Как и прочие микроорганизмы, бактерии обладают защитными механизмами, которые позволяют им выживать в конкурентной борьбе в своих экосистемах. В процессе внутри- и межвидовых взаимодействий прокариоты синтезируют ряд вторичных метаболитов, обладающих ингибирующей или бактерицидной активностью и являющихся одним из факторов поддержания микробного биоразнообразия [1—3]. К ним относятся бактериоцины, представляющие собой многочисленную и гетерогенную по размеру, структуре и механизму биологической активности группу рибосомально синтезированных антимикробных пептидов. В отличие от традиционных антибиотиков, которые имеют широкий спектр действия, бактериоцины токсичны только в отношении близкородственных видов бактерий [1, 4, 5].

Эти пептиды являются предметом повышенного внимания в качестве натуральных пищевых консервантов и потенциальной альтернативы современным антимикробным средствам [3, 5, 6]. Кроме того, бактерио-циногенез является ключевым признаком бактериальных штаммов, используемых в качестве пробиотиков, обеспечивающих нормализацию состава нормальной микрофлоры кишечника [2, 3, 5, 7].

Выработка бактериоцинов широко распространена в природе. Практически все бактерии и археи, известные на сегодняшний день, способны выделять в окружающую среду антимикробные пептиды, большинство из которых пока не идентифицировано [2, 5, 6]. Наиболее охарактеризованной и многочисленной группой бактериоцинов являются колицины. Они синтезируются Escherichia coli и другими членами семейства Enterobacteriaceae. Спектр антибиотической активности этих пептидов ограничивается близко родственными видами бактерий. За последние десятилетия выделено более 30 типов колицинов с различными структурой и механизмами антимикробного действия в отношении возбудителей энтеропатогенных инфекций [2, 3, 7, 8].

Научный интерес к изучению бактериоцинов опосредован угрожающим ростом антибиотикорезистентности бактерий, осознанием важности нормального биоценоза для здоровья человека, а также необходимостью изучения эффективности этих антимикробных пептидов, являющихся интересным и перспективным направлением для терапии инфекционных заболеваний [1, 2, 5, 8].

Несмотря на значительный прогресс в медицине, диагностике и лечении инфекций, патогенные микроорганизмы по-прежнему представляют серьезную угрозу для мирового сообщества. Их влияние велико как в развивающихся странах из-за ограниченного доступа к лекарствам, так и в развитых государствах, где бесконтрольное применение антибиотиков привело к широкому распространению мультирезистентных бактерий. Стратегия создания новых синтетических антибиотиков путем модификации существующих природных средств себя не оправдывает: патогенные микроорганизмы адаптируются к новым препаратам уже после первых испытаний. Мировая общественность выражает обоснованную тревогу за будущее человечества и призывает к поиску новых антимикробных средств. Применение бактериоцинов является одной из альтернативных стратегией лечения инфекционных заболеваний [2, 6, 9].

Перспективным направлением поиска новых бактериоцинов стало изучение антимикробной активности продуктов вторичного метаболизма морских бактерий, являющихся наиболее многочисленной и разнообразной группой живых организмов экосистем Мирового океана [1, 10—12]. Они существуют в условиях высокой конкуренции за пространства и ресурсы и служат перспективным источником бактериоцинов, возможно, более мощных и многочисленных по сравнению с аналогичными соединениями, выделенными из бактерий других экосистем [6, 13—16].

Цель исследования — проведение поиска и отбора бактериоцин-продуцирующих штаммов морских бактерий из экосистем акваторий Японского моря.

Объект исследования: морские бактерии из Коллекции морских микроорганизмов (КММ) Тихоокеанского института биоорганической химии (ТИБОХ) им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, относящиеся к типам Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, родам Vibrio, Pseudoalteromonas, Aeromonas, Alteromonas и к группе Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides акваторий Японского моря. Для исследования были выбраны следующие штаммы, принадлежащие к Phylum Proteobacteria, классу Gammaproteobacteria:

1) Pseudoalteromonas neustonica КММ 7501 (морская вода, залив Восток, Японское море); 2) Pseudoalteromonas distincta КММ 7504 (морская вода, бухта Попова, Японское море); 3) Marinomonas arenicola КММ 7506 (морская вода, залив Восток, Японское море); 4) Marinomonas arenicola КММ 7509 (морской грунт, залив Восток, Японское море); 5) Pseudomonas zhaodongensis KMM 7507 (грунт, залив Восток, Японское море); 6) Cobetia sp. KMM 7505 (морская вода, залив Восток, Японское море); 7) Cobetia marina KMM 7508 (морская вода, залив Восток, Японское море); 8) Pantoea sp. KMM 7511 (морская вода, залив Восток, Японское море); 9) Paraglaciecola sp. KMM 7513 (морская вода, залив Находка, Японское море).

Phylum Actinobacteria: Microbacterium testaceum KMM 7512 (морская вода, залив Восток, Японское море).

Все штаммы идентифицированы с помощью полифазной таксономии [17, 18] по фено-, гено- и филотипу. Ранее геномы 10 морских бактерий коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН были секвенированы (Pseudoalteromonas elyakovii KMM 162, Winogradskyella eximia KMM 3944, Idiomarina abyssalis КММ 227, Paraglaciecola mesophila KMM 241, Echinicola pacifica KMM 6166, Cobetia amphilecti KMM 1561, Formosa algae KMM 3553, Formosa agariphila KMM 3901, Flavobacterium sp. MF 4−5, Formosa sp. MF 2−3) [2, 13, 18, 19].

Исходя из поставленной цели и решаемых задач, был разработан дизайн пилотного исследования, включающий программу и методы. Он предусматривал проведение последовательных этапов: культивирование бактерий, скрининг продуцентов бактериоцинов и их частичную очистку, поиск потенциальных кластеров, участвующих в биосинтезе бакте-риоцинов (рис. 1).

Штаммы выращивали на качалке (250 об./мин) в колбах Эрленмейера (250 см³) со 100 мл питательной среды примерно 18 ч. Для приготовления сред брали простые сахара и соли. Основу питательных сред составляла отфильтрованная морская вода + 1,0—2,5% агара + солевые добавки: хлорид аммония, хлористый натрий, нитрат натрия, сернокислая медь, фосфорнокислый калий, нитрат аммония (10 ммоль л^–1), казеин (10 мг мл^–1). Из коммерческих сред использовался Sea Water Agar (Twin Pack, Himedia). При культивировании морских бактерий учитывались рекомендации American Public Health Association (APHA) [20].

Был проведен поиск продуцентов бактериоцинов среди этих штаммов бактерий.

Для анализа готовили серию разведений бактериальных клеток, максимально в 10 раз. Затем 0,1 мл каждого разведения распределяли по поверхности стерильной чашки Петри, выливали в нее питательную среду и инкубировали 18 ч. Для инактивации выросших бактерий чашки Петри переворачивали над фильтровальной бумагой, смоченной в хлороформе, и инкубировали 20—30 мин. После этого на чашку Петри наслаивали 3—5 мл жидкой агаризованной среды, содержащей 100 мкл чувствительного штамма, и инкубировали 18 ч. Затем оценивали зоны ингибирования роста чувствительных штаммов.

Штаммы, показавшие ингибирующую способность, культивировали на жидкой питательной среде. Культуральную жидкость отделяли от бактериальных клеток. Потом в культуральную жидкость добавляли сульфат аммония до 70% насыщения и оставляли на магнитной мешалке при 4 °C на 24 ч. Сформировавшийся осадок отделяли центрифугированием при 8000 g и ресуспендировали в минимальном количестве 0,1 М Na-фосфатного буфера, рН 7,0. К полученному раствору приливали трихлоруксусную кислоту с таким расчетом, чтобы получился 5% раствор. Смесь центрифугировали при 8000 g 20 мин, осадок собирали и растворяли в 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7,0.

Посредством технологии in silico был проведен поиск потенциальных кластеров, участвующих в биосинтезе колицина V (microcin-V MccV). Анализ проводили посредством технологии in silico с помощью сервисов MG-RAST (MetaGenomics Rapid Annotation с использованием Subsystem Technology) [13] и BAGEL4 (BActeriocin GEnome mining tooL) [16].

В результате анализа в штаммах морских бактерий Pseudoalteromonas elyakovii KMM 162, Cobetia amphilecti KMM 1561, Paraglaciecola mesophila KMM 241, Idiomarina abyssalis КММ 227 были выявлены кластеры генов, схожие с кластерами E. coli K12: J62, участвующих в биосинтезе Microcin-V, MccV. Этот бактериоцин сначала был назван колицином V (ColV). Однако из-за нескольких характеристик (низкая молекулярная масса и специализированная система секреции) он стал классифицироваться как микроцин [7].

Полученные результаты позволяют предположить, что обнаруженные кластеры генов морских бактерий Pseudoalteromonas elyakovii KMM 162, Cobetia amphilecti KMM 1561, Paraglaciecola mesophila KMM 241, Idiomarina abyssalis КММ 227 участвуют в биосинтезе микроцина-V. В составе кластеров этих бактерий выявлены гены (рис. 2),

При сравнительном анализе кластеров морских бактерий и тест-штамма E. coli K12: J62 принимался во внимание тот факт, что этот серотип эшерихий чаще, чем другие сероварианты, синтезирует микроцин V [7, 17].

Морская микробиология и химия морских природных соединений развиваются в настоящее время быстрыми темпами, являясь основой для морской биотехнологии и фармакологии. Однако успех на этом пути может быть достигнут только при фундаментальном изучении биологии морских микроорганизмов.

Результаты, полученные при проведении пилотного исследования, показали значительный бактерио-циногенный потенциал исследованных штаммов морских бактерий, что дает основание предполагать их способность синтезировать антимикробные вещества (пробиотики) и консерванты, подавляющие рост и развитие патогенных и условно-патогенных бактерий и дрожжевых грибов. Последующие очистка выделенных антибактериальных белков и изучение их биологической активности в отношении грамотрицательной и грамположительной флоры позволят сделать вывод о биологических свойствах и механизмах антагонистического действия этих важных со-единений и перспективах их использования в промышленном разведении морепродуктов (марикультуры), а также в медицинских и ветеринарных целях.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Комплексной программы фундаментальных исследований Дальневосточного отделения РАН «Дальний Восток», грантовый проект № 18−5-099 «Молекулярные механизмы антагонистических взаимодействий бактериоцинных штаммов в микробных сообществах морских экосистем как основа новой стратегии выбора антибактериальных пептидов для использования в качестве пробиотиков».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Михайлов В.В. — e-mail: mikhailov@piboc.dvo.ru; https://orcid.org/0000-0001-8332-063X

Андрюков Б.Г. — e-mail: andrukov_bg@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-4456-808X

Ляпун И.Н. — e-mail: irina-lyapun@list.ru; https://orcid.org/0000-0002-5290-3864

Автор, ответственный за переписку:

Андрюков Б.Г. — e-mail: andrukov_bg@mail.ru

Как цитировать:

Михайлов В.В., Андрюков Б.Г., Ляпун И.Н. Поиск и отбор бактериоцин-продуцирующих штаммов морских бактерий из экосистем акваторий Японского моря. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4):173-177. https://doi.org/10.17116/molgen201937041