Введение
HBsAg — основной серологический маркер инфекции гепатита B. На сегодняшний день описано не менее восьми генотипов вируса гепатита B (ВГВ) [1—7] и не менее девяти субтипов (серовариантов) данного белка [1—3]. В Российской Федерации (РФ) преимущественно распространены генотипы ВГВ A, C, D [8—10, 12—15] и субтипы HBsAg ayw2, ayw3, adw2, adrq+ [8—11]. Нашей группой ранее была разработана методика с применением панели моноклональных антител (МАТ), позволяющая методом иммуноферментного анализа (ИФА) определять основные встречающиеся на территории РФ [12] сочетания генотипов ВГВ и субтипов HBsAg: D/ayw2, D/ayw3, A/adw2, C/adrq+. В предыдущей работе мы представили результаты сравнительных испытаний, проведенных на выборке из 146 положительных образцов плазмы крови коренных народностей Сибири [16].
Цель работы — сравнительное определение генотипов ВГВ и субтипов HBsAg в HBsAg-положительных образцах сыворотки крови из трех регионов РФ с помощью разработанных нами реагентов и молекулярно-биологическими методами, а также подведение итогов путем объединения новых данных с предыдущими результатами сравнительных испытаний.
Материал и методы
HBsAg-положительные образцы. В сравнительные испытания по определению генотипов ВГВ и субтипов HBsAg вошли 49 HBsAg-положительных образцов сыворотки крови из Барнаула, собранные в 2018—2019 гг.; 43 HBsAg-положительных образца сыворотки крови из Краснодарского края, собранные в 2018 г.; 35 HBsAg-положительных образцов сыворотки крови из Благовещенска, собранные в 2017 г. Для отбора HBsAg-положительных образцов сыворотки крови использовали наборы реагентов АО «Вектор-Бест» (Россия). Верификация наличия HBsAg в образцах была проведена реакцией нейтрализации специфическими антителами в подтверждающем тесте. Все образцы до исследования хранились в морозильной камере при –20—40 °C.
Определение генотипов ВГВ/субтипов HBsAg с помощью разработанной методики с применением панели МАТ
HBsAg-положительные образцы были исследованы согласно методике, описанной в статье [16], на основе стандартизованного протокола исследования HBsAg-положительных сывороток с четырьмя конъюгатами высокоспецифических моноклональных антител, меченых пероксидазой хрена, в ИФА.
Молекулярно-биологические методы
Выделение ДНК, амплификацию участка генома длиной 934 п.о., включающего область, кодирующую S-ген, определение нуклеотидной последовательности выделенных изолятов вируса проводили согласно методике, описанной в статье [17]. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей осуществляли методом Maximum Likelihood. Для определения генотипа выделенных нуклеотидных последовательностей использовали прототипные последовательности геномов ВГВ разных генотипов из международной электронной базы данных GenBank. Трансляцию нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программного обеспечения MEGA7. Для выделенных изолятов вируса по выведенным аминокислотным остаткам в положениях 122, 127, 134, 140, 159, 160 устанавливали предсказанные субтипы HBsAg (подробное описание в статье [17]).
Описание методов статистического анализа
Материалы исследования были подвергнуты статистической обработке с использованием методов параметрического и непараметрического анализа. Накопление и систематизацию исходной информации и визуализацию полученных результатов осуществляли в Microsoft Office Excel 2016. Статистический анализ проводили с использованием программы Excel.
В тех случаях, когда количество ожидаемых наблюдений в любой из ячеек четырехпольной таблицы было <5, для оценки уровня значимости различий использовали точный критерий Фишера, который рассчитывали по формуле:
где A, B, C, D — фактические количества наблюдений в ячейках таблицы сопряженности, N — общее число исследуемых, ! — факториал, который равен произведению числа на последовательность чисел, каждое из которых меньше предыдущего на 1.
Полученное значение точного критерия Фишера p<0,05 свидетельствовало об отсутствии статистически значимых различий; значение p<0,05 — об их наличии.
Результаты
Определение генотипов ВГВ/субтипов HBsAg с помощью разработанной методики с применением панели МАТ
Для 127 валидных результатов, полученных в нашем исследовании с помощью разработанных реагентов, соотношение генотипов ВГВ/субтипов HBsAg было следующим: 65 (51,6%) образцов — генотип D/ayw2, 47 (36,5%) — генотип D/ayw3, 14 (11,1%) — генотип A/adw2, 1 (0,8%) — генотип C/adrq+ (табл. 1). Преобладание генотипа D ВГВ и субтипов ay- (ayw2, ayw3) HBsAg, полученное в данном исследовании, согласуется с известными на сегодняшний день данными о распространенности генотипов ВГВ и субтипов HBsAg в России [9—15]. Увеличение доли субтипа adw2 до 23% в Благовещенске, похоже, характерно для городов Дальневосточного региона, граничащих с КНР, где субтип adw HBsAg представлен весьма значительно [18]. Так, в исследовании, проведенном нами ранее с альтернативной панелью МАТ, любезно предоставленной P. Swenson [19], частота встречаемости данного субтипа среди HBsAg-положительных образцов Владивостока и Хабаровска достигала 24 и 27% соответственно [20] (см. табл. 1).
Таблица 1. Результаты определения генотипов ВГВ/субтипов HBsAg, полученные при исследовании HBsAg-положительных образцов сыворотки крови с помощью разработанных реагентов, по регионам (абсолютные единицы (%))
| Регион | Генотип D/ayw2 | Генотип D/ayw3 | Генотип A/adw2 | Генотип C/adrq+ | Всего |
| Барнаул | 20 (41) | 28 (57) | 0 | 1 (2) | 49 (100) |
| Благовещенск | 16 (46) | 11 (31) | 8 (23) | 0 | 35 (100) |
| Краснодар | 29 (67) | 8 (19) | 6 (14) | 0 | 43 (100) |
| Итого | 65 (51,6) | 46 (36,5) | 14 (11,1) | 1 (0,8) | 127 (100) |
Сопоставление результатов определения генотипов ВГВ и субтипов HBsAg, полученных с помощью разработанных реагентов и молекулярно-биологическими методами
Двумя методами одновременно было проанализировано 98 образцов (табл. 2), для 29 HBsAg-положительных образцов уровень ДНК ВГВ был ниже детектируемого («РеалБест ДНК ВГВ», чувствительность набора 5 МЕ/мл). При определении генотипа ВГВ совпадение результатов двух методов было получено в 100% (98/98) случаев во всех группах. Совпадение результатов двух методов при определении субтипов HBsAg было получено в среднем в 92% (90/98) случаев. При этом доли совпавших результатов двух методов при субтипировании HBsAg-положительных образцов Барнаула (86%), Благовещенска (96%) и Краснодара (94%) статистически не отличаются на уровне значимости 0,05 (точный критерий Фишера) (см. табл. 2).
Таблица 2. Совпадение результатов определения генотипов ВГВ/субтипов HBsAg в HBsAg-положительных образцах, исследованных двумя методами одновременно
| Регион | Результаты, полученные с помощью разработанных реагентов (абс. число) | Результаты, полученные двумя методами (абс. число) | Определение генотипов ВГВ: количество совпавших результатов (%) | Определение субтипов HBsAg: количество совпавших результатов (%) |
| Барнаул | 49 | 36 | 36/36 (100) | 31/36 (86) |
| Благовещенск | 35 | 27 | 27/27 (100) | 26/27 (96) |
| Краснодар | 43 | 35 | 35/35 (100) | 33/35 (94) |
| Итого | 127 | 98 | 98/98 (100) | 90/98 (92) |
Тем не менее в 8 (8/98 (8%)) случаях были получены разноречивые результаты при определении субтипов HBsAg двумя методами (табл. 3). Для 2 (2%) изолятов вируса из 98 согласно выведенной аминокислотной последовательности предсказан субтип ayw4 HBsAg, что не предусмотрено предлагаемыми реагентами (определены как субтип ayw3); для 5 (5%) образцов нет возможности предсказать субтип HBsAg из-за замен либо «нечитаемых» аминокислотных остатков в выведенной аминокислотной последовательности; для 1 (1%) образца причины несовпадений выяснить не удалось.
Таблица 3. Несовпадающие результаты восьми образцов при определении субтипов HBsAg двумя методами
| №п/п | Регион | Номер образца | Анализ ДНК ВГВ | МАТ в ИФА | Предполагаемые причины несоответствий | ||
| генотип ВГВ | субтип HBsAg | генотип ВГВ | субтип HBsAg | ||||
| Образцы с субтипом ayw4 | |||||||
| 1 | Барнаул | 23 | D | ayw4 | D | ayw3 | Набор не выявляет ayw4 |
| 2 | Барнаул | 35 | D | ayw4 | D | ayw3 | Набор не выявляет ayw4 |
| Образцы с заменами или «нечитаемыми» аминокислотными остатками | |||||||
| 3 | Барнаул | 11 | D | a?w2 | D | ayw2 | Невозможно предсказать детерминанту y/d («нечитаемый» ао в 122 п) |
| 4 | Краснодар | 00907 | D | a?w2 | D | ayw2 | Невозможно предсказать детерминанту y/d («нечитаемый» ао в 122 п) |
| 5 | Барнаул | 45 | D | ayw? | D | ayw2 | Невозможно предсказать детерминанту w1/2/3/4 («нечитаемый» ао в 127 п) |
| 6 | Благовещенск | 12 | A | adw 127S | A | adw2 | Невозможно предсказать детерминанту w1/2/3/4 (замена 127S) |
| 7 | Краснодар | 01709 | D | ? | D | ayw3 | Невозможно предсказать субтип (замена 122T и «нечитаемый» ао в 127, 134 п) |
| Образец с неустановленными причинами расхождения | |||||||
| 8 | Барнаул | 20 | D | ayw3 | D | ayw2 | Причины не установлены |
Таким образом, в данном исследовании доля расхождений при определении субтипов HBsAg двумя методами составила 8%.
Объединение результатов с полученными в предыдущих исследованиях
В наших предыдущих работах [16, 21] совпадение результатов определения генотипов ВГВ и субтипов HBsAg, полученных двумя методами (с помощью разработанных реагентов и молекулярно-биологическими методами) составило 98% (89/91) [16] и 98,8% (81/82) [21] при определении генотипов ВГВ и 85% (77/91) при определении субтипов HBsAg (табл. 4). В данной работе эти параметры достигли показателей 100% (98/98) и 92% (90/98) соответственно. Объединение этих групп данных (см. табл. 4) позволяет нам подвести итоги сравнительных испытаний по определению генотипов ВГВ и субтипов HBsAg в HBsAg-положительных образцах плазмы/сыворотки крови, исследованных одновременно с помощью разработанных реагентов и молекулярно-биологическими методами: совпадение 98,9% (268/271) при генотипировании ВГВ и 88,4% (167/189) при субтипировании HBsAg.
Таблица 4. Сопоставление результатов определения генотипов ВГВ/субтипов HBsAg в HBsAg-положительных образцах с помощью разработанных реагентов и молекулярно-биологическими методами в текущем и предыдущем исследованиях
| Исследование | Доля совпавших результатов при исследовании двумя методами | |
| генотип ВГВ | субтип HBsAg | |
| Предыдущее исследование [16] | 97,8% (89/91) | 85% (77/91) |
| Предыдущее исследование [21] | 98,8% (81/82) | — |
| Текущее исследование | 100,0% (98/98) | 92% (90/98) |
| Итого | 98,9% (268/271) | 88,4% (167/189) |
Обсуждение
Разработанная и апробированная авторами методика позволяет установить генотипы ВГВ A, C, D и субтипы HBsAg до 3-й буквы (ayw2, ayw3, adw2, adrq+). Ранее было показано, что с ее помощью возможно определение генотипов ВГВ в образцах сыворотки крови, содержащих HBsAg, даже с отрицательным результатом молекулярного генотипирования ВГВ [22], в том числе у пациентов с гепатитом D [21]. В результате апробации разработанных реагентов [16] на выборке HBsAg-положительных образцов сыворотки крови из разных регионов Сибирского федерального округа РФ нами был обнаружен субтип ayw4 HBsAg генотипа D ВГВ, который был установлен на основе предсказанной аминокислотной последовательности изолята ВГВ и подтвержден в ИФА с помощью альтернативной панели МАТ по методике, описанной P. Swenson и соавт. [19]. Образец с субтипом ayw4 был включен в состав стандартной панели сывороток крови, содержащей разные субтипы и мутантные формы HBsAg вируса гепатита B [23], предназначенной для оценки возможности коммерческих иммуноферментных тест-систем выявлять циркулирующие на территории РФ субтипы этого антигена. Однако разработанные реагенты имеют ограничения из-за отсутствия в достаточном количестве образцов крови, содержащих ВГВ других известных генотипов ВГВ/субтипов HBsAg, необходимых для выбора дополнительных МАТ. Поиск HBsAg-положительных образцов, содержащих другие известные генотипы ВГВ/субтипы HBsAg, а также поиск МАТ, способных специфически их отличить (в том числе генотип D/субтип ayw4 HBsAg), будет продолжен.
Заключение
Полученные объединенные результаты позволяют говорить о хорошей корреляции при определении генотипов ВГВ/субтипов HBsAg с помощью разработанной методики с применением панели МАТ методом ИФА и молекулярно-биологическими методами. Результаты свидетельствуют о том, что набор подходит для скрининговых исследований по определению генотипов ВГВ/субтипов HBsAg в образцах сыворотки/плазмы крови, содержащих HBsAg, на территории РФ. Кроме того, данная методика может хорошо дополнить молекулярные методы в случаях, когда недоступен анализ нуклеиновой кислоты ВГВ (нет специального оборудования либо не удается выделить ДНК ВГВ при наличии специального оборудования). Предлагаемая методика определения генотипов ВГВ/субтипов HBsAg в HBsAg-положительных образцах сыворотки или плазмы крови с помощью панели МАТ доступна и проста в использовании.
Финансирование
Работа проведена в основном без специальной финансовой поддержки. Участие С.В. Нетесова было поддержано в рамках Государственного задания по финансированию НИР в Новосибирском государственном университете №FSUS-2020-0035 и Программы повышения конкурентоспособности российских университетов ТОП-100 НГУ.
Соблюдение этических стандартов.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.