Необходимым условием обеспечения качества клинических лабораторных исследований является верификация в лаборатории заявленных изготовителем функциональных характеристик используемых аналитических методов перед введением в повседневное использование [3, 4]. Полученные подтверждающие результаты предоставляют объективные доказательства компетентности лаборатории в проводимых исследованиях и аналитической надежности выдаваемых ею результатов для заказчиков, аккредитующих и регулирующих органов. Аналитическая надежность результатов лабораторных исследований зависит от свойств применяемых методик исследований, свойств применяемых для выполнения методик оборудования и реагентов, профессиональной квалификации и четкого выполнения процедур исследования и указаний изготовителей средств лабораторного анализа [4]. Целевым параметром аналитической надежности клинических лабораторных исследований является их способность достоверно разграничивать свойственные состояниям здоровья и патологии значения содержания определенных аналитов в составе биоматериалов [5].
В зависимости от качественного или количественного формата аналитической методики выбирается соответствующий перечень верифицируемых параметров [6], который может включать для количественных методов прецизионность, правильность, сопоставимость методик, аналитическую чувствительность, аналитическую специфичность, линейность, неопределенность измерения, референтные интервалы; для качественных методов диагностическую чувствительность и диагностическую специфичность, сопоставимость методик, порогового значения и в определенных случаях прецизионности [6]. Перед началом использования методики, которая выполняется с применением тест-системы, документально охарактеризованной изготовителем и подтвержденной при регистрации в уполномоченном органе, лаборатория обязана экспериментально подтвердить соответствие характеристик выполнения с характеристиками, заявленными изготовителем [4].
Таким образом, лаборатории необходимо провести верификацию ряда параметров, выбираемых в зависимости от формата аналитической методики. Один из основных параметров, требующих верификации, — аналитическая надежность исследований. Согласно национальному стандарту ГОСТ Р 53022.2—2008 [5], аналитическая надежность клинических лабораторных исследований характеризуется свойствами методов, которыми они выполняются:
а) для количественных методов:
— точностью (правильностью и прецизионностью) измерений,
— аналитической чувствительностью,
— аналитической специфичностью;
б) для неколичественных (качественных) методов исследования — частотой совпадения обнаружения патологических отклонений изучаемого компонента биоматериала с объективно подтвержденным наличием соответствующего заболевания.
Тест-системы для иммуноферментного выявления HBsAg, предназначенные для массового скрининга образцов донорской крови и крови пациентов, относятся к качественным тестам. Для верификации в клинической лаборатории качественных и полуколичественных методов, в которых результат («положительный» или «отрицательный» статус образца) получен на основе количественного значения (такого как оптическая плотность (ОП) или вычисленного на ее основе коэффициента позитивности) и характеристики прецизионности теста указаны в инструкции по применению или были опубликованы ранее в литературе, необходимо проводить верификацию прецизионности по количественным данным [6, 7]. На первом этапе оценки работы аналитической тест-системы в условиях лаборатории для верификации прецизионности методики нами был выбран простой и удобный протокол стандарта EP15-A3 Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) [1], обеспечивающий надежный способ получения данных.
Цель работы — верификация прецизионности иммуноферментного выявления HBsAg в наборах реагентов «Вектогеп B — HBs-антиген» по стандарту CLSI EP15-A3.
Материал и методы
Для верификации параметров прецизионности иммуноферментного выявления HBsAg в наборе реагентов «Вектогеп B — HBs-антиген» (АО «Вектор-Бест», Россия) использовали два коммерческих контрольных материала (КМ) МИНИпол (минимальный положительный контрольный образец — инактивированная сыворотка крови человека, содержащая HBsAg) и ВЛК-HBsAg (внутрилабораторный контроль — инактивированная сыворотка крови человека, содержащая HBsAg) производства АО «Вектор-Бест» (Россия), а также три нативные сыворотки крови человека с различной концентрацией HBsAg (образцы №1—3).
Иммунологическую стадию ИФА проводили при температуре 44°C в течение 1 часа в термошейкере ST-3L (Elmi, Латвия) при 500 об/мин, стадию отмывки — на вошере Wellwash (Thermo Scientific, США), ферментативную стадию — при комнатной температуре (23—24 °C) в темноте в течение 25 мин. Используемая процедура анализа, согласно инструкции производителя, обеспечивает предел обнаружения HBsAg, равный 0,05 МЕ/мл. Результаты ИФА регистрировали с помощью ридера Multiskan GO (Thermo Scientific, США), измеряя оптическую плотность (ОП) при длине волны 450 нм.
Оценка аналитической надежности исследований
Для контроля аналитической надежности исследований использовали образцы КМ ОДС (отрицательная донорская сыворотка — инактивированная сыворотка крови человека, не содержащая маркеры гепатита В (HBsAg, анти-HBs), гепатита C (анти-ВГС), ВИЧ-инфекции (анти-ВИЧ-1, 2, р24-антиген ВИЧ-1), сифилиса (анти-T.pallidum)) (АО «Вектор-Бест», Россия) и МИНИпол (АО «Вектор-Бест», Россия), к которым, согласно инструкции, предъявляются следующие требования: результат образца ОДС должен быть отрицательным, образца МИНИпол — положительным [8, 9]. Таким образом, КМ МИНИпол, с одной стороны, был использован как маркер аналитической надежности при проведении исследования в лаборатории, с другой стороны, — являлся одним из контрольных образцов для верификации параметров прецизионности набора реагентов «Вектогеп B — HBs-антиген».
Оценка повторяемости и внутрилабораторной прецизионности
Каждый образец КМ или нативной сыворотки был исследован в 5 повторах в одной аналитической серии (постановке) в течение 5 дней (далее упоминается как схема 5×5). Результаты повторяемости и внутрилабораторной прецизионности оценивали только после выполнения условий валидности набора реагентов согласно инструкции по применению (удовлетворительные значения ОП отрицательного, положительного и слабоположительного контролей, входящих в состав набора реагентов) и проверки аналитической надежности (отрицательный результат для образца ОДС, положительный результат для образца МИНИпол).
Расчеты проводили для выборки коэффициентов позитивности (Кпоз), вычисленных как отношение ОП образца к установленному значению критической ОП (ОПкрит). Проверку данных на наличие выбросов проводили с использованием критерия Граббса для N=25 [10], вычисляли верхнюю (Кпозср+3,135×S) и нижнюю (Кпозср -3,135×S) критические границы, где N — общее количество полученных значений Кпоз для образца, Кпозср — расчетное среднее значение Кпоз образца, S — стандартное отклонение значений Кпоз.
После формирования итоговой группы данных из 25 расчетных значений Кпоз для каждого из исследуемых образцов оценивали повторяемость и внутрилабораторную прецизионность по методике, описанной в п. 2.3.5 стандарта [1], в основе которой лежит односторонний дисперсионный анализ (ANOVA).
Повторяемость характеризовали стандартным отклонением повторяемости (SR) и коэффициентом вариации повторяемости (CVR); внутрилабораторную прецизионность — стандартным отклонением (SWL) и коэффициентом вариации (CVWL).
Верификация параметров прецизионности заявленным требованиям изготовителя
Полученные значения параметров повторяемости и внутрилабораторной прецизионности необходимо проверить на соответствие требованиям, заявленным изготовителем. Для этого сначала необходимо определить, какими должны быть соответствующие требования для образцов, использованных в исследовании по верификации. Согласно стандарту, в случае, когда величины Кпоз (для количественных методик — концентрации образцов) отличаются от предоставленных изготовителем, необходимо воспользоваться параметрами прецизионности для образцов, наиболее близких по значениям Кпоз (или концентраций) к используемым. В нашем исследовании мы проводили сравнение с параметрами прецизионности, заявленными ранее изготовителем (табл. 1) [2]. Если оценка пользователя превышает требование производителя, необходимо реализовать вторую часть проверки согласованности и сравнить оценку с соответствующим значением верхнего предела верификации (UVL, upper verification limit) для этого требования, который представляет собой верхний 95-й процентиль, ожидаемый для оценок неточности, полученных в эксперименте изготовителя, аналогичном по размеру и дизайну (в данном случае по схеме 5×5). Вычисление значения UVL проводили по методике, описанной в разделе 2.3.6.2 стандарта [1].
Таблица 1. Параметры прецизионности, заявленные изготовителем набора реагентов «Вектогеп B — HBs-антиген» по данным исследования 4-х положительных образцов, проведенного по схеме 3×5×5 [2]
| Образец | Кпоз ср | Повторяемость (R) | Внутрилабораторная прецизионность (WL) | ||||
| SR | CVR, % | 95% ДИ CVR, % | SWL | CVWL, % | 95% ДИ CVWL, % | ||
| МИНИпол | 2,7 | 0,16 | 5,7 | 4,9—7,0 | 0,19 | 6,8 | 5,7—8,5 |
| ВЛК-HBsAg | 12,9 | 0,58 | 4,5 | 3,8—5,5 | 0,79 | 6,1 | 4,9—8,0 |
| Пол №1 | 3,3 | 0,24 | 7,4 | 6,3—9,0 | 0,24 | 7,4 | 6,3—8,8 |
| Пол №2 | 19,3 | 0,79 | 4,1 | 3,5—5,0 | 1,68 | 8,7 | 6,6—13,0 |
Оценка повторяемости (CVR) пользователя согласуется (верификация «проходит») с заявкой производителя, если оценка пользователя меньше или равна установленным параметрам изготовителя или соответствующей величины UVL. Этот же подход применяется для оценки внутрилабораторной прецизионности (CVWL).
Результаты и обсуждение
Подтверждение аналитической надежности исследований
Исследования по оценке прецизионности набора реагентов были проведены под контролем коммерческих КМ МИНИпол и ОДС. Во всех аналитических сериях положительный образец МИНИпол с минимальным содержанием серологического маркера HBsAg был выявлен как положительный, а отрицательный образец ОДС был определен как отрицательный, то есть данные КМ соответствовали предъявляемым к ним требованиям, обеспечивая таким образом аналитическую надежность исследований [8, 9].
Оценка повторяемости, внутрилабораторной прецизионности. Верификация прецизионности заявленным параметрам изготовителя
Для визуального контроля полученных значений использовали точечные диаграммы исходных выборок данных вычисленных Кпоз для каждого из контрольных образцов с обозначенными расчетными критическими границами по критерию Граббса (рисунок, на примере МИНИпол).
Результат исследования положительного образца МИНИпол в наборе реагентов «Вектогеп B — HBs-антиген» для верификации прецизионности по протоколу EP15-A3 по схеме 5×5.
Согласно регламенту, возможно не более одного выброса для данного образца или не более двух во всем исследовании. Если результат рассматривается как статистический выброс, требуется провести анализ данных выборки дважды: до и после исключения результата. Если в исходной выборке данных выявлен статистический выброс с вероятностью p менее 0,05, при этом не оказывающий влияния на результаты оценки, возможно сохранение исходной выборки данных без исключения выпадающего значения.
Проверка данных выборок Кпоз пяти контрольных образцов с использованием теста Граббса выявила одно выпадающее значение в выборке МИНИпол и одно выпадающее значение для Обр. №1. Для данных образцов все расчеты были проведены дважды: для всех данных выборки и после исключения потенциального выброса.
Расчеты для верификации показателей повторяемости и внутрилабораторной прецизионности, проведенные на основе Кпоз образцов по регламенту CLSI EP15-A3 с использованием заявленных характеристик изготовителя набора реагентов [2], представлены в табл. 2 и 3 соответственно. Для верификации показателей КМ МИНИпол и ВЛК-HBsAg были использованы параметры изготовителя КМ соответственно. Результаты нативных сывороток Обр. №1, Обр. №2, Обр. №3 сравнивали с результатами нативных сывороток пол№1 и пол№2 изготовителя, имеющих величины Кпоз, наиболее близкие к анализируемым.
Таблица 2. Оценка повторяемости: расчетные значения CVR для исследуемых образцов, заявленные изготовителем значения CVR и расчетные значения верхнего предела верификации (UVL) для CVR
| Наименование образца | Кпозср | CVR, % | Требование изготовителя набора реагентов к CVR, % | Верхний предел верификации (UVL) для CVR, % | Статус верификации |
| МИНИпол* | 2,7 | — | 5,7 | 7,6 | — |
| ВЛК* | 12,9 | — | 4,5 | 6,0 | — |
| Пол №1* | 3,3 | — | 7,4 | 9,9 | — |
| Пол №2* | 19,3 | — | 4,1 | 5,5 | — |
| МИНИпол (есть выброс) | 1,34 | 10,6 | 5,7 | 7,6 | Не подтвержден |
| МИНИпол (без 1 точки) | 1,31 | 6,4 | 5,7 | 7,6 | Подтвержден |
| ВЛК | 6,98 | 5,7 | 4,5 | 6,0 | Подтвержден |
| Обр. №1 (есть выброс) | 1,80 | 3,4 | 7,4 | 9,9 | Подтвержден |
| Обр. №1 (без 1 точки) | 1,79 | 1,7 | 7,4 | 9,9 | Подтвержден |
| Обр. №2 | 2,98 | 2,9 | 7,4 | 9,9 | Подтвержден |
| Обр. №3 | 11,87 | 1,5 | 4,1 | 5,5 | Подтвержден |
Примечание. * — данные изготовителя набора реагентов «Вектогеп В — HBs-антиген» [2].
Таблица 3. Оценка внутрилабораторной прецизионности: расчетные значения CVWL для исследуемых образцов, заявленные изготовителем значения CVWL и расчетные значения верхнего предела верификации (UVL) для CVWL
| Наименование образца | Кпозср | CVWL, % | Требование изготовителя набора реагентов к CVWL, % | Верхний предел верификации (UVL) для CVWL, % | Статус верификации |
| МИНИпол* | 2,7 | — | 6,8 | 9,6 | — |
| ВЛК* | 12,9 | — | 6,1 | 9,2 | — |
| Пол №1* | 3,3 | — | 7,4 | 9,9 | — |
| Пол №2* | 19,3 | — | 8,7 | 14,5 | — |
| МИНИпол (есть выброс) | 1,34 | 13,4 | 6,8 | 9,6 | Не подтвержден |
| МИНИпол (без 1 точки) | 1,31 | 8,6 | 6,8 | 9,6 | Подтвержден |
| ВЛК | 6,98 | 9,0 | 6,1 | 9,2 | Подтвержден |
| Обр. №1 (есть выброс) | 1,80 | 5,2 | 7,4 | 9,9 | Подтвержден |
| Обр. №1 (без 1 точки) | 1,79 | 3,7 | 7,4 | 9,9 | Подтвержден |
| Обр. №2 | 2,98 | 4,8 | 7,4 | 9,9 | Подтвержден |
| Обр. №3 | 11,87 | 4,1 | 8,7 | 14,5 | Подтвержден |
Примечание. * — данные изготовителя набора реагентов «Вектогеп В — HBs-антиген» [2].
При вычислениях CVR и CVWL для образца МИНИпол нами было исключено одно выпадающее значение; для Обр№1 значение не было исключено, так как практический результат его присутствия не влиял на результаты проверочного исследования. Таким образом, коэффициенты вариации повторяемости (CVR) положительных КМ МИНИпол, ВЛК-HBsAg и положительных сывороток Обр. №1-3 варьировали в интервале 1,5—6,4%, а внутрилабораторной прецизионности (CVWL) — от 4,1 до 9,0%.
Установлено, что для всех исследуемых образцов были получены результаты, не превышающие заявленные изготовителем показатели прецизионности или расчетные верхние верификационные пределы [2].
Заключение
Проведена верификация параметров повторяемости и внутрилабораторной прецизионности иммуноферментного выявления HBsAg с помощью набора реагентов «Вектогеп В — HBs-антиген» согласно стандарту CLSI EP15-A3:2014 в эксперименте с дизайном 5×5 с использованием пяти положительных образцов, содержащих HBsAg. Полученные в лаборатории показатели повторяемости и внутрилабораторной прецизионности удовлетворили требованиям, заявленным изготовителем набора реагентов. Таким образом, методика иммуноферментного выявления HBsAg в наборе реагентов «Вектогеп B — HBs-антиген» с пределом обнаружения 0,05 МЕ/мл, используемая в лаборатории для скрининга проб пациентов (сыворотки крови человека), была верифицирована по показателям прецизионности.
Следует отметить, что в рамках настоящей статьи в нашей лаборатории был проведен один из этапов верификации исследования на HBsAg, для общего заключения о приемлемости исследования необходимо провести верификацию и других показателей в соответствии с требованиями стандарта ГОСТ Р ИСО 15189—2015 [3].
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.