Распространение устойчивости патогенных бактерий к различным лекарственным препаратам является глобальной социально-значимой проблемой современности. Особую опасность представляет чрезвычайно быстрое приобретение возбудителями особо опасных инфекций множественной резистентности к антибиотикам. К таким возбудителям относится Vibrio cholerae серогруппы О1 биовара Эль Тор, вызвавший последнюю, 7-ю, пандемию холеры, начавшуюся в 1961 г. и продолжающуюся до настоящего времени [1]. Глобальное распространение холеры из первичного очага (Бенгальского залива) в другие страны мира происходило тремя перекрывающимися волнами [2].

При лечении холеры, помимо растворов регидратационных солей, применяют различные антибиотики [3]. Это способствовало появлению штаммов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью, и ее угрожающему распространению среди различных штаммов возбудителя холеры.

Изучение механизмов возникновения резистентности и распространения бактериальных генов, ответственных за резистентность у холерных вибрионов, показало исключительно важную роль в этом процессе интегративного конъюгативного элемента (ICE от integrative conjugating element) SXT, относящегося к семейству SXT/R391. Впервые этот мобильный элемент обнаружили в штамме V. cholerae МО10 О139 серогруппы, выделенном в Индии в 1992 г. [4]. Впоследствии SXT был приобретен многими штаммами V. cholerae серогруппы О1 посредством горизонтального переноса. Установлено, что SXT, внедренный в 5’-конец хромосомного гена pfrC, кодирующего вспомогательный фактор терминации транскрипции [5, 6], имеет мозаичную структуру. В его состав входят консервативные последовательности (52 гена), кодирующие его внедрение в хромосому, вырезание и конъюгативный перенос, а также 4 вариабельных региона (Variable Regions, VRI — IV), включенных в 5 сайтов, названных горячими точками интеграции (Hot Spots, или HSs) [6, 7]. Среди последних интерес представляет VRIII, содержащий отдельный блок генов floR, strAB, sul2 и dfrA1, кодирующих устойчивость к хлорамфениколу, стрептомицину, сульфаметоксазолу и триметоприму соответственно. Большинство встроенных в SXT генов резистентности (floR, strAB и sul2) находится в участке размером 23 т.п.н., включенном в ген rumB. Этот участок, окруженный генами транспозаз, представляет собой сложную транспозоноподобную структуру, что не исключает возможность ее участия в появлении разных вариантов SXT в результате индуцированных геномных перестроек [6]. В то же время ген dfrA1 отделен от данной области последовательностью ДНК размером около 70 т.п.н. (рис. 1, а). Известно, что SXT элемент нестабилен и его структура быстро меняется в ходе эволюции возбудителя. В настоящее время известно более 30 его типов [8]. Среди клинических штаммов V. cholerae Эль Тор наиболее распространены четыре типа: ICEVchInd5/ICEVchBan5, ICEVchMoz10/ICEVchBan9, ICEVchBan11 и ICEVchInd9 [7]. Основное различие между ними — разный набор генов резистентности к антибиотикам. Последствием большой пластичности генома SXT является различная резистентность штаммов возбудителя холеры к лекарственным препаратам.

Другой путь формирования резистентных штаммов вибрионов Эль Тор — спонтанные мутации в бактериальной хромосоме. Наиболее значимые из них — мутации генов, обеспечивающие устойчивость холерных вибрионов к налидиксовой кислоте, которая относится к фторхинолонам — группе синтетических антимикробных препаратов. Впервые резистентные к налидиксовой кислоте штаммы появились в 1995 г. в Индии. Однако с 2001 г. такие штаммы широко распространились в странах Южной Азии и Африки [9]. Устойчивость к новому антибиотику была обусловлена двумя точечными мутациями в генах gyrA (VC1258) и parC (VC2430), приводящими к замене серина (Ser) на изолейцин (Ile) в позиции 83 A-субъединицы ДНК-гиразы и серина (Ser) на лейцин (Leu) в позиции 85 C-субъединицы ДНК-топоизомеразы IV [11]. Более того, в 2012 г. впервые были обнаружены клинические штаммы V. cholerae Эль Тор с измененной устойчивостью к полимиксину B, используемой в качестве ключевого маркера для дифференциации вибрионов этого биовара от холерных вибрионов классического биовара — возбудителя шести предыдущих пандемий холеры [10]. Штаммы V. cholerae классического биовара были чувствительны к полимиксину B (50 ед.), тогда как все штаммы V. cholerae Эль Тор оказались к нему резистентны [11]. Ключевая роль в формировании резистентности к этому антибиотику принадлежит белкам, кодируемым опероном almEFG, экспрессия генов которого на уровне транскрипции позитивно контролируется геном carR [12]. Недавно стало известно, что точечная мутация в carR — замена гуанина на аденин в позиции 265 (G265A) — приводит к появлению у вибрионов Эль Тор чувствительности к полимиксину B [13].

В связи с очевидной значимостью для медицины устойчивости к различным лекарственным препаратам возбудителя холеры решением этой проблемы занимались многие зарубежные и отечественные исследователи [14—18]. Однако ряд вопросов о частоте распространенности на территории России штаммов с разным типом SXT и различным набором генов резистентности, циркуляции в эндемичных очагах холеры вибрионов с измененным спектром устойчивости к лекарственным препаратам и возможности их завоза в Россию нуждаются в дополнительных исследованиях.

Цель настоящей работы — изучение изменчивости множественной резистентности к антибиотикам, обусловленной вариабельностью мобильного элемента SXT и мутациями хромосомных генов, у различных штаммов возбудителя холеры из России и эндемичных очагов холеры.

Материал и методы

Штаммы бактерий. В работе использовали нуклеотидные последовательности полных геномов 110 штаммов V. cholerae Эль Тор, выделенных на территории России и Украины, а также в эндемичных очагах холеры Азии и Африки (табл. 1, 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_030_add.zip). Секвенированные нуклеотидные последовательности были получены нами ранее (27 штаммов) или взяты из баз данных NCBI GenBank и European Nucleotide Archive (83 штамма).

Определение чувствительности штаммов к антибиотикам. Для оценки чувствительности к антибиотикам было взято 27 штаммов из России и Украины, полученных из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб» (см. табл. 1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_030_add.zip). Бактерии культивировали в среде LB при 37^о C (pH 7,2). Отношение культур к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом с использованием полимиксина B (50 мкг), хлорамфеникола (30 мкг), тетрациклина (20 мкг), налидиксовой кислоты (30 мкг), стрептомицина (25 мкг), триметоприма (25 мкг), сульфаметоксазола (25 мкг) фирм «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия) и «Oxoid» (Великобритания)

Структурный анализ интегративных конъюгативных элементов. Наличие SXT и его тип определяли путем сравнительного анализа полногеномных последовательностей исследуемых штаммов относительно последовательностей штаммов 7452 (ICEVchInd5), 1811/98 (ICEVchBan5), MJ-1236 (ICEVchBan9), B33 (ICEVchMoz10), 4585 (ICEVchInd6) и 4672 (ICE ICEVchBan11), взятых в качестве референсных [7]. Для выравнивания последовательностей использовали программы Mauve и BLAST v.2.9.0 с алгоритмом blastn.

Идентификация мутаций в хромосомных генах gyrA, parC и carR. Сравнительный анализ последовательностей исследуемых генов проводили относительно таковой референсного штамма V. cholerae N16961. Для выравнивания последовательностей и выявления единичных точечных мутаций использовали программу Mauve. Визуализацию результатов производили при помощи программы Ugene.

Филогенетический анализ. Для анализа были взяты геномы 101 штамма (сборка в виде контигов), которые были картированы на референсную последовательность генома штамма N16961 для построения матрицы коровых SNP с помощью программы snippy v.4.6.0. Построение филогенетического дерева проводили методом максимальной экономии по матрице коровых SNP с использованием программного пакета BioNumerics v. 7.6.

Результаты и обсуждение

Идентификация и анализ структуры генома SXT элемента токсигенных штаммов V. cholerae, выделенных в России и Украине (1961 — 2014 гг.). Элемент SXT расположен на первой хромосоме между геномными островами VPI-2 (островом патогенности 2) и VSP-I (островом пандемичности I) [19, 20]. Для выявления SXT и анализа его структуры был проведен биоинформационный анализ секвенированного полного генома 31 штамма, изолированного на территории России и Украины в разные периоды текущей пандемии. Оказалось, что пять штаммов (M818, M888, M1062, M893 и M1011), занесенных в Россию из эндемичных очагов в 1970—1972 гг. во время первой волны пандемии, были лишены SXT и не имели генов резистентности к антибиотикам, входящих в его состав (см. табл. 1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_031_add.zip).

Однако начиная с 1993 г. в составе хромосомы всех изученных штаммов было обнаружено присутствие SXT элемента. Для определения типа этого мобильного элемента во взятых штаммах сравнили нуклеотидную последовательность их SXT с таковой разных типов SXT, присутствующих в штаммах 7452 (ICEVchInd5), 1811/98 (ICEVchBan5), MJ-1236 (ICEVchBan9), B33 (ICEVchMoz10), 4585 (ICEVchInd6) и 4672 (ICE ICEVchBan11), взятых в качестве референсных [7]. В результате показано, что по размеру и структуре SXT исследованные штаммы разделяются на две группы. Первую образовали 10 штаммов, выделенных во время эпидемических вспышек холеры в Дагестане, Сибири, на Дальнем Востоке (1993—1998 гг.), а также в Украине (1994—1995 и 2010 г.), которые были занесены на эти территории из разных стран Азии в период второй волны пандемии [21, 22]. В их хромосоме присутствовал SXT размером 106124 п.н. типа ICEVchBan9 [7]. Характерная его особенность — наличие в VRIII не только генов floR, strAB, sul2, но и генов tetAR, кодирующих резистентность к тетрациклину, а также dfrA1 (см. табл. 1, рис. 1, б, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_031_add.zip). Большинство же штаммов (16 из 26 или 61,5%) вошло во вторую группу. Они содержали другой тип SXT — ICEVchInd5, несущий в своем составе четыре гена устойчивости к антибиотикам (floR, strAB, sul2 и dfrA1) и отличающийся от ICEVchBan9 как меньшим размером (97847 п.н.), так и отсутствием генов tetAR (см. табл. 1, рис. 1, а, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_031_add.zip). При этом значительное их число (13 из 16 изолятов, или 82,2%) изолировали во время третьей волны пандемии (см. табл. 1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_031_add.zip). Таким образом, среди 26 исследуемых штаммов V. cholerae Эль Тор, имеющих SXT и вызывавших эпидемические осложнения по холере в России и Украине на протяжении 21 года (с 1993 по 2014 г.), было выявлено два разных его типа — ICEVchBan9 и ICEVchInd5 с различным профилем устойчивости штаммов к антибиотикам.

Определение устойчивости к антибиотикам штаммов V. cholerae Эль Тор из России и Украины.При оценке резистентности 27 штаммов холерного вибриона к пяти антибиотикам (хлорамфениколу, тетрациклину, стрептомицину, сульфаметоксазолу и триметоприму) выявили три различные группы. В первую вошли штаммы (пять изолятов), выделенные в 1970—1972 гг., которые, как и ожидалось, были чувствительны к ним вследствие отсутствия у них SXT. Вторая была представлена 10 штаммами, изолированными в более поздний период (1993—1998 и 2010 г.), в хромосоме которых выявлен SXT типа ICEVchBan9. Эти штаммы были устойчивы к хлорамфениколу (Cm^R), тетрациклину (Tc^R), стрептомицину (Sm^R) и триметоприм/сульфаметоксазолу (Su/Tp^R). Штаммы из третьей группы, состоящей из 12 изолятов (2001—2014 гг.) и несущих ICEVchInd5, в отличие от второй, были резистентны лишь к четырем антибиотикам — хлорамфениколу (Cm^R), стрептомицину (Sm^R) и триметоприм/сульфаметоксазолу (Su/Tp^R) (см. табл. 1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_031_add.zip). Таким образом, изученные штаммы холерного вибриона, изолированные с 1993 по 2014 г., имели разный профиль множественной резистентности к антибиотикам.

Распространенность различных типов SXT элемента среди клинических штаммов холерного вибриона Эль Тор из стран, эндемичных по холере. Поскольку эпидемические проявления холеры продолжаются во многих эндемичных странах Азии и Африки с сохранением риска завоза инфекции на территорию России, представляло интерес изучение распространенности SXT элемента среди 79 клинических штаммов V. cholerae Эль Тор, выделенных в этих регионах в последние два десятилетия. В результате установлено, что независимо от места выделения все проверенные штаммы, выделенные от больных в начальный период пандемии (1961—1986 гг.), были лишены SXT (см. табл. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_031_add.zip). Этот мобильный элемент появился в хромосомах штаммов, изолированных лишь во время второй и третьей волн пандемии, что полностью согласуется с данными других исследователей.

Далее, для выяснения типа SXT и вариабельности состава его генов резистентности проведен сравнительный биоинформационный анализ нуклеотидной последовательности SXT 75 изолятов, выделенных во время второй (MJ-1236, Бангладеш, 1994 г.) и третьей (74 штамма) волн. Было установлено, что эти штаммы, в отличие от изолятов из России и Украины, несли пять разных типов SXT — ICEVchBan9, ICEVchInd5, ICEVchBan5, SXT^TET, ICEVchInd5ΔVRIII, различающихся между собой набором генов резистентности к антибиотикам и/или размером. Штамм MJ-1236 (1994 г.) содержал ICEVchBan9 размером 106124 п.н. с генами floR, tetAR, strAB, sul2 и dfrA1, что и штаммы из России и Украины, изолированные в тот же период пандемии (1993 — 1998 гг.) (см. табл. 2, рис. 1, б, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_031_add.zip). Наиболее распространенным оказался ICEVchInd5 (97847 п.н.), обнаруженный у 28 (37,3% от числа изученных) штаммов из Индии, Бангладеш, Гаити и Танзании, который также имело большинство проверенных штаммов, изолированных в России и Украине. Состав генов резистентности был также одинаков — floR, strAB, sul2 и dfrA (см. табл. 2, рис. 1, а, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_032_add.zip). Отсутствие различий между типами SXT у сравниваемых изолятов из эндемичных и неэндемичных по холере регионов может служить указанием на занос возбудителя холеры на территорию России и Украины в основном из стран Юго-Восточной Азии, что подтверждено результатами эпидемиологических расследований [21, 22].

Что касается трех других типов SXT элемента (ICEVchBan5, SXT^TET, ICEVchInd5ΔVRIII), то они были найдены только среди штаммов из Азии и Африки. При этом ICEVchBan5, отличающийся от ICEVchInd5 большим размером (102131 п.н. по сравнению с 97847 п.н.), обнаружен в хромосомах лишь трех штаммов из Бангладеш, выделенных в 2018 г. (см. табл. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_032_add.zip). Особый интерес, на наш взгляд, представляет SXT^TET [14, 23]. О появлении в ряде стран Азии единичных штаммов, утративших устойчивость к хлорамфениколу, но резистентных к тетрациклину, стало известно с 1998—2000 гг. [24]. Однако с 2007 г. в Индии такие изоляты составляли >76% от числа выявленных [23]. Резкое увеличение штаммов с SXT^TET наблюдали и в ряде стран Африки, что было связано с интенсивным использованием тетрациклина (доксициклина) для лечения и профилактики холеры [25]. Среди изученных нами изолятов SXT^TET присутствовал в хромосоме 26 штаммов, выделенных от больных в Индии (2007—2010 гг.) и Бангладеш (2009—2017 гг.) (см. табл. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_032_add.zip). В составе SXT^TET размером 92592 п.н. были гены tetAR, strAB, sul2 и dfrA1 (см. табл. 2, рис. 1, в, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_032_add.zip). Однако, в отличие от других широко распространенных типов SXT (ICEVchInd5, ICEVchBan5, ICEVchBan9), в его геноме отсутствовал ген floR [7, 24]. Следует также отметить тот факт, что появление изолятов с SXT^TET в эндемичных по холере регионах сопровождалось вытеснением ими штаммов с геном floR [23, 25].

Вариабельность генома SXT проявилась также в возникновении делеции в его VRIII, затронувшей гены резистентности. Среди изученных обнаружили 20 штаммов с SXT элементом, несущим делецию размером около 10 т.п.н. в VRIII. Эта делеция в SXT в штаммах, выявленных в 2009—2018 гг., привела к утрате 4 генов, кодирующих резистентность к хлорамфениколу (floR), стрептомицину (strA и strB) и сульфаниламиду (sul2) в случае ICEVchInd5. Ген dfrA1, кодирующий резистентность к триметоприму, сохранялся (см. табл. 2, рис 1, г, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_032_add.zip). Такие штаммы с измененным геномом SXT циркулировали на территории Кении, Танзании, Уганды, а также Бангладеш, Индии, Йемена. На основании первых обнаружений таких штаммов в Индии считают, что появление в Африке изолятов с SXT, утратившим многие гены резистентности, связано с их заносом на этот континент из эндемичных очагов холеры в Азии [26, 27].

Таким образом, приведенные результаты говорят о том, что геномное разнообразие SXT элементов клинических штаммов возбудителя холеры из эндемичных по холере территорий в Азии и Африке более значимо по сравнению с таковым в России и Украине. Среди изученных штаммов выявлено 5 типов SXT — ICEVchInd5, ICEVchBan5, ICEVchBan9, SXT^TET и ICEVchInd5ΔVRIII. Появились штаммы с ранее неизвестной структурой SXT элемента, у которого ген floR был заменен на гены, кодирующие устойчивость к тетрациклину. Более того, в этот же период были выявлены штаммы, утратившие устойчивость к трем антибиотикам (стрептомицину, сульфаметоксазолу, хлорамфениколу) за счет возникновения делеции в VRIII SXT.

Спонтанные мутации в хромосомных генах резистентности к антибиотикам. В начале 2000 г. стало впервые известно о возникновении спонтанных мутаций в генах gyrA и parC бактериальной хромосомы, кодирующих ДНК-гиразу и топоизомеразу IV соответственно и ответственных за устойчивость холерных вибрионов к налидиксовой кислоте [28]. Анализ нуклеотидных последовательностей генов gyrA и parC у 31 штамма из России и Украины показал отсутствие мутаций у 15, изолированных в 1970—1998 гг. в период первой и второй волн пандемии. При этом в Nal^S группу входили штаммы, как не имеющие SXT, так и с этим мобильным элементом (см. табл. 1, рис. 2, а, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_032_add.zip).Вместе с тем у всех штаммов (16 изолятов), выявленных с 1999 по 2014 г. во время третьей волны пандемии, было установлено наличие указанных точечных мутаций, что обусловило их устойчивость к этому антибиотику (см. табл. 1, рис. 2, а, в, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_032_add.zip). Такая же картина наблюдалась и в случае штаммов, выделенных в эндемичных очагах холеры Азии и Африки. Из 79 проверенных изолятов 7 из первой и второй волн пандемии (1961—1994 и 2015 гг.) были лишены этих мутаций, тогда как 72 штамма из третьей волны пандемии имели мутантные гены gyrA и parC (см. табл. 2, рис. 2, а). Штаммы с мутациями в генах gyrA и parC, выделенные в России и Украине, составляли 19,3% от всех выявленных штаммов Nal^R, тогда как таких штаммов из эндемичных по холере очагов было 80,7%. При этом значительная (69,9%) их часть циркулировала среди больных в странах Азии (см. рис. 2, б, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_033_add.zip).

Другим не менее важным был вопрос о мутациях в генах, обеспечивающих резистентность V. cholerae Эль Тор к полимиксину B, поскольку устойчивость к нему является одним из ключевых фенотипических свойств, используемых для дифференциации холерных вибрионов этого биовара от таковых классического биовара, являющихся Pol^S [9]. Различная чувствительность вибрионов двух биоваров к полимиксину обусловлена разной активностью генов оперона almEFG, продукты которых необходимы для модификации липидного слоя на внешней мембране у вибрионов, приводящей их к резистентности к этому антибиотику. Если у Pol^R вибрионов Эль Тор все гены этого оперона активны, то у классических вибрионов ген almE (VC1579) несет мутацию со сдвигом рамки считывания, результатом которой стала утрата функции этого белка, необходимого для модификации липида A путем присоединения к нему глицина, и, как следствие, чувствительность к полимиксину B [28]. Причина возникновения Pol^S штаммов вибрионов Эль Тор иная — несинонимическая однонуклеотидная замена в гене carR (G265A), являющемся позитивным регулятором оперона almEFG. Принимая во внимание эти сведения, мы определили распространенность этой мутации среди всех изученных штаммов. Оказалось, что из 31 штамма из России и Украины лишь 2 (М1509 и 3265-80) имели мутантный ген carR и были чувствительны к полимиксину (см. рис. 2, а, в, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_033_add.zip). Следует отметить, что оба штамма Pol^S были выделены в 2012 и 2014 гг. в период третьей волны пандемии. Результаты исследования 79 штаммов из эндемичных регионов показали присутствие мутации в гене carR у 32 штаммов, циркулировавших в 2009—2017 гг. в Индии, Гаити, Бангладеш, Танзании, Кении, Уганде, Йемене. При оценке распространенности штаммов с измененным дифференцирующим биовар признаком установлено, что Pol^S изоляты из России составляли лишь 5,9% от выявленных Pol^S штаммов, тогда как 94,1% таких штаммов были из Азии (67,6%) и Африки (26,5%) (см. рис. 2, б, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_033_add.zip). Широкое распространение в последние годы на эндемичных по холере территориях Pol^S штаммов и их завоз на территорию России указывают на необходимость создания новых средств генодиагностики для выявления холерных вибрионов Эль Тор с измененным диагностическим свойством.

SNP-анализ нуклеотидных последовательностей полных геномов изученных штаммов V. cholerae Эль Тор. Глобальное распространение клинических штаммов возбудителя холеры в эндемичных по холере регионах с разными типами SXT элемента ставит вопрос об их связи между собой и происхождении таких изолятов в России. Изучение их филогении было проведено на основе SNP-анализа 101 штамма, представленного 30 изолятами из России и Украины и штаммами, выделенными в Азии (60 изолятов), Африке (9 изолятов) и о. Гаити (2 изолята) во время трех волн пандемии. При сравнении полных геномов изучаемых штаммов с референсной последовательностью штамма N16961 выявили 3402 одиночные нуклеотидные замены, или SNPs, в коровых генах, локализованных на обеих хромосомах. На основе анализа единичных полиморфных нуклеотидов построено филогенетическое дерево, которое четко разделилось на три кластера (рис. 3, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_033_add.zip). Штаммы из первой волны, лишенные SXT элемента и не имеющие дополнительных мутаций в хромосомных генах резистентности к антибиотикам (9 изолятов), независимо от места и года выделения (1961—1986 гг.) входили в состав кластера I, отличаясь от референсного лишь на 64—134 SNPs. Кластер II сформирован 14 штаммами Nal^SPol^R, имеющими SXT и выделенными в период второй волны, которые отличались от референсного 129—226 SNPs. В пределах этого кластера штаммы образовали две группы «а» и «б», различающиеся типом SXT. В хромосоме всех штаммов из подгруппы «а» присутствовал ICEVchBan9, тогда как у штаммов из подгруппы «б» — ICEVchInd5 (см. рис. 3, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_033_add.zip). В самый большой кластер III вошли штаммы из третьей волны (78 изолятов), имеющие высокий уровень гетерогенности — четыре типа SXT и мутации в хромосомных генах резистентности к налидиксовой кислоте и полимиксину (см. рис. 3, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_02_033_add.zip).Различия в SNPs между ними и референсным штаммом составляли 161—341 SNPs. Следствием высокого генетического разнообразия стало формирование ими двух основных групп «в» и «г», а в пределах последней группы — еще нескольких ветвей. Подгруппу «в» сформировали 18 штаммов Pol^R, выделенных в эндемичных по холере регионах, отличающихся от N16961 по 164—341 SNPs и имеющих SXT^TET, а также несущих мутации в хромосомных генах gyrA и parC, обусловившие их резистентность к налидиксовой кислоте. В подгруппу «г» включено 60 изолятов, циркулирующих как в России и Украине, так в эндемичных очагах холеры и различающихся от N16961 по 156—188 SNPs. В ее состав вошли штаммы Nal^R с тремя типами SXT (ICEVchInd5, ICEVchBan5 и ICEVchInd5ΔVRIII), а также с обнаруженной в ряде случаев мутацией в хромосомном гене carR, которая привела к потере устойчивости к полимиксину B. Очевидное генетическое разнообразие этих штаммов позволило выделить среди них отдельные ветви, из которых большой интерес представляют 1 и 2. Первую образовали изоляты Pol^S с ICEVchInd5 из Индии, Бангладеш и России. Наиболее тесная филогенетическая связь таких штаммов из России и Индии может служить указанием на их завоз на территорию нашей страны из этого региона. Ветвь 2 сформировали также штаммы Nal^RPol^S. Однако, в отличие от ветви 1, эти штаммы, выделенные вначале в Индии (2011 г.), а затем Африке (2015—2017 гг.), имели другой тип SXT — ICEVchInd5ΔVRIII (см. рис. 3).

Таким образом, на основе полногеномного SNP-анализа 101 штамма V.cholerae Эль Тор показано, что они разделяются на три обособленные филогенетические группы, различающиеся между собой по типу SXT элемента и хромосомным мутациям генов резистентности к антибиотикам gyrA, parC и carR. Каждая филогенетическая группа также соответствовала трем волнам текущей пандемии холеры.

Седьмая пандемия холеры охватила многие страны Азии и Африки, с территорий которых происходил занос холеры в различные регионы России и Украины. Мы использовали секвенированные геномы 31 штамма V. cholerae Эль Тор, выделенного на различных территориях России и Украины (1970—2014 гг.), и 79 штаммов из девяти азиатских и африканских стран (1961—2018 гг.) для выяснения изменчивости множественной резистентности к антибиотикам, обусловленной SXT элементом и спонтанными хромосомными мутациями. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей полных геномов клинических штаммов V. cholerae Эль Тор подтвердил появление SXT элемента в хромосоме изолятов, выделенных в период второй волны текущей пандемии холеры на территории России и эндемичных по холере регионов, а также его дальнейшее широкое распространение среди штаммов из третьей волны. У изученных штаммов выявлены пять следующих типов SXT: ICEVchInd5, ICEVchBan9, ICEVchBan5, SXT^TET и ICEVchInd5ΔVRIII, среди которых первые два, различающиеся набором генов резистентности к антибиотикам, имели штаммы из России и Украины. В то же время анализ нуклеотидной последовательности SXT позволил выявить его большое геномное разнообразие в штаммах из эндемичных очагов холеры. Наряду с ICEVchInd5 и ICEVchBan9 в их хромосоме обнаружено присутствие еще трех типов SXT, отсутствующих в штаммах из России и Украины, — ICEVchBan5, SXT^TET и ICEVchInd5ΔVRIII. Это означает, что в странах Азии и Африки циркулируют штаммы, имеющие более разнообразный набор генов устойчивости к лекарственным препаратам, чем в России. Заслуживает внимания неожиданное появление в Индии и Китае штаммов с SXT^TET, в вариабельной области III которого произошла замена гена floR, традиционно присутствующего в геноме других типов SXT, на гены tetAR. Кроме того, стоит отметить выделение в последнее десятилетие в эндемичных очагах штаммов, несущих в VRIII SXT делецию около 10 т.п.н., затронувшую четыре гена — floR, strA, strB и sul2. Таким образом, оценивая в целом частоту распространенности SXT элемента среди изученных изолятов, следует отметить его присутствие в хромосомах всех генетически измененных вариантов возбудителя холеры, возникших после первой волны пандемии.

Другой путь изменения резистентности к антибиотикам — возникновение спонтанных хромосомных мутаций в генах gyrA и parC, а также carR, определяющих устойчивость к налидиксовой кислоте и полимиксину B соответственно. Следует особо отметить тот факт, что штаммы Nal^R с мутациями в генах gyrA и parC появились почти одновременно с приобретением возбудителем холеры SXT элемента в период второй волны. Однако мутация в гене carR, изменившая резистентности к полимиксину B, появляется у штаммов лишь третьей волны в последнее десятилетие. Оценивая частоту распространенности мутации гена carR среди изученных штаммов, следует отметить пока редкое выявление изолятов Pol^S на территории России (2 штамма, занесенных из Индии в 2012 и 2014 гг.). Тем не менее реальная возможность дальнейшего заноса в Россию холерных вибрионов Эль Тор с измененным ключевым маркером биовара указывает на необходимость создания новых средств генодиагностики.

Для оценки филогенетических связей между штаммами с разным типом SXT проведен SNP-анализ секвенированных геномов штаммов V. cholerae Эль Тор (31 штамм), выделенных в России и Украине (1970—2014 гг.), и 79 штаммов, изолированных в девяти азиатских и африканских странах (1961—2018 гг.). Показанная тесная филогенетическая связь между штаммами с одинаковым типом SXT элемента, изолированными в России и Азии, может служить указанием на завоз возбудителя холеры в нашу страну из азиатских эндемичных очагов холеры. Следует особо отметить тот факт, что присутствие в различных регионах Азии и Африки штаммов с новым типом SXT, не встречающимся в России, позволяет прогнозировать их появление и на территории нашей страны в результате интенсивной мобильности населения.

Заключение

Изучено распространение на территории России и в Украине, а также в эндемичных по холере регионах Азии и Африки разных типов SXT элемента и спонтанных мутаций в хромосомных генах резистентности к антибиотикам. Представлены данные о более высоком уровне изменчивости состава и структуры генов резистентности в SXT и на хромосоме в эндемичных по холере регионах по сравнению с Россией и Украиной. Установлено распространение штаммов с измененным диагностически значимым признаком возбудителя холеры Эль Тор за счет точечной мутации в гене carR, регулирующим формирование резистентности к полимиксину B. Широкое распространение на эндемичных территориях штаммов с разным составом генов резистентности к антибиотикам позволяет прогнозировать появление в результате заноса на территории России новых штаммов возбудителя холеры с ранее неизвестной устойчивостью к антибиотикам. Такая ситуация указывает на необходимость постоянного мониторинга устойчивости штаммов к антибиотикам для выбора наиболее эффективных лекарственных средств при лечении холеры.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.