Оценка эффективности нового набора реагентов для обнаружения ДНК возбудителя туберкулеза in vitro на основе изотермической амплификации

Пандемия новой коронавирусной инфекции (COVID-19) негативно повлияла на успехи в борьбе с туберкулезом (ТБ), достигнутые к 2020 г. [2, 3], в результате чего в 2021 и 2022 гг. во всем мире наблюдался рост случаев впервые выявленного ТБ [4]. Однако в Российской Федерации (РФ) роста заболеваемости и смертности от ТБ в указанные годы не было. В 2021 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) исключила РФ из списка стран с высоким бременем туберкулеза, но РФ осталась в двух списках стран с высоким бременем ТБ с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя и сочетанной инфекции ТБ/вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) [3]. Крайне важной задачей является быстрое выявление возбудителя ТБ — Mycobacterium tuberculosis complex (МБТ) для правильной постановки диагноза и определения резистентности возбудителя к лекарственным препаратам, применяемым для лечения ТБ, для того чтобы вовремя назначить больному адекватную терапию. Для этого первоначально используют молекулярно-генетические методы исследования, которые обладают высокой чувствительностью и уже давно внедрены в алгоритм лабораторной диагностики ТБ [1, 5]. С помощью данных методов выявляют ДНК возбудителя ТБ путем амплификации нуклеиновых кислот и получают результаты в течение одного дня от момента сдачи биологического материала в лабораторию в отличие от традиционно используемых культуральных методов (посев на плотные и жидкие питательные среды), результаты которых получают через 10—90 дней из-за медленного роста МБТ.

Для амплификации ДНК чаще всего используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР), на основе которой разработано и зарегистрировано в РФ семь отечественных тестов для выявления ДНК МБТ, однако в настоящее время широкое распространение получают более быстрые методы амплификации, например изотермическая петлевая амплификация (loop-mediated isothermal amplification — LAMP), которую ВОЗ в 2016 г. рекомендовала к применению в качестве возможной альтернативы микроскопии образца мокроты взрослых (но не тесту на основе ПЦР Xpert MTB/RIF (Cepheid, США)) [6]. Метод LAMP характеризуется использованием только одного вида фермента с вытесняющей активностью (в отличие от других изотермических методов амплификации) и проведением реакции при одной температуре, благодаря чему время получения результатов составляет 20—30 мин в отличие от ПЦР длительностью около 1,5 ч. Сокращение времени реакции важно для быстрого получения результатов и, как следствие, для ранней диагностики ТБ. К преимуществам LAMP относится также высокая специфичность благодаря использованию шести праймеров, специфичных к восьми участкам целевого фрагмента гена-мишени, тогда как при использовании метода ПЦР для детекции одной мишени используется пара праймеров и флуоресцентно-меченный зонд. Кроме того, метод LAMP является устойчивым к различным ингибиторам амплификации, содержащимся в образце биологического материала человека [7, 8]. В связи с вышеперечисленными преимуществами LAMP рассматривают как наиболее перспективный метод для диагностики point of care.

За рубежом разработан, рекомендован ВОЗ [6] и используется тест Loopamp MTBC Detection Kit (Eiken Chemical Company Ltd., Japan) на основе LAMP для выявления ДНК МБТ, но в РФ он не зарегистрирован, поэтому важно разрабатывать и регистрировать как медицинские изделия для диагностики in vitro отечественные тесты для быстрого и эффективного выявления ДНК МБТ.

Российский набор реагентов на основе изотермической петлевой амплификации для выявления ДНК микобактерий туберкулезного комплекса «АмплиТест МБТ-LAMP» был разработан в ФГБУ «ЦСП» ФМБА России. Набор реагентов предназначен для качественного определения ДНК МБТ в образцах биологического материала человека и бактериальных культурах. В наборе используются многокопийный ген-мишень IS6110 и однокопийный ген-мишень mpb64. Предел обнаружения набора для гена-мишени IS6110 — 1·10² ГЭ/мл, для mpb64 — 1·10³ ГЭ/мл. Учет результатов при использовании набора производится автоматически с помощью специального ПО.

Разработанный набор реагентов «АмплиТест МБТ-LAMP» выпускается в 4 формах комплектации, которые предназначены для выполнения полного LAMP-исследования, включающего экстракцию ДНК и проведение LAMP. В состав форм 1 и 2 входят комплекты реагентов соответственно «РИБО-преп ТБ» вариант 100 для выделения ДНК ручным способом и «Магно-Сорб-Комбо ТБ» вариант 100 для выделения ДНК на автоматических станциях, а также «LAMP-комплект» вариант FRT-100 F, содержащий реагенты в жидком виде, для проведения амплификации, они рассчитаны на анализ 100 образцов, включая контроли. Формы 3 и 4 включают соответственно комплекты реагентов «РИБО-преп ТБ» вариант 100 и «Магно-Сорб-Комбо ТБ» вариант 100, а также «LAMP-комплект» вариант FRT-96 L с готовой реакционной смесью в лиофилизированном виде и рассчитаны на анализ 96 образцов, включая контроли. Лиофилизированная форма обеспечивает длительный срок хранения реагентов и повышает удобство использования.

Целью исследования было оценить эффективность нового набора реагентов на основе изотермической амплификации «АмплиТест МБТ-LAMP» для обнаружения ДНК возбудителя туберкулеза in vitro при исследовании биологического материала и бактериальных культур в дорегистрационных клинических испытаниях в сравнении с референсным тестом (набором сравнения), аналогичным по назначению и зарегистрированным в РФ в качестве медицинского изделия.

Протестированы 471 образец биологического материала от пациентов с ТБ легких и внелегочной локализации (мокрота (n=110), бронхоальвеолярный лаваж (n=110), моча (n=106), биоптат (операционный материал (n=145)) и 100 образцов бактериальных культур.

Сотрудники ГБУЗ МО «Московский областной клинический противотуберкулезный диспансер» (ГБУЗ МО «МОКПТД») собирали нативные образцы от пациентов с ТБ для клинических испытаний в рамках стандартных диагностических исследований. Информированного согласия пациентов не требовалось ввиду особенностей получения биологического материала для исследования in vitro.

Отрицательные в отношении МБТ образцы биологического материала пациентов анализировали на содержание в них нетуберкулезных микобактерий (НТМБ) и других микроорганизмов, не относящихся к роду Mycobacterium, методом посева с получением роста культур и их идентификацией с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF. НТМБ (M. avium, M. fortuitum, M. kansasii, M. gordonae, M. intracellulare, M. abscessus, M. chelonae, M. xenopi, M. lentiflavum, M. chimera, M. paragordonae) культивировали в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 в пробирках с флуоресцентным компонентом и питательной средой Middlebrook (BBL MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube) (BD, США) с получением роста через 11—15 дней [9]. Выделение и типирование штаммов других микроорганизмов осуществляли в соответствии со стандартной методикой [10] с использованием дифференциально-диагностических сред: молочно-желточно-солевого агара (МЖСА) для стафилококков (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis), шоколадного агара для Haemophilus influenzae, агара Эндо для Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca. Для видовой идентификации полученных культур использовали систему MALDI Biotyper и масс-спектрометр Microflex LT (Bruker Daltonics GmbH & Со.KG, Германия).

Нативные образцы биологического материала человека, кроме бактериальных культур, подвергали предварительной обработке с целью их деконтаминации и гомогенизации с помощью реагентов NALC-NaOH [1] с получением осадков, которые затем разделяли на пять равных частей по 0,5 мл. Четыре части осадка использовали для анализа с помощью четырех форм комплектации нового набора реагентов «АмплиТест МБТ-LAMP», а пятую часть осадка анализировали с помощью набора сравнения — набора реагентов для обнаружения и количественного определения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиТест МБТ» форма 1 (ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, РУ №РЗН 2023/20838) в соответствии с инструкциями по применению указанных наборов реагентов. По правилам проведения клинических испытаний с целью регистрации медицинского изделия, в качестве референсного метода необходимо использовать близкий по назначению и методике тест, зарегистрированный в РФ, а не «золотой стандарт», которым для диагностики ТБ является посев на питательные среды. По этой причине вместо диагностической чувствительности и специфичности нового набора реагентов вычисляли положительное и отрицательное соответствие результатов с 95% доверительными интервалами, которые рассчитывали с использованием метода Clopper и Pearson [11].

Положительное соответствие результатов (ПСР) рассчитывали для образцов каждого вида материала отдельно по формуле:

где а — количество образцов, в которых ДНК МБТ выявлена и с помощью нового набора, и с помощью референсного теста; b — количество образцов, в которых с помощью референсного теста выявлена ДНК МБТ, а с помощью нового набора ДНК МБТ не обнаружена.

Отрицательное соответствие результатов (ОСР) рассчитывали для образцов каждого вида материала отдельно по формуле:

где с — количество образцов, в которых с помощью референсного теста НЕ обнаружена ДНК МБТ, но обнаружена ДНК МБТ с помощью нового набора; d — количество образцов, в которых ДНК МБТ не обнаружена ни с помощью нового набора, ни с помощью референсного теста.

Выделение ДНК из образцов при использовании набора «АмплиТест МБТ-LAMP» форм 2 и 4 проводили на автоматической станции KingFisher Flex 96 (Thermo Fisher Scientific, США).

Амплификацию при использовании нового набора реагентов осуществляли с использованием программируемых приборов с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени: Rotor-Gene 6000 (Corbett Research Pty Ltd., Австралия; РУ №ФС 2006/1222); CFX96 (Bio-Rad, США; РУ №ФСЗ 2008/03399); «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия; РУ №ФСР 2011/10229), QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США; РУ №ФСР 2019/8446); с помощью специального программного обеспечения (ПО) для автоматического учета результатов (РУ №РЗН 2019/8870) и без него в соответствии с инструкцией к набору «АмплиТест МБТ-LAMP» и руководством пользователя указанного ПО.

Амплификацию с помощью референсного теста проводили с использованием CFX96.

Сотрудниками бактериологической лаборатории ГБУЗ МО «МОКПТД» были проведены клинические испытания нового набора реагентов для выявления ДНК микобактерий туберкулезного комплекса методом изотермической петлевой амплификации «АмплиТест МБТ-LAMP». В ходе испытаний оценивали эффективность нового набора относительно набора сравнения «АмплиТест МБТ» (ФГБУ «ЦСП» ФМБА России), определяли положительное и отрицательное соответствие результатов обнаружения ДНК МБТ. Результаты выявления ДНК МБТ в образцах разного вида материала, полученные при использовании обоих наборов, представлены в табл. 1.

Таблица 1. Результаты обнаружения ДНК МБТ в образцах разного вида материала при использовании нового набора реагентов и референсного теста

Примечание. ДНК МБТ — ДНК Mycobacterium tuberculosis complex; ^a – количество образцов, в которых обнаружена ДНК МБТ как с помощью нового набора, так и набора сравнения; ^b – количество образцов, в которых обнаружена ДНК МБТ с помощью набора сравнения, но НЕ обнаружена ДНК МБТ с помощью нового набора; ^c – количество образцов, в которых НЕ обнаружена ДНК МБТ с помощью набора сравнения, но обнаружена ДНК МБТ с помощью нового набора; ^d – количество образцов, в которых НЕ обнаружена ДНК МБТ как с помощью нового набора, так и набора сравнения.

Далее рассчитывали показатели эффективности нового набора реагентов «АмплиТест МБТ-LAMP» (положительное и отрицательное соответствие результатов) относительно референсного теста «АмплиТест МБТ» (табл. 2).

Таблица 2. Показатели, характеризующие эффективность нового набора реагентов «АмплиТест МБТ-LAMP»

Примечание. ДИ — доверительный интервал.

Согласно результатам проведенных дорегистрационных клинических испытаний набора «АмплиТест МБТ-LAMP» в сравнении с набором «АмплиТест МБТ», дискордантных результатов выявлено не было, результаты исследования с помощью нового набора и референсного теста полностью совпали для всех образцов. Следовательно, показатели эффективности (положительное и отрицательное соответствия результатов нового набора реагентов) составили 100% для всех образцов. Следует отметить, что отрицательные в отношении МБТ образцы содержали различные микроорганизмы: нетуберкулезные микобактерии (НТМБ): M. avium, M. fortuitum, M. kansasii, M. gordonae, M. intracellulare, M. abscessus, M. chelonae, M. xenopi, M.lentiflavum, M.chimera, M.paragordonae и другие микроорганизмы: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, которые были идентифицированы с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF после получения культур из этих образцов.

В тест-системах на основе амплификации нуклеиновых кислот для выявления ДНК МБТ традиционно используемой мишенью является элемент IS6110 (Insertion Sequence), который представляет собой последовательность размером 1355 пар нуклеотидов (п.н.) [12], специфичен в отношении Mycobacterium tuberculosis complex [13] и представлен 1—25 копиями на геном МБТ. Благодаря многокопийности эта мишень используется в различных тестах отечественного и зарубежного производства, так как позволяет повысить их чувствительность. В новом наборе «АмплиТест МБТ-LAMP» также используется элемент IS6110 и введен дополнительный ген-мишень — mpb64, специфичный для M. tuberculosis complex. Данный ген кодирует белок MPB64 (Mannose Binding Protein 64), или MPT64 (Mycobacterium Protein Tuberculosis), размером 24 кДа, секретируемый M. tuberculosis complex в процессе роста бактерий, и представлен одной копией на геном МБТ [14]. Иммуногенные свойства белка MPT64 используют в иммунохроматографических тестах для определения активной формы ТБ [15]. Кроме того, ген mpb64 является мишенью для обнаружения ДНК МБТ методом ПЦР [16, 17]. Эта дополнительная мишень в наборе «АмплиТест МБТ-LAMP» нужна для отбора проб, пригодных для анализа с помощью наборов реагентов марки «АмплиТест» для выявления генетических маркеров резистентности МБТ к рифампицину и изониазиду, а также позволяет определять ДНК штаммов МБТ с нулевым количеством копий IS6110, которые встречаются, например, в странах Юго-Восточной Азии [13, 18], США [19] и Франции [20].

В результате проведенных испытаний для всех исследованных положительных образцов были получены значения порогового цикла Ct (графики флуоресценции пересекали пороговую линию) для гена-мишени IS6110, что свидетельствует об отсутствии в данной работе штаммов ДНК МБТ с нулевым количеством копий IS6110. В то же время для образцов с концентрацией ДНК МБТ не ниже 1000 ГЭ/мл (концентрация определена с помощью набора «АмплиТест МБТ») были получены значения Ct для однокопийного гена-мишени mpb64 при использовании как нового набора «АмплиТест МБТ-LAMP», так и набора сравнения «АмплиТест МБТ». В образцах, содержащих ДНК МБТ в диапазоне концентраций 500—1000 ГЭ/мл, значения Ct были определены для мишени mpb64 только с помощью набора сравнения, но не во всех образцах было определено значение Ct при использовании нового набора «АмплиТест МБТ-LAMP», это объяснимо тем, что концентрация образца находится ниже предела детекции мишени mpb64. Определение значений порогового цикла Ct для образца по обеим мишеням (IS6110 и mpb64) является критерием пригодности такого образца для его последующего анализа с помощью наборов реагентов марки «АмплиТест» для выявления генетических маркеров резистентности МБТ к рифампицину и изониазиду.

Разработанный в ФГБУ «ЦСП» ФМБА России новый набор реагентов «АмплиТест МБТ-LAMP» на основе изотермической амплификации предназначен для качественного определения ДНК МБТ в образцах биологического материала человека и бактериальных культурах, выпускается в том числе с готовой реакционной LAMP-смесью в лиофилизированной форме (благодаря чему увеличивается срок годности, а хранение осуществляется при температуре от +2°C до +8°C) и позволяет определять ДНК МБТ в 3 раза быстрее метода ПЦР.

В результате проведенных дорегистрационных клинических испытаний нового набора реагентов «АмплиТест МБТ-LAMP» показана его высокая эффективность в отношении обнаружения ДНК МБТ в сравнении с референсным тестом: положительное соответствие результатов и отрицательное соответствие результатов составили 100% для образцов всех видов биологического материала. Набор реагентов «АмплиТест МБТ-LAMP» уже имеет регистрационное удостоверение (РУ №РЗН 2024/23289) в РФ и может использоваться как медицинское изделие для диагностики in vitro, что в комплексе с другими методами диагностики позволит быстро и эффективно выявлять МБТ с целью назначения больному своевременной противотуберекулезной терапии, а также отбирать пробы ДНК МБТ, пригодные для анализа с помощью наборов реагентов для выявления генетических маркеров устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину и изониазиду «АмплиТест МБТ-Резист-I» (ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, РУ №РЗН 2022/16720) и «АмплиТест МБТ-Резист-I Lyo» (ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, РУ №РЗН 2024/23386).

Источник финансирования. Исследование выполнено в соответствии с соглашением №020-15-2021-004 от 07.10.2021 с Минпромторгом России о предоставлении гранта в форме субсидий из федерального бюджета бюджетным учреждениям на реализацию проектов по разработке лекарственных препаратов и медицинских изделий согласно Постановлению Правительства Российской Федерации от 21.12.2020 №2187 в рамках проекта «Разработка панели диагностических тестов на основе методов амплификации нуклеиновых кислот для быстрого выявления ДНК микобактерий туберкулеза, обладающих множественной и широкой лекарственной устойчивостью».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.