцов сывороток, взятых у работников лесного хозяйства в Германии, выявило 3,9% сывороток, реагирующих исключительно с антигеном вируса TULV [5]. Анализ методом реакции нейтрализации более широкой выборки, 6500 образцов сывороток, представляющих репрезентативную популяцию жителей Германии, также подтвердил случаи инфицирования TULV. Все известные к настоящему времени прямые молекулярные доказательства TULV-инфекции у человека получены в европейских странах. Впервые заболевание, ассоциированное с TULV с тяжелым клиническим течением на фоне иммунодефицита, было диагностировано молекулярно-генетическими и серологическими методами в 2003 г. в Чехии [6]. Второй случай с легкой клинической формой хантавирусного заболевания выявлен у иммунокомпетентного пациента без сопутствующих заболеваний из Франции [7]. Третий случай заболевания с типичными проявлениями хантавирусной инфекции выявлен в Германии также у иммунокомпетентного человека [8]. Все эти случаи обусловлены заражением вариантами TULV, циркулирующими среди обыкновенных полевок (Microtus arvalis).

Причиной редкого выявления TULV-ассоциированных заболеваний человека может быть значительное генетическое и антигенное сходство с другим патогенным для человека хантавирусом, PUUV, циркулирующим среди рыжих полевок (Myodes glareolus) и широко распространенным на территории Европы и части Азии [9]. Поскольку антитела к TULV и PUUV не могут быть дифференцированы с помощью стандартных серологических тестов (за исключением реакции нейтрализации), заболевание, вызванное вирусом TULV, при рутинном анализе может быть ошибочно диагностировано как хантавирусная инфекция, вызванная PUUV.

Вирус Тула (TULV) впервые был изолирован от обыкновенной (M. arvalis) и восточноевропейской (M. rossiaemeridionalis) полевок, отловленных в европейской части России [10]. Дальнейшие исследования показали широкое распространение TULV на территории Евразии, при этом обнаружено 11 генетических вариантов вируса [11—17]. Основным природным резервуаром TULV является обыкновенная полевка, включая кариоформу obscurus, рассматриваемую иногда как самостоятельный подвид или даже вид [12—14, 17]. Помимо M. arvalis и M. rossiaemeridionalis, TULV выявлен у многих других видов полевок: темных полевок (M. agrestis), кустарниковых полевок (M. majori), подземных полевок (Terricola subterraneus, ранее Microtus subterraneus), узкочерепных полевок (Lasiopodomys gregalis, ранее Microtus gregalis), водяных полевок (Arvicola amphibius) и степных пеструшек (Lagurus lagurus) на обширной территории Евроазиатского континента от Бельгии, Франции и Германии до Турции, Казахстана и Китая. Как правило, выявляют видоспецифическое и географическое группирование штаммов TULV. Однако в местах совместного обитания разных видов серых полевок рода Microtus наблюдается циркуляция одного варианта вируса в популяциях M. arvalis и M. agrestis, M. arvalis и M. rossiaemeridionalis. В России ранее выявлены пять генетических вариантов TULV [10, 15—17], два из которых циркулируют в Сибири на территории Омской и Новосибирской областей среди L. gregalis и L. lagurus [16].

Способность TULV от M. arvalis вызывать хантавирусное заболевание даже у исходно здоровых людей свидетельствует о его патогенном потенциале и ставит задачу изучения распространения TULV среди различных видов природных носителей на территории РФ. В данном исследовании представлены новые данные по выявлению и идентификации вариантов TULV, циркулирующих на территории Сибири.

Материал и методы

Экспедиции по отлову мелких млекопитающих и сбору образцов были проведены в 2007—2008 гг. в различных регионах Западной Сибири (Республике Алтай, Кемеровской, Новосибирской и Томской областях, Алтайском и Красноярском краях). Отлов мелких млекопитающих и отбор образцов осуществляли в соответствии с протоколом и рекомендациями по безопасной работе, согласно МУ 3.1.1029-01. утв. 06.04.2001.

Таксономическая принадлежность млекопитающих определена на основе анализа морфологических признаков [18] и путем сравнения с базой данных GenBank фрагмента гена цитохрома b митохондриальной ДНК. На протяжении последних десятилетий статус и названия таксонов внутри группы полевочьих часто менялись. В данной работе названия таксонов грызунов приведены согласно таксономической сводке по млекопитающим России [19]. В отдельных случаях при необходимости приводятся прежние названия таксонов.

Инфицированных хантавирусами животных выявляли путем детекции вирус-специфических антител в сыворотках крови и/или хантавирусной РНК в образцах легких. Специфические антитела к хантавирусу в сыворотках крови грызунов выявляли непрямым методом флюоресцирующих антител, применяя культуральный диагностикум антигенов вирусов Hantaan, Seoul, Puumala.

Фрагменты ткани легких помещали в раствор RNAlater для последующего выделения РНК и ее анализа методом обратной транскрипции — полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Суммарную РНК выделяли из тканей легких набором RNeasy MiniKit («Qiagen», Германия). Для обратной транскрипции применяли обратную транскриптазу Expand («Roche», Швейцария) и универсальный олигонуклеотидный праймер (OSM55, 5’-TAGTAGTAGACTCC-3’), сконструированный на основе консервативных последовательностей 3’-концов S-, M- и L-сегментов хантавирусов. Для предварительного скрининга посредством гнездовой ОТ-ПЦР использовали родоспецифичные праймеры к участку L-сегмента [20]. Праймеры, специфичные для S-сегмента генома (позиции 361-1219) вируса Тула, описаны нами ранее [17]. Полученные ампликоны разделяли электрофорезом в 1,2% агарозном геле, затем проводили их очистку набором QIAQuick Gel Extraction Kit («Qiagen», Германия). Прямое секвенирование ДНК выполняли на автоматическом анализаторе ABI Prism 310 («Applied Biosystems», США).

Выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью алгоритма ClustalW в программе MEGAX [21]. Для построения филогенетических деревьев использовали метод ближайших соседей (NJ) с моделью эволюции Tamura-Nei и метод максимального правдоподобия ML с моделью GTR+I+Г. Вычисления проводили для 1000 итераций.

Результаты

Первичный скрининг сывороток крови от 254 грызунов подсемейства Arvicolinae (11 M. agrestis, 80 Alexandromys oeconomus, 151 L. gregalis, 12 L. lagurus), отловленных на территории шести административных регионов Сибири, проведен методом непрямого иммунофлюоресцентного анализа. Специфические антитела к хантавирусам выявлены у полевок-экономок (Alexandromys oeconomus), темных полевок (Microtus agrestis), узкочерепных полевок (Lasiopodomys gregalis), степных пеструшек (Lagurus lagurus) в Алтайском и Красноярском краях, Томской, Новосибирской областях и Республике Алтай (рис. 1, см. https://mediasphera</strong>.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_02_045_add.zip; см. таблицу). Титры антител к хантавирусам у животных варьировали от 1:40 до 1:320. Образцы тканей легких всех сероположительных полевок исследованы методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров к L- и S-сегментам вирусного генома. Вирусная РНК обнаружена в 6 образцах: 4/7 сероположительных L. gregalis и 2/4 L. lagurus. В сероположительных образцах от темных полевок и полевок-экономок вирусная РНК не обнаружена. Вирусная РНК не выявлена в образцах от L. gregalis из Томской области, хотя данный вид доминировал в отловах и у 6% особей выявляли специфические антитела к хантавирусам. Для последующего филогенетического анализа взаимосвязей российских штаммов TULV нами дополнительно получены последовательности L-сегмента вирусного генома от двух обыкновенных полевок формы obscurus, отловленных на территории Республики Крым, в которых ранее была обнаружена РНК вируса TULV [17].