Введение
В настоящее время установлено, что генетическая структура глобальной популяции возбудителя туберкулеза (ТБ) — Mycobacterium tuberculosis неоднородна и включает ряд филогенетических линий, сублиний, генетических семейств и кластеров, которые различаются по географическому распространению, способности к передаче и лекарственной устойчивости штаммов [1]. Для российской популяции M. tuberculosis характерно доминирование генетического семейства Beijing, в частности его основных кластеров — Central Asian/Russian (CC1, иначе именуемый 94-32) и В0/W148 (CC2) [2—10]. Однако мониторинг локальных популяций, слежение за циркуляцией штаммов высококонтагиозных и высоковирулентных генотипов M. tuberculosis, проводится лишь на отдельных территориях России [2, 11—14]. Начиная с 2015 г. для выявления возбудителя ТБ и определения лекарственной устойчивости M. tuberculosis используются методы молекулярной диагностики1.
В Мурманской области (численность населения 757,6 тыс. человек, площадь 144,9 тыс. км2) первые молекулярно-генетические исследования циркулирующих штаммов M. tuberculosis для характеристики структуры популяции возбудителя, в частности для оценки роли штаммов различных генотипов в распространении лекарственно-устойчивого туберкулеза легких, были проведены в годы подъема заболеваемости ТБ (2003—2006 гг.) [15, 16]. Далее, в 2007—2017 гг., заболеваемость ТБ в Мурманской области значительно снизилась: с 58,2 до 23,9 на 100 тыс. населения [17]. Вместе с тем удельный вес первичной множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) возбудителя туберкулеза оставался на высоком уровне — 25,0% в 2017 г.
Цель исследования — генотипическая характеристика популяции M. tuberculosis в Мурманской области и анализ изменений ее структуры за 15-летний период.
Материал и методы
Согласно официальным данным, в Мурманской области в 2017 г. впервые выявлены 157 больных ТБ легких. Нами изучено 67 (91,8%) из 73 штаммов M. tuberculosis, выделенных от 93 бактерионосителей. Культивирование на питательной среде Левенштейна—Йенсена и определение лекарственной чувствительности (ЛЧ) изолятов M. tuberculosis к основным противотуберкулезным препаратам (ПТП) проводили стандартным непрямым методом абсолютных концентраций и BACTEC MGIT 960. Штаммы определяли как монорезистентные — устойчивые к одному из ПТП, полирезистентные — к двум ПТП и более, но не одновременно к рифампицину и изониазиду, штаммы с МЛУ — устойчивые как минимум к рифампицину и изониазиду2.
Определение мутаций в генах rpoB, katG и inhA, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к рифампицину и изониазиду, проводили с использованием тест-системы Амплитуб-МЛУ-РВ (ООО «Синтол», Россия).
ДНК выделяли из чистых культур M. tuberculosis согласно протоколу [18]. Принадлежность штаммов M. tuberculosis к генетическому семейству (генотипу) Beijing, включая кластеры B0/W148, Central-Asian/Russian и Central Asia Outbreak (CAO), проводили с помощью ряда мультиплексных ПЦР, основанных на выявлении вставки IS6110 и однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs, single nucleotide polymorphisms) соответственно [7, 19—21]. Более точное генотипирование штаммов Beijing методом MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repetitive units — variable number of tandem repeats) использовали для оценки полиморфизма 24 локусов хромосомы [22]. Число повторов в каждом локусе MIRU-VNTR представляло числовой профиль штамма, который сравнивали с данными международной базы данных MIRU-VNTR plus (https://www.miru-vntrplus.org/), определяя MIRU-VNTR-тип согласно номенклатуре (MLVA Mtbc 15-9). Для анализа родства между штаммами на основе полиморфизма 24 локусов MIRU-VNTR использовали алгоритм построения минимального связывающего дерева (MST, minimum spanning tree). Для оценки аллельного полиморфизма локусов и дискриминирующей способности MIRU-VNTR-типирования вычисляли индекс Хантера—Гастона (HGI, Hunter Gaston Index) [23]. Уровень кластеризации (Clustering Rate, CR) оценивали по формуле: CR=(nc–c)/n, где nc — число кластеризованных штаммов, с — количество кластеров, n — общее число штаммов [22].
Для генотипирования штаммов M. tuberculosis других генотипов (non-Beijing) использовали метод сполиготипирования (spoligotyping, spacer oligonucleotide typing) [24]. Профили сполиготипирования штаммов сопоставляли с имеющимися в международной базе SITVIT2 (https://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT2/), определяя сполиготип SIT (Spoligotype International Type).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием ресурса MEDCALC (https://www.medcalc.org/calc/odds_ratio.php), вычисляя значения χ2, точного критерия Фишера и отношения шансов (odds ratio, OR). Различия между группами считали статистически значимыми при доверительном интервале 95% и p<0,05.
Результаты и обсуждение
Генотипирование 67 штаммов M. tuberculosis позволило выявить наиболее распространенное генетическое семейство Beijing (52,2%; 35). Присутствие нуклеотидной замены G>A в гене sigE свидетельствовало о принадлежности 34,3% (23/67) штаммов Beijing к кластеру Central-Asian/Russian [7], включавшему штамм субтипа Central Asia Outbreak (CAO) (устойчивый к изониазиду и этионамиду) [21].
Кластер B0/W148 (ранее обозначаемый B0) в Мурманской области был выявлен еще в 2003—2004 гг. [15] путем анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции хромосомной ДНК, содержащих последовательность IS6110 (IS6110-RFLP) [18]. В нашем исследовании доля эпидемиологически и клинически значимого в России кластера Beijing B0/W148 [2, 3], характерной чертой которого является вставка IS6110 в локусах Rv2664 и Rv2665 [20], составила 10,4% (7/67), что значительно меньше, чем в Республике Карелия, Калининградской области, Республике Коми (около 19%) [11, 13, 25].
MIRU-VNTR-типирование 35 штаммов Beijing выявило 14 вариантов профилей, из которых 11 принадлежали к известным типам согласно номенклатуре MLVA MtbC 15-9 (HGI=0,79) (табл. 1, рисунок). Анализ аллельного полиморфизма штаммов Beijing показал наиболее высокую вариабельность локусов MIRU26 (HGI=0,50) и QUB26 (HGI=0,44); 14 из 24 локусов были однородны — все штаммы имели один и тот же аллельный вариант (см. табл. 1). Наиболее распространенные в российской популяции M. tuberculosis Beijing кластеры 94-32 (42,9%; 15 из 35) и 100-32 (17,1%; 6) включали штаммы Central-Asian/Russian и B0/W148 соответственно [4—6, 9].
Таблица 1. MIRU-VNTR профили штаммов M. tuberculosis Beijing
| MLVA Mtbc 15-9 | MIRU-VNTR числовой профиль* | Кластер Beijing | МЛУ | Всего |
| 94-32 | 223325153533424682454433 | Central-Asian/Russian | 5 | 15 |
| 96-32 | 223325153533424682464433 | Central-Asian/Russian | 1 | 1 |
| 99-332 | 223325153533424672452433 | Central-Asian/Russian | 2 | |
| 770-32 | 223325153534424582454433 | Central-Asian/Russian | 1 | |
| 1076-32 | 223325163533424682454433 | Central-Asian/Russian | 1 | |
| 4402-32 | 223325153533424782454433 | Central-Asian/Russian | 1 | 1 |
| ?-32 | 223325153334424582454433 | Central-Asian/Russian | 1 | |
| ?-32 | 223325153333224682454434 | Central-Asian/Russian | 1 | 1 |
| 100-32 | 223325173533424672454433 | B0/W148 | 5 | 6 |
| 1075-32 | 223325163533424672454433 | B0/W148 | 1 | 1 |
| 1066-32 | 223325173533424662454433 | 1 | 1 | |
| 9341-32 | 223325153533424882454433 | 1 | ||
| 9391-32 | 224325173533424682454433 | 2 | ||
| ?-32 | 224325173333424682454433 | 1 |
Примечание. * — MIRU02, Mtub04, ETRC, MIRU04, MIRU40, MIRU10, MIRU16, Mtub21, MIRU20, Qub11b, ETRA, Mtub29, Mtub30, ETRB, MIRU23, MIRU24, MIRU26, MIRU27, Mtub34, MIRU31, Mtub39, QUB26, QUB4156c, MIRU39.
Минимальное охватывающее древо (Minimum spanning tree) профилей MIRU-VNTR (24 локусов) штаммов M. tuberculosis Beijing.
Размеры узлов пропорциональны числу штаммов (n) в составе MIRU-VNTR-кластера (согласно MLVA Mtbc 15-9). Линии между узлами показывают изменения, касающиеся одного локуса — сплошные жирные, двух — сплошные тонкие, трех — прерывистая.
Сравнение MIRU-VNTR-профилей штаммов B0/W148 и Central-Asian/Russian выявило более выраженную неоднородность последних (HGI=0,54 против HGI=0,29), что позволяет предполагать разнообразие источников происхождения и различную давность заноса вариантов возбудителя на исследуемую территорию (см. табл. 1, рисунок).
При этом высокие уровни кластеризации [22, 26] штаммов Beijing Central-Asian/Russian (CR=0,68) и B0/W148 (CR=0,71) свидетельствуют об их текущем распространении на момент исследования.
Сполиготипирование 32 штаммов non-Beijing выявило 17 типов (SIT), представляющих генетические семейства Ural, T, LAM (Latin American-Mediterranean), Haarlem и X (табл. 2). Для штаммов SIT4, SIT237, SIT1177 и штаммов с новым сполигопрофилем (NEW) принадлежность к семейству не определена (обозначены Unknown — неизвестный). Шесть сполигокластеров (сполиготипы, представленные двумя штаммами и более) включали 65,6% (21/32) штаммов non-Beijing.
В группе non-Beijing, как видно из табл. 2, преобладали штаммы семейства Ural (19,4%; 13/67), представленного сполиготипами SIT35, SIT262 и SIT1447. Столь высокая доля штаммов Ural в локальных популяциях возбудителя туберкулеза нехарактерна для северо-западных регионов России: в Республике Карелия — 12,8%, в Калининградской области — 5,5%, в Псковской области — 5,6%, в Республике Коми — 6,9% [11, 13, 25, 27].
Таблица 2. Сполиготипы штаммов M. tuberculosis non-Beijing
| Сполиготип, SIT | Профиль сполиготипирования | Генотип | Всего |
| 35 | | Ural | 6 |
| 262 | | Ural | 6 |
| 1447 | | Ural | 1 |
| 40 | | T | 1 |
| 52 | | T | 1 |
| 122 | | T | 2 |
| 1255 | | T | 1 |
| 1105 | | T | 1 |
| 42 | | LAM | 3 |
| 60 | | LAM | 1 |
| 254 | | LAM | 1 |
| 2 | | Haarlem | 2 |
| 708 | | X | 1 |
| 4 | | Unknown | 2 |
| 237 | | Unknown | 1 |
| 1177 | | Unknown | 1 |
| NEW | | Unknown | 1 |
Остальные генетические семейства были более гетерогенны по сполигопрофилям. Генотип LAM, второй по распространенности в России (до 29,4%) после Beijing [2, 8, 12, 27], в Мурманской области был обнаружен лишь у 7,5% штаммов.
Метод сполиготипирования не применяли для оценки полиморфизма M. tuberculosis семейства Beijing, поскольку подавляющее большинство штаммов принадлежит к сполиготипу SIT1 [2, 3].
В сравнении с 2003—2006 гг. полученные нами данные генотипирования штаммов M. tuberculosis подтверждают доминирование и свидетельствуют о намечающемся росте с 44,0% (193/439) [15] — 47,2% (17/36) [16] до 52,2% (35/67) (χ2=3,38, p=0,185) доли генотипа Beijing в популяции возбудителя туберкулеза Мурманской области. Подобные наблюдения имеются и в Калининградской области, где доля генотипа Beijing за 10 лет (2006—2015 гг.) увеличилась с 40,3 до 63,0% [13]. Интересно, что на прилегающей к Мурманской области территории Республики Карелия с 2006 по 2014 г. доля штаммов данного генотипа оставалась практически неизменной (около 55%) [11].
Сравнительная оценка сполигокластеров основных генетических семейств Ural, T, LAM с ранее опубликованными данными [15] выявила изменения в структуре современной популяции M. tuberculosis. Так, в общей выборке штаммов увеличилась суммарная доля сполиготипов SIT35 и SIT262 (оба — Ural) — с 11,2 до 17,9%; уменьшилась доля основного сполиготипа SIT52 семейства T — с 5,9 до 1,5%; штаммы SIT53 (семейство T), ранее составлявшие 3,4%, не были обнаружены в нашем исследовании. Выявляемость наиболее распространенного не только в России, но и в мире сполиготипа SIT42 семейства LAM (https://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT2) существенно не изменилась (p>0,05): 3,6% (2003—2006 гг.) и 4,5% (2017 г.) соответственно.
Изучение спектра фенотипической лекарственной устойчивости M. tuberculosis показало, что у 41 (61,2%) из 67 штаммов чувствительность к ПТП была сохранена, у 18 (26,9%) штаммов выявлена МЛУ. Устойчивость всех МЛУ-штаммов к рифампицину и изониазиду была обусловлена мутациями rpoB Ser531Leu (TCG→TTG) и katG Ser315Thr (AGC→ACC), которые чаще всего встречаются у МЛУ-штаммов генотипа Beijing [2, 3, 5, 12, 25, 28]. Согласно ранее опубликованным данным, в 2003—2004 гг. доля этих мутаций у МЛУ-штаммов в Мурманской области составляла 97,4% — katG Ser315Thr (AGC→ACC) и 76,3% — rpoB Ser531Leu (TCG→TTG) [15]. У одного штамма устойчивость к изониазиду была связана с дополнительной мутацией в гене inhA -15 C→T.
Результаты сопоставления данных генотипирования и определения фенотипической лекарственной чувствительности штаммов M. tuberculosis приведены в табл. 3.
Таблица 3. Генотипы и лекарственная устойчивость штаммов M. tuberculosis
| Генотип | Чувствительные | Моно-/полирезистентные (n=8) | МЛУ (n=18) | Всего (n=67) |
| Beijing | 17 | 3 | 15 | 35 |
| Beijing B0/W148 | 0 | 1 | 6 | 7 |
| Central-Asian/Russian | 13 | 2 | 8 | 23 |
| Beijing, другой | 4 | 0 | 1 | 5 |
| Non-Beijing | 24 | 5 | 3 | 32 |
| Ural | 9 | 4 | 0 | 13 |
| T | 6 | 0 | 0 | 6 |
| LAM | 5 | 0 | 0 | 5 |
| Haarlem | 1 | 1 | 0 | 2 |
| X | 1 | 0 | 0 | 1 |
| Unknown | 2 | 0 | 3 | 5 |
На большой выборке штаммов, выделенных от впервые выявленных больных в годы подъема заболеваемости ТБ (2003—2006 гг.), была установлена ассоциация МЛУ с принадлежностью штаммов к генотипу Beijing — 47,7% (92/193) против non-Beijing — 7,3% (18/246) (P=0,006; OR=5,20 [1,61—16,84]) [15]. Данная ассоциация сохранялась в 2017 г.: 42,9% (15/35) против 9,4% (3/32) (P=0,004; OR=7,25 [1,85—28,37]).
Следует отметить, что доли МЛУ-штаммов кластеров B0/W148 и Central-Asian/Russian генотипа Beijing существенно различались и составляли 85,7% (6/7) и 34,8% (8/23) (p=0,019) соответственно (см. табл. 3).
В подавляющем большинстве случаев от больных ТБ легких с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя (МЛУ-ТБ) были выделены штаммы генотипа Beijing (83,3%; 15/18 в 2017 г. и 80,7% в 2003—2004 гг.), причем в нашем исследовании доля МЛУ-штаммов кластера B0/W148 значительно увеличилась — до 33,3% (6/18) против 9,6% (11/114) [15] соответственно (P=0,009; OR=4,68 [1,47—14,94]). Ранее в ряде регионов России была установлена ассоциация МЛУ-ТБ с заражением штаммами генотипа Beijing, особенно кластера B0/W148 [2, 3, 6, 8, 9, 11—13, 25].
МЛУ штаммы non-Beijing имели сполигопрофили (SIT4, SIT237) (см. табл. 2), редко встречающиеся в российской популяции возбудителя ТБ.
При этом сопоставление результатов сполиготипирования и эпидемиологических данных позволило ретроспективно обосновать групповое заражение штаммом SIT4 M. tuberculosis от общего неустановленного источника МЛУ-ТБ. Данный пример демонстрирует прикладное значение оценки генетического разнообразия популяции возбудителя в эпидемиологической диагностике МЛУ-ТБ.
Заключение
Результаты данного исследования позволили оценить генетическое разнообразие штаммов возбудителя, выделенных от впервые выявленных больных ТБ легких в Мурманской области в 2017 г. В популяции M. tuberculosis наиболее распространенными были генотипы Beijing (52,2%) и Ural (19,4%). Среди штаммов Beijing численно преобладал кластер Central-Asian/Russian, гетерогенный по MIRU-VNTR-профилям. Наибольшая доля МЛУ-штаммов выявлена в кластере Beijing B0/W148 (85,7%), представленном преимущественно MIRU-VNTR-профилем 100-32. У 26,9% МЛУ-штаммов устойчивость к рифампицину и изониазиду была обусловлена мутациями rpoB Ser531Leu (TCG→TTG) и katG Ser315Thr (AGC→ACC).
В популяции M. tuberculosis в период 2003—2017 гг. наблюдается устойчивое доминирование генотипа Beijing с тенденцией к росту с 44,0% до 52,2%. При этом доля МЛУ-штаммов кластера B0/W148 Beijing увеличилась в 3,5 раза, что свидетельствует об отборе и накоплении данного эпидемиологически и клинически неблагоприятного варианта возбудителя ТБ в Мурманской области.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
1Приказ Минздрава России №951 от 29.12.14.
2Приказ Минздрава России №951 от 29.12.2014.