Введение
Ежегодно в Российской Федерации регистрируются до 500 тыс. случаев присасывания клещей, являющихся переносчиками трансмиссивных инфекций. Глобальные климатические изменения, расширяющие ареал обитания клещей и их прокормителей, а также увеличение числа людей, посещающих природные эпидемические очаги, способствуют повышению вероятности заражения и определяют актуальность своевременной диагностики и проведения профилактических мероприятий. К наиболее частым инфекциям, передаваемым клещами, относятся бактериальные клещевые боррелиозы [1]. Несмотря на тенденцию последних лет к снижению заболеваемости вирусным клещевым энцефалитом [2], высокий риск инвалидизации и летальных последствий обусловливает актуальность данной проблемы. Переносчиками и основным резервуаром этих возбудителей являются клещи рода Ixodes. Зараженность клещей на разных территориях существенно отличается. Так, боррелиями семейства Borrelia burgdorferi s.l. в эпидочагах могут быть поражены от 22 до 57% клещей, а не вызывающими классическую эритему боррелиями Borrelia miyamotoi — 10—17% [1, 3—5]. Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) выявляется на территориях высокой эпидемической опасности у 1—3% исследованных клещей [2, 4, 6].
В соответствии с СанПиНом 3.3686—21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» пациентам при обращении человека за медицинской помощью в связи с присасыванием клеща необходимо в максимально короткий срок (не более 72 ч) проводить экстренную антибиотикопрофилактику боррелиозов или экстренную иммуноглобулинопрофилактику вирусного энцефалита с учетом результатов лабораторных исследований.
Широко используемые в настоящее время методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) достаточно чувствительны и специфичны [6, 7], но имеют свои недостатки, связанные с повышенными требованиями к организации лабораторий, лицензией для работы с данными возбудителями, а также рисками взаимной контаминации проб при массовом тестировании.
Время, необходимое для транспортировки образцов в специализированную лабораторию и длительность выполнения анализов, часто ограничивают оптимальные сроки проведения экстренной профилактики. В результате наблюдается необоснованно широкое применение антибиотиков, а в некоторых регионах профилактическое введение дорогостоящего противоклещевого иммуноглобулина выполняется 95% укушенных клещом пациентам.
Кроме того, для выявления возбудителей клещевых инфекций B. burgdorferi s.l., B. miyamotoi и ВКЭ требуется использование разных наборов реагентов, что затрудняет выполнение тестирования всех патогенов в одной постановке и удлиняет время анализа. В связи с этим разработка комбинированных экспресс-тестов молекулярно-генетической диагностики, не требующих сложного оборудования, представляется весьма актуальной. Одним из таких методов является петлевая изотермическая амплификации нуклеиновых кислот (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP), позволяющая выполнить анализ не дольше 60 мин без использования лабораторных термоциклеров [8—10]. Ранее мы описали модифицированную методику для детекции Borrelia burgdorferi s.l. в реакции LAMP в клещах Ixodes [11].
Цель настоящей работы — разработка набора для совместной изотермической детекции нуклеиновых кислот возбудителей боррелиоза Borrelia burgdorferi s.l., Borrelia miyamotoi, а также набора детекции ВКЭ.
Материал и методы
Пробы для исследования
В работе использовали 178 образцов ДНК и 325 образцов РНК, выделенных из клещей, предварительно исследованных в лаборатории особо опасных инфекций ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Красноярском крае», а также 44 образца клещей Ixodes, сбор которых проводился в сезон 2022—2023 гг. на лесных и лесостепных участках Красноярска и его окрестностей. В работе также использовали искусственно контаминированные контрольными ДНК-плазмидами 16 анонимных образцов ликвора пациентов неврологического отделения.
Праймеры для LAMP
Праймеры для реакции LAMP подбирали с использованием интернет-сервиса PrimerExplorer V5. Синтез олигонуклеотидов выполнялся в ООО «Люмипроб РУС» (Россия). Олигонуклеотидные праймеры представлены в табл. 1.
Таблица 1. Олигонуклеотидные праймеры, используемые в исследовании
| Возбудитель | Праймер | Последовательность 5’-3’ |
| B. miyamotoi | F3_1 | TTCTAACAAAGGACAATATTCCT |
| B3_1 | TTCATTTAAGGGGAAACGATT | |
| FIP_1 | CGTTTTCTCTAGCTCGATTGGGAAACACGACCCAGAAATTGACA | |
| BIP_1 | CGATATTACGCCACTGACTTCACATGGTTTTTTGTTTTCAGGATCA | |
| LF_1 | TGTGCAACATTTGTGGTTG | |
| LB_1 | TCACTAAGTCTCAGTGAAAGA | |
| B. burgdorferi s.l. | F3_2 | AGCCTTTAAAGCTTCGCT |
| B3_2 | TTCATTCACGCAGTGTCG | |
| FIP_2 | GGCCGGTTACTTATCATCGTCTTTCTGCGTCTTATTAGTTAGTTGG | |
| BIP_2 | GAGAGGGTGAACGGTCACACCATTGCGGAAGATTCTTAGC | |
| LF_2 | GGTAGGCATTTACCCCA | |
| LB_2 | AGATACGGTCCAGACTCC | |
| Вирус клещевого энцефалита | F3_3 | GAAGACGGCATCCTTCAC |
| B3_3 | CACGGTAGAGGCAGATCA | |
| FIP_3 | TCTGCANAACAAGGACACATCTCGTCTCCTCAGAAAANACCA | |
| BIP_3 | GACTTGGCTCAGACTGTCATTCTGAACCAGTCACGATGGAC | |
| LF_3 | CATAGTCCCCCATNGTCAANA | |
| LB_3 | GAGCTNGACAAGACTCTGGAACAC |
Примечание. Где N = T или C или G или A, F3 — прямой внешний праймер, B3 — обратный внешний праймер, FIP — прямой внутренний праймер, BIP — обратный внутренний праймер, LF — прямой петлевой праймер, LB — обратный петлевой праймер.
Конструирование положительных контрольных образцов
Для конструирования положительных контрольных образцов плазмидных ДНК для каждого из возбудителей подбирали специфичные участки с использованием базы данных генетических последовательностей Genbank. Выравнивание последовательностей штаммов для выявления боррелий проводили с использованием программного обеспечения MEGA-X. Выравнивание последовательностей ВКЭ осуществлялось с использованием программы Jalview 2.11. Выбор олигонуклеотидов осуществляли с использованием портала PrimerExplorer v5. Для подбора праймеров на ДНК возбудителя безэритемной формы боррелиоза (B. miyamotoi) выбран наиболее консервативный для всех известных штаммов возбудителя ген глицерофосфодиэфирфосфодиэстеразы (glpQ). Для выявления эритемной формы боррелиоза выбран ген поверхностного белка боррелий OspC, являющийся наиболее распространенным среди штаммов B. burgdorferi s.l. Консервативную область генома ВКЭ выбирали методом конструирования наиболее часто встречающихся вариантов нуклеотидных последовательностей.
ДНК фрагментов целевых последовательностей амплифицировали и использовали для трансформации клеток E. coli с помощью набора для клонирования Quick-TA kit («Евроген», Россия) и последующим отбором клонов, несущих рекомбинантные плазмиды. Для дальнейшей работы полученные рекомбинантные плазмиды линеаризовали рестриктазой MroXI («СибЭнзим», Россия). Концентрацию ДНК в полученном положительном контрольном образце определяли с использованием цифровой ПЦР на платформе QX200 Droplet Digital PCR System (Bio-Rad, США) согласно инструкциям производителя. Полученные ДНК плазмиды в дальнейшем обозначены как BOR19 (B. burgdorferi s.l.), MIY1 (B. miyamotoi) и TBEV1 (вирус клещевого энцефалита).
Выделение ДНК и РНК и постановка реакции LAMP
Для выделения ДНК и РНК из суспензий самостоятельно собранных клещей и ликвора использовали набор «РеалБест Экстракция 100» (АО «Вектор-Бест», Россия).
Для постановки LAMP с набором NT MxLAMP BOR19+MIY1 с целью выявления B. burgdorferi s.l. и B. miyamotoi, а также NT LAMP TBEV1 для выявления ВКЭ готовили на льду реакционные смеси объемом по 25 мкл, включающие в конечной концентрации 0,8 M бетаин, 6 мМ MgSO4, 1X изотермический буфер («Иннова плюс»), 1,4 мМ дНТФ, 0,4Х EvaGreen («Синтол», Россия), 8 ед. UltraFast Bst полимеразы («Иннова плюс»); для набора NT MxLAMP BOR19+MIY1 по 0,2 мкМ праймеров F3_1, F3_2 и B3_1, B3_2, по 1,6 мкМ праймеров FIP_1, FIP_2 и BIP_1, BIP_2, по 0,4 мкМ праймеров LF_1, LF_2 и LB_1, LB_2; для набора NT LAMP TBEV1 по 0,2 мкМ праймеров F3_3, B3_3, по 1,6 мкМ праймеров FIP_3, BIP_3, по 0,4 мкМ праймеров LF_3, LB_3; также добавляли 5 мкл ДНК, выделенную из клещей или 5 мкл кДНК, если использовали набор NT LAMP TBEV1. Результаты тестирования выражали в минутах времени реакции до появления стабильного флуоресцентного сигнала. В качестве отрицательного контрольного образца (ОКО) использовали синтезированный участок ДНК клеща, не содержащий последовательности генов клещевых инфекций.
Анализ ликвора
Для контаминирования проб ликвора пациентов смешивали 1 часть плазмидной ДНК в различных концентрациях и 9 частей ликвора, после чего полученные образцы использовали в реакции LAMP, добавляя по 5 мкл в реакцию. В реакции LAMP при тестировании образцов ликвора использовали буфер, описанный в патенте US10072309.
Проведение анализа методом LAMP в суспензиях клещей без выделения ДНК
Клещи помещались в отдельные пробирки объемом 1,5 мл. В каждую пробирку добавляли по 30 мкл лизирующего буфера (Патент US10072309), затем помещали в морозильную камеру на 1 час. Затем каждый образец клеща перетирался стеклянным пестиком круговыми движениями. Полученную суспензию отбирали в отдельную пробирку и разводили в 10 раз ТЕ-буфером, после чего 5 мкл разведенной суспензии добавляли в реакцию LAMP.
Детекция продуктов LAMP
Детекцию продуктов LAMP проводили с использованием интеркалирующих красителей, регистрируя кинетику флюоресцентного сигнала на приборах CFX96 Touch (Bio-Rad) и FLUORITE (Xi’an Tianlong Science and Technology Co., Ltd., Китай) по каналу флуоресценции FAM при температуре 60°C. Также использовался метод визуальной оценки результата реакции появлением флюоресценции после добавления 4 мкл 1000X SYBR green при освещении реакционной среды лучом портативного фонарика с длиной волны света 365 нм.
Исследование методом ПЦР-РВ
Сравнительное тестирование методом ПЦР-РВ выполняли на тех же амплификаторах с использованием наборов «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s.l./РНК ВКЭ» (АО «Вектор-Бест», Россия), «РеалБест ДНК Borrelia miyamotoi, а также «АмплиСенс TBEV, B. burgdorferi s.l., A. phagocytophillum, E. chaffeensis/E. muris-FL» и «АмплиСенс Borrelia miyamotoi-FL» (ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителей.
Статистический анализ
Статистический анализ результатов осуществляли с помощью программы Statistica 12.0 (StatSoft, США).
Результаты
Определение предела обнаружения реакции LAMP
Значения концентраций контрольных ДНК-плазмид по результатам цифровой ПЦР составили: 4,7·107; 3,6·107 и 3,6·107 копий/мкл для B. burgdorferi s.l. (BOR19); B. miyamotoi (MIY1) и вируса клещевого энцефалита (TBEV1) соответственно. Пример кривых флуоресцентного сигнала при детекции контрольных образцов плазмидных ДНК представлен на рис. 1, на цветной вклейке.
Рис. 1. Кривые флуоресценции при выполнении тестирования разведенных в 100 раз контрольных образцов ДНК-плазмид в реакции LAMP.
Оценка предела аналитической чувствительности и диапазона линейности выполнялась по выявлению флюоресцентного сигнала в последовательно разведенных аликвотах ДНК-плазмид (рис. 2, на цветной вклейке.).
Рис. 2. Предел обнаружения специфических ДНК-плазмид наборами NT MxLAMP BOR19+MIY1 (а, б) и NT LAMP TBEV1 (в).
Предел аналитической чувствительности у наборов NT MxLAMP BOR19+MIY1 (а, б) и NT LAMP TBEV1 (в) был исследован с синтетическими плазмидами BOR19, MIY1 и TBEV1 в десятикратных разведениях. Числа (102—107) обозначают степень разведения исходной плазмиды; RFU — интенсивность флюоресценции.
Рассчитанный по результатам измерения уровня ДНК-плазмид методом цифровой ПЦР — предел аналитической чувствительности (предел обнаружения) разрабатываемых наборов при использовании в формате LAMP составил для BOR19 — 46 копий/мкл или 230 копий в реакции; для MIY1 — 361 копии/мкл или 1805 копий в реакции; для TBEV1 — 36 копий/мкл или 180 копий в реакции.
Результаты тестирования клещей в сравнении с коммерческими наборами
Из 178 образцов клещей, параллельно исследованных на выявление боррелиозов методом LAMP с помощью разработанного набора NT MxLAMP BOR19+MIY1 и ПЦР-РВ с использованием коммерческого набора «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s.l./РНК ВКЭ» и «РеалБест ДНК Borrelia miyamotoi», совпадение результатов тестирования методов наблюдается в 158 или в 89% случаях (табл. 2).
Таблица 2. Сравнительное тестирование образцов выделенных ДНК из клещей в реакции ПЦР и LAMP
| Название набора | Положительно | Отрицательно | Всего |
| B. burgdorferi s.l.: | |||
| «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s.l.»/РНК ВКЭ» | 90 | 88 | 178 |
| NT MxLAMP BOR19+MIY1 | 70 | 108 | |
| Borrelia miyamotoi: | |||
| «РеалБест ДНК Borrelia miyamotoi» | 1 | 177 | 178 |
| NT MxLAMP BOR19+MIY1 | 1 | 177 | |
| Вирус клещевого энцефалита: | |||
| «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s.l.»/РНК ВКЭ» | 321 | 4 | 325 |
| NT LAMP TBEV1 | 321 | 4 | |
В целом, чувствительность набора NT MxLAMP BOR19+MIY1 составила 78% (95% ДИ 68—86%), специфичность 100% (95% ДИ 96—100%). С учетом носительства боррелий собранных клещей прогностическая значимость положительного результата составила 78% (95% ДИ 79—89%), а прогностическая значимость отрицательного результата соответственно 100% (95% ДИ 96—100%).
Из 325 образцов в реакции LAMP с набором NT LAMP TBEV1 было выявлено 4 положительных пробы и все результаты совпали с результатами коммерческих наборов ПЦР-РВ. В результате чувствительность набора составила 100% (95% ДИ 40—100%), специфичность — 100% (95% ДИ 99—100%). Соответственно при реальной пораженности вирусом собранных клещей прогностическая значимость положительного результата составила 100% (95% ДИ 79—89%), и прогностическая значимость отрицательного результата 100% (95% ДИ 96—100%).
Часть образцов клещей была исследована параллельно с нашими наборами одновременно на двух коммерческих наборах АО «Вектор-Бест»: «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s.l./РНК ВКЭ» и «РеалБест ДНК Borrelia miyamotoi» и двух наборах «АмплиСенс» (ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора): «АмплиСенс TBEV, B. burgdorferi s.l., A. phagocytophillum, E. chaffeensis/E. muris-FL» и «АмплиСенс Borrelia miyamotoi-FL». Из 21 образца набором производства АО «Вектор-Бест» удалось выявить 6 положительных образцов, набором «АмплиСенс» — 4 положительных, которые полностью совпали с результатами LAMP. Все образцы были отрицательными в реакции на ВКЭ. Результаты тестирования отражены в табл. 3.
Таблица 3. Сравнение результатов использования коммерческих наборов для ПЦР-РВ АО «Вектор-Бест» и ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора с разработанными наборами для LAMP
| Всего исследовано образцов | 21 | Набор | |||
| «РеалБест» | «АмплиСенс» | NT MxLAMP BOR+MIY | NT LAMP TBEV1 | ||
| Из них положительных | На B. burgdorferi | 6 | 4 | 4 | 0 |
| На B. miyamotoi | 0 | 0 | |||
| На TBEV | 0 | 0 | 0 | 0 | |
Визуальная оценка результатов LAMP
Примеры визуальной оценки результатов LAMP в пробах с выделенной ДНК, в образцах суспензий клещей без выделения ДНК, а также контаминированных ДНК-плазмидами образцов ликвора в видимом свете и при различных вариантах использования флуоресцентных меток представлены на рис. 3, 4 и 5, на цветной вклейке.
Рис. 3. Визуальная оценка результатов реакции LAMP для выявления B. burgdorferi и B. miyamotoi в образцах ДНК клещей.
ОКО — отрицательный контрольный образец, B — плазмидная ДНК B. burgdorferi (BOR19) с концентрацией 47000 копий/мкл, M — плазмидная ДНК B. miyamotoi (MIY1) с концентрацией 360000 копий/мкл.
Рис. 4. Визуальная оценка результатов LAMP для выявления B. burgdorferi и B. miyamotoi в образцах суспензий клещей без выделения ДНК.
ОКО — отрицательный контрольный образец, B — плазмидная ДНК B. burgdorferi (BOR19) с концентрацией 47000 копий/мкл, M — плазмидная ДНК B. miyamotoi (MIY1) с концентрацией 360000 копий/мкл.
Рис. 5. Визуальная оценка результатов LAMP для выявления боррелий B. burgdorferi, B. miyamotoi (А) и вируса клещевого энцефалита (Б) в пробах ликвора с добавлением соответствующих плазмидных ДНК при облучении УФ 365 нм.
ОКО — отрицательный контрольный образец, Л — образец ликвора, Л+B — смесь ликвора с десятикратными разведениями плазмидной ДНК B. burgdorferi (BOR19), Л+М — смесь ликвора с десятикратными разведениями плазмидной ДНК B. miyamotoi (MIY1), B — плазмидная ДНК B. burgdorferi (BOR19) с концентрацией 47000 копий/мкл, M — плазмидная ДНК B. miyamotoi (MIY1) с концентрацией 360000 копий/мкл. Л+T — смесь ликвора с десятикратными разведениями плазмидной ДНК вируса клещевого энцефалита (TBEV1), T — плазмидная ДНК вируса клещевого энцефалита (TBEV1) с концентрацией 36000 копий/мкл.
На рис. 3, на цветной вклейке показано, что и при дневном свете, и при облучении УФ можно визуально четко отличить положительные образцы: они имеют розовый или ярко-оранжевый цвет в случае анализа с использованием УФ.
На рис. 4, на цветной вклейке видно, что цвет раствора при дневном свете в случае положительных проб был желтый, а в случае отрицательных — оранжевый.
На рис. 5, на цветной вклейке представлены результаты визуальной оценки плазмидных стандартов в пробах ликвора пациентов при облучении УФ 365 нм. Видно, что положительные образцы имеют яркий оранжевый цвет по сравнению с отрицательными и легко различимы.
Обсуждение
Перспективным решением проблемы своевременной оценки риска заражения и этиологически обоснованной экстренной медикаментозной профилактики могло бы стать использование молекулярно-генетического экспресс-теста непосредственно при оказании первой помощи при извлечении клеща. Опубликованные нами [11, 12] и литературные данные [9, 10] демонстрируют возможность визуальной оценки результатов реакции LAMP при выявлении боррелий в цельном клеще, в том числе и без необходимости процедуры выделения ДНК.
Вместе с тем, при решении вопроса выбора между антибиотикопрофилактикой или введением противовирусного иммуноглобулина принципиально важным является дифференцировка бактериальной или вирусной природы возбудителя. Поскольку наиболее часто в клещах выявляют бактерии B. burgdorferi s.l. и B. miyamotoi, а также ВКЭ, для разработки были выбраны два варианта тестов: одновременного обнаружения ДНК двух групп боррелий и отдельный набор для выявления РНК ВКЭ. Другие возбудители, как правило, выявляются в клещах реже 1—2% и не были обнаружены среди обследованных нами образцов. Хотя в публикации специалистов из Забайкальского края [5] сообщалось о частоте выявления A. phagocytophillum, E. chaffeensis до 7—12%, тем не менее заболеваемость людей гранулоцитарным анаплазмозом или моноцитарным эрлихиозом регистрируется довольно редко. Следует отметить, что и для этих возбудителей нет принципиальных барьеров в разработке методик диагностики методом LAMP.
Полученные результаты испытаний разработанных нами наборов реагентов совпадают по специфичности с результатами использования коммерческих наборов для классической ПЦР-РВ, хотя уступают им по чувствительности по выявлению ДНК B. burgdorferi s.l. (табл. 2). Интересно, что в работе [9] была продемонстрирована более высокая по сравнению с ПЦР способность LAMP выявлять возбудителей боррелиозной возвратной лихорадки в «сухих пятнах» крови пациентов. Вопрос модификации изотермической методики с целью повышения чувствительности может быть решен в дальнейших исследованиях. Особенности клеща как объекта аналитических тестов требуют также учета влияния многочисленных интерферирующих субстанций и перекрестных реакций [6].
При этом остается открытым вопрос определения минимальной инвазивной дозы возбудителя, так как известно, что далеко не все заразные клещи после укуса провоцируют развитие заболевания. Так, расчетные данные [4] свидетельствуют, что только 73% клещей с обнаруженным возбудителем боррелиоза вызывают при укусе заражение человека. Очевидно, самое малое количество возбудителя в переносчике может определяться высокочувствительными диагностическими методами, но не представлять серьезной угрозы для укушенного человека.
Достигнутые аналитические параметры разработанных наборов [13] позволяют надеяться на перспективы дальнейшей адаптации метода к использованию в полевых условиях на базе портативных устройств [14, 15].
К ограничениям этого исследования также можно отнести то, что мы не получили пока окончательных данных о диагностической эффективности разработанного метода LAMP при исследовании образцов биологического материала (ликвора) пациентов, поскольку тестирование этих образцов выполнялось вне эпидемического сезона. Вместе с тем продемонстрирована принципиальная возможность выявления добавленных к ликвору специфических фрагментов ДНК. Это подтверждает целесообразность разработки варианта диагностического теста «у постели пациента», который мог бы помочь своевременной дифференциальной диагностикой поражений центральной нервной системы.
Отдельный аспект перспективы использования данных тест-систем связан с регламентаций использования изделий медицинского назначения для диагностики инфекций. С одной стороны, выявление инфекционного агента у клеща формально не относится к диагностике заболевания человека и не требует получения регистрационного удостоверения Росздравнадзора, но, с другой стороны, результат этого теста влечет принятие конкретных клинических решений назначения и выбора варианта экстренной профилактики. Более того, организация лабораторной диагностики клещевых инфекций регламентирована требованиями СанПиН 3.3686—21, в соответствии с которыми данные тесты могут проводиться только в лабораториях, имеющих лицензию для работы с возбудителями III—IV групп патогенности. Понятно, что таких условий нет в большинстве пунктов оказания первой медицинской помощи укушенным клещом пациентам. Открытым остается вопрос о том, как организовать использование теста в качестве самотестирования вне медицинских учреждений, можно ли распространить такую же практику, которая используется при домашнем экспресс-тестировании на грипп, COVID-19 и др. инфекций.
В целом наш опыт свидетельствует о возможности использования LAMP для внелабораторного выявления возбудителей бактериальных и вирусных клещевых инфекций с целью обоснованного выбора варианта экстренной профилактики.
Выводы
1. Разработаны наборы реагентов: NT MxLAMP BOR+MIY для одновременной детекции возбудителей клещевых боррелиозов B. burgdorferi s.l., B. miyamotoi и NT LAMP TBEV1 для выявления вируса клещевого энцефалита (Tick-borne encephalitis virus) в изотермической реакции.
2. Предел аналитической чувствительности, оцениваемый по стандартным ДНК-плазмидам, составляет для набора NT MxLAMP BOR+MIY к B. burgdorferi s.l., 46 копий/мкл, к B. miyamotoi — 361 копии/мкл; для набора NT LAMP TBEV1 к вирусу клещевого энцефалита — 36 копий/мкл.
3. При сравнительных испытаниях с коммерческими тест-системами для ПЦР на 178 пробах клещей чувствительность набора NT MxLAMP BOR19+MIY1 составила 78% (95% ДИ 68—86%), специфичность 100% (95% ДИ 96—100%).
4. Из 325 образцов в реакции LAMP с набором NT LAMP TBEV1» было выявлено 4 положительные пробы и все результаты совпали с результатами коммерческих наборов ПЦР. В итоге чувствительность набора составила 100% (95% ДИ 40—100%), специфичность 100% (95% ДИ 99—100%).
5. Продемонстрирована возможность выявления специфических для возбудителей исследуемых клещевых инфекций фрагментов ДНК в контаминированных ими образцах спинномозговой жидкости пациентов.
Финансирование. Работа была поддержана грантом Федерации лабораторной медицины, а также программой «Старт-1» Фонда содействия инновациям, проект «Разработка набора реагентов для экспресс-диагностики клещевых инфекций на основе изотермической амплификации».
Благодарности. Авторы выражают благодарность д.б.н. Александру Евгеньевичу Платонову, главному научному сотруднику Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии Роспотребнадзора, за ценные советы и образцы ДНК Borrelia miyamotoi и д.м.н. Светлане Анатольевне Рудаковой, заведующей отделом природно-очаговых бактериальных зоонозов ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора за проведение апробации набора NT MxLAMP BOR+MIY.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.