Введение

Бактерии существуют в виде свободных планктонных форм или в составе биопленок, состоящих из клеток и внеклеточного полимерного матрикса микробного происхождения, прикрепленных к биотическим или абиотическим поверхностям (субстратам) [1, 2]. В качестве субстратов используются объекты окружающей среды, включая медицинский инструментарий — катетеры, биологические имплантаты, а также технические конструкции, системы промышленного или коммунального водоснабжения [3].

Полимерный матрикс защищает бактерии от антимикробных веществ и других неблагоприятных факторов среды обитания. Он является сложным комплексом, состоящим из жизненно важных макромолекул, таких как нуклеиновые кислоты, полисахариды, белки и липиды [2, 4, 5].

Значение биопленок для микромира трудно переоценить. Установлено, что до 80% инфекций человека, животных и растений опосредуются формированием биопленок, что позволяет рассматривать их как фактор вирулентности патогенных бактерий [5, 6]. Кроме того, среди примеров неблагоприятного влияния биопленок наиболее часто упоминаются снижение судоходных качеств морских судов, биообрастание трубопроводов, повреждения промышленного оборудования, индукция коррозии металлов, снижение качества и загрязнения пищевых продуктов и другие [4, 7, 8]. С учетом потенциальной бесконечности и разнообразия биотических и абиотических поверхностей, покрытых биопленками, негативные последствия и масштабы последствий их формирования и распространения в экосистемах трудно переоценить [9—11].

В связи с угрозой для здоровья людей и промышленных рисков технологический и медицинский интерес направлен на поиск методов ингибирования формирования и веществ, разрушающих биопленки [12—14].

Авторы, занимаясь изучением проблемы ингибирования образования биопленок, сделали попытку представить современные знания о молекулярных механизмах их формирования и адгезивно-коадгезивного взаимодействий бактерий.

Современное понимание механизмов бактериальной адгезии при формировании биопленок

Согласно существующему определению биопленки — это микробные сообщества, прикрепленные к биотическим или абиотическим поверхностям. Процесс формирования биопленок регулируется рядом физических, химических и биологических механизмов. Прикрепление микробных клеток к поверхности называется адгезией, а друг к другу — агрегацией (когезией). Механизмы, лежащие в основе этих форм межклеточного взаимодействия, определяют свойства биопленки [3, 7, 13].

B. Rosan был одним из первых, кто описал последовательность формирования биопленок как многостадийный процесс, состоящий из трех этапов: 1) адсорбция микроорганизмов на поверхности; 2) присоединение клеток к субстрату, образование полимерных мостиков; 3) колонизация и деление микроорганизмов на поверхности [1], которые впоследствии многократно дополнялись [2—4, 9, 14].

С позиций нынешних представлений о биопленках концептуальность этого описания не изменилась, однако добавились данные о молекулярных составляющих механизмов межклеточного адгезивно-коадгезивного взаимодействия.

В современных моделях этапность процесса биопленкообразования представлена в виде нескольких стадий: 1) кондиционирование субстрата, формирование начального матриксного слоя; 2) обратимая адгезия бактерий к поверхности, обусловленная неспецифическими взаимодействиями, при которых клетки легко удаляются путем осторожного перемешивания; 3) необратимая адгезия бактерий к поверхности с помощью пилей, фимбрий и адгезивных белков путем молекулярных специфических взаимодействий; 4) агрегация (ко-агрегация) клеток и их пролиферация; 5) созревание (стабилизация) биопленки; 6) отрыв и миграция клеток для последующей колонизации [8, 9, 11, 15].

Все стадии биопленкообразования опосредуются рядом факторов, в том числе физико-химическими свойствами поверхности (субстрата).

Кондиционирование поверхности (субстрата)

Внеклеточные образования (например, фимбрии, пили и жгутики), а также адгезия усиливают связь между бактериальными клетками и субстратом, являются важными этапами в создании биопленки. Тем не менее формирование биопленок в значительной степени зависит от специфических и неспецифических молекулярных и физических взаимодействий, механизм которых еще до конца не выяснен [11, 16—18]. Эти взаимодействия опосредуются физико-химическими свойствами субстрата, такими как гидрофобность (-фильность) [12, 14, 18, 19], шероховатость [16—18], поверхностный заряд [20, 21], наличие функциональных групп [22, 23].

От этих свойств зависит скорость формирования биопленки, поэтому на начальном этапе происходит кондиционирование (подготовка) поверхности за счет осаждения на субстрате макро- и микромолекул, а также ионов, находящихся в жидкости. Под действием силы тяжести они осаждаются на субстрате, придавая ему определенные свойства, инициирующие последующую адгезию бактериальных клеток [18, 20, 23].

Гидрофобность/гидрофильность субстратов. Смачиваемость является свойством, отражающим поведение жидкости на поверхности. В зависимости от величины угла контакта между каплей жидкости и поверхностью субстрата (Θ_С) разные материалы могут быть либо гидрофильными (Θ<90°), либо гидрофобными (Θ>90°). Известно, что гидрофобные эффекты играют существенную роль в клеточно-субстратных взаимодействиях в водных средах [12, 13, 24].

В недавнем исследовании F. Lamari и соавт. [10] было установлено, что поверхностная гидрофобность является определяющим фактором для адгезии микробных клеток. Экспериментально авторы показали, что увеличение гидрофобности биотических и абиотических поверхностей вызывает усиление адгезии клеток Vibrio spp., возрастание скорости формирования биопленки, при этом повышаются инвазивные свойства и цитотоксичность бактерий в отношении клеток Hep-2 [10]. Эти выводы подтвердили результаты аналогичных исследований, проведенных ранее, продемонстрировавших роль и значение гидрофобности в индукции биопленкообразования [24—27].

По мнению P. Di Ciccio и соавт. [14], гидрофобные взаимодействия являются наиболее сильными из всех нековалентных взаимодействий, и наблюдается отчетливая прямо пропорциональная линейная связь между количеством прикрепленных бактериальных клеток к поверхности и степенью ее гидрофобности [14, 15]. Следовательно, снижение гидрофобности и, соответственно, повышение гидрофильности (смачиваемости) субстрата является одним из способов ослабления бактериальной адгезии. Для этой цели поверхность обрабатывают гидрофильными полимерами (полиэтиленгликолем, полиэтиленоксидом, цвиттерионом, полисахаридами), которые образуют межфазный слой, предотвращающий прямой контакт между бактериями и поверхностью [14, 26, 28].

Однако у этого способа ингибирования адгезии есть недостаток, связанный со снижением со временем достаточной стабильности покрытия из-за разложения полимеров, что приводит к бактериальной колонизации и образованию биопленки [25, 29].

Кроме того, в последние годы было показано, что чрезмерное повышение гидрофобности поверхности (супергидрофобности) покрытий ведет к противоположному эффекту [22, 30—32]. Гипергидрофобные покрытия имеют большой угол контакта (Θ>150°) и, вследствие уменьшенной адсорбции белка и образовавшегося воздушного слоя, бактерии удаляются с поверхности [29, 31, 33, 34]. Один из таких типов покрытий был разработан путем предварительной обработки поверхности миристиновой (тетрадекановой) кислотой (C₁₃H₂₇COOH). После воздействия морской воды такой субстрат почти не содержал бактериальных клеток, а данное покрытие имело выраженные антикоррозийные и антибиопленочные свойства [35—37]. Другая биотехнология была разработана E. Ostrov и соавт. [38] на основе использования обработки поверхности парафином (фторированным воском).

Шероховатость поверхности. Наряду с гидрофобностью другим ключевым фактором, влияющим на адгезию бактерий и формирование биопленки, является шероховатость поверхности, увеличение которой ведет к повышению степени микробной колонизации [16—18, 39, 40].

Например, разработчики технологий микробных топливных элементов изучали условия формирования электрохимически активных биопленок Geobacter serreducecens (ЕА биопленок). Они пришли к выводу, что замена материала при конструировании катодов на более шероховатый (графит на нержавеющую сталь) значительно увеличивала плотность тока за счет большей плотности и лучших электрохимических характеристик образовавшейся биопленки [16, 41—43].

Сильная зависимость формирования биопленок бактериями Legionella pneumophila в системах подачи питьевой воды от шероховатости, а также гидродинамических характеристик жидкостного потока была показана в исследовании Y. Shen и соавт. [17]. При этом изменение ионной силы раствора с 3 до 300 мМ не влияло на биопленкообразование.

Функциональные группы. Современные интеграционные биоэлектрохимические технологии поиска альтернативных источников биотоплива основаны на преобразовании микробной металлоредукции электроактивных Gammaproteobacteria в электрохимическую энергию [22, 23, 44]. Оказалось, что создание альтернативного экологического биотоплива сильно зависит от плотности мощности системы, опосредуемой формированием биопленки и качеством бактериальной адгезии [21]. C. Li и S. Cheng [22] в течение нескольких лет проводили изучение различных подходов к изменению свойств поверхности катода. Наиболее перспективными оказались методы модификации функциональных групп, присутствие которых на субстрате значительно улучшало бактериальную адгезию посредством нескольких эффектов: химического связывания, электростатического взаимодействия, повышения гидрофобности и шероховатости поверхности [22—24].

В другом экспериментальном исследовании с помощью инфракрасной спектроскопии также было показано, что присутствие фосфатных функциональных групп в составе кондиционирующей пленки вызывало более выраженную адгезию Xylella fastidiosa, чем шероховатость или гидрофобные свойства поверхности [9].

Химико-физические свойства функциональных групп активно используются для ингибирования бактериальной адгезии и биопленкообразования. Например, с этой целью поверхности покрывают силоксаном — функциональной группой, имеющей связь Si-O-Si и присутствующей в кремнийорганических соединениях [36]. Аналогичные результаты были получены при использовании покрытия стальных конструкций наночастицами TiO₂, что улучшало противообрастающие и антикоррозионные свойства поверхностей [37].

Обратимая (первичная) адгезия

Несмотря на то, что стадия обратимой (первичной) адгезии бактерий опосредуется случайным контактом между планктонным микроорганизмом и кондиционированной поверхностью, понимание механизмов этого взаимодействия важно для разработки методов ингибирования и контроля всего процесса биопленкообразования. Сначала планктонные формы бактерий сорбируются из жидкости на кондиционированный субстрат с помощью внеклеточных образований (фимбрий, пилей или жгутиков), которые способны преодолеть силы отталкивания двойного электрического слоя, либо физических сил (Ван-дер-Ваальса или электростатических взаимодействий) [45, 46].

Наступление стадии обратимой адгезии происходит после приближения бактерии (с помощью потока жидкости, молекулярных механизмов хемотаксиса) к поверхности на критическое расстояние (обычно <1 нм) и зависит от результирующего действия сил притяжения или отталкивания. Силы отталкивания преодолеваются с помощью специфических молекулярных взаимодействий, опосредованных специализированными белками-адгезинами, расположенными на внеклеточных структурах бактерий (пили, фимбрии) [43, 47, 48].

Основной теорией, объясняющей механизмы обратимой адгезии (обратимого сцепления или адгезивного взаимодействия), является DLVO (по начальным буквам фамилий авторов-разработчиков: B. Derjaguin, L. Landau, E. Verwey и T. Overbeek), которая была ранее разработана для описания механизма адгезии коллоидных частиц к твердым поверхностям [26, 27]. Эта теория описывает взаимодействие как результат действия двух факторов: сил Ван-дер-Ваальса (притягивающих) и отталкивающих, являющихся результатом перекрытия двойных электрических слоев клетки и поверхности [23, 26, 27].

Однако практические результаты часто расходились с ожидаемыми, согласно DLVO, так как эта теория не учитывала влияние на взаимодействие свойств поверхности (шероховатость, гидрофобность и другие), которые, как показано выше, играют существенную роль в клеточно-субстратных взаимодействиях в водных растворах [23, 27, 41]. В итоге возник расширенный вариант теории DLVO (xDLVO), который учитывал влияние свойств на адгезию, в дополнение к электростатическим и ван-дер-ваальсовым силам [23, 26, 27, 43].

Современное применение возможностей зондовой (атомно-силовой) микроскопии (модуль Юнга) позволили количественно оценить адгезивное взаимодействие между бактериями и поверхностями с одновременным исследованием физических и микромеханических свойств клетки [30].

Этот метод, например, был использован A. Harimawan и соавт. для сравнения силы адгезии вегетативных клеток и спор Bacillus subtilis к поверхности металла [27]. Установлено, что «спящие» (дормантные) клетки проявляют гораздо более сильную адгезию с поверхностью по сравнению с вегетативными клетками. Этот же метод был использован для исследования коррозии сплавов металлов при конструировании зубных имплантатов [31].

Необратимая (вторичная) адгезия

Рассматривая процесс адсорбции бактерий как стадию образования биопленки, можно определить первичную адгезию как стыковочную фазу, а вторичную (необратимую) — как фазу фиксации на кондиционированной поверхности [42].

В реальности часть обратимо адсорбированных клеток закрепляется и фиксируется на поверхности, переходя в фазу необратимой (вторичной) адгезии. В отличие от первичной адгезии бактерий к абиотическим поверхностям, которая, как правило, опосредуется физико-химическими взаимодействиями, необратимая адгезия к биотическим субстратам достигается посредством специфических молекулярных (лектиновых, лигандных или адгезиновых) механизмов адсорбции [32].

Эти механизмы приводят к консолидации процесса адгезии, индуцируя продукцию экзополисахаридов и образование лиганд-рецепторного комплекса, что делает адгезию необратимой, а бактерии прочно фиксируются не только на поверхности, но и друг с другом, а также с различными видами поверхностно-связанных организмов, образуя агрегаты [37]. При этом присутствие одного вида бактерий на поверхности может способствовать адгезии другого микроорганизма [32, 37].

Агрегация и пролиферация бактерий, созревание биопленки

Начальные стадии формирования биопленки также связаны с ко-адгезией между клетками одного и того же вида (флоккуляцией) и (или) межвидовой ко-агрегацией, опосредованных изменениями мембранных свойств бактериальной клетки [15, 33].

Агрегация бактерий. В классической схеме развития биопленки планктонные клетки контактируют с поверхностью, прикрепляются и размножаются, образуя первые микроколонии, а затем трехмерные структуры. Однако в последние годы было обнаружено, что, при формировании биопленки и дальнейшей миграции клеток бактерии образуют плотные агрегированные скопления. В поддержку такой точки зрения приведены результаты ряда исследований, в которых были обнаружены патогенные бактерии в агрегированном состоянии, находящиеся как вне, так и внутри биопленки [33, 39, 42]. Возможно, что агрегация клеток дает конкурентные преимущества при формировании биопленки [42, 44].

Известно, что в основе бактериальной агрегации лежат гидродинамические характеристики, ламинарные и вихревые потоки среды обитания (например, морская, речная или сточная вода, кровь и др.), а в основе компактности и конфигурации агрегатов — химико-физические свойства поверхности [38, 42]. Агрегаты округлой формы лучше приспособлены к конкурентному взаимодействию с другими видами бактерий. Пролиферация клеток осуществляется за счет делящихся бактерий, находящихся в центре агрегата, тогда как наружные клетки «ответственны» за питание колонии, прием сигнальных молекул, мониторинг параметров окружающей среды и синтез экзополисахаридной матрицы [40, 42].

Таким образом, специализация бактериальных клеток в агрегатах-микроколониях является моделью бактериального консорциума с признаками формирования многоклеточного организма и, возможно, трамплином в сторону социальной эволюции [45, 46].

Роль и значение конфигурации бактериальных агрегатов в формировании биопленки была показана в работе G. Melaugh и соавт. с помощью компьютерного моделирования [42]. Площадь основания сформировавшейся через 480 ч биопленки находилась в обратной зависимости от конфигурации агрегатов и была наименьшей при их округлой форме [42].

Пролиферация бактерий. По мере деления бактерий в агрегатах дочерние клетки распространяются вверх и наружу, создавая кластеры и образуя грибовидную форму биопленки, которая способствует максимально равномерному проникновению питательных веществ [47—49]. После начальной лаг-фазы наблюдается экспоненциальный рост бактерий, который на этом этапе зависит от питательных веществ, находящихся в окружающей жидкости. В дальнейшем пролиферация в основном зависит от биологических процессов, доминирующих внутри биопленки (экскреция полисахаридных полимеров межклеточной адгезии (polymers intercellular adhesion, PIA) [47, 50].

PIA отводится особая роль в процессе формирования биопленки среди компонентов внеклеточного матрикса [47]. Установлено, что эти полимеры синтезируются бактериями и, как установлено, значительно отличаются по своему составу, химическим и физическим свойствам. Среди них встречаются поликатионные, нейтральные или полианионные соединения [48]. Структура многих PIA грамотрицательных бактерий (гомополисахаридов, гетерополисахаридов) относительно проста [49]. Эти молекулы стабилизируют структуру, придают механическую прочность биопленке и имеют решающее значение для ее защиты от неблагоприятных условий окружающей среды [49—52].

Скорость роста и плотность клеток в биопленке контролируются системой Quorum Sensing посредством сигнальных молекул, продуцируемых бактериями [22, 53—55]. Эта система регулирует коллективное поведение членов бактериального сообщества на всех этапах формирования и созревания биопленки, придавая согласованность процессам межклеточных взаимодействий, а также экспрессии генов при переходе бактерий на биопленочный образ жизни.

Заключение

Познание молекулярных механизмов адгезивно-коадгезивного взаимодействия бактерий стало основанием для создания глобальных стратегий, направленных на ингибирование формирования биопленок, которые используются в настоящее время. Одна из них направлена на изменение физико-химических или молекулярных свойств поверхности для предотвращения первичной и вторичной адгезий бактерий, решающих ключевую роль в формировании биопленки.

Финансирование. Работа поддержана грантовым проектом ДВО РАН 18-03-053.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.