Световая трансмиссионная агрегатометрия (light transmission aggregometry — LTA) была независимо разработана в 1962 г. Гасом Борном [1] и О’Брайеном [2]. LTA исторически является «золотым стандартом» в оценке функциональной активности тромбоцитов. Она основана на обнаружении фотометром изменений светопропускания вследствие агрегации тромбоцитов после добавления агониста (индуктора) (арахидоновая кислота, коллаген, тромбоксан, АДФ, ристоцетин, эпинефрин и т.д.) в обогащенную тромбоцитами плазму [3]. Метод LTA достаточно сложный и трудоемкий. Отсутствие стандартизации и влияние множества факторов преаналитического и аналитического этапов на его проведение требуют опытного персонала лаборатории для интерпретации полученных результатов. Фирма Sysmex автоматизировала метод LTA с использованием специального программного обеспечения на аналитических системах Sysmex серии CS, что позволило улучшить подходы к стандартизации исследований, повысить качество и скорость выполнения анализа, снизить нагрузку на персонал лаборатории [4, 5]. Хотя технология, безусловно, выгодна с точки зрения трудоемкости, она по-прежнему требует значительного объема плазмы, богатой тромбоцитами (150 мкл на тест), хотя и меньше, чем традиционная агрегометрия (200—500 мкл на тест) [6]. Несмотря на это, автоматизированный способ выполнения LTA позволяет более легко генерировать кривые зависимости концентрации от реакции, чем при традиционной агрегатометрии. Интерпретация результатов LTA проводится по изменению параметров кривой агрегации [5].
Создание референтных интервалов (РИ) — это сложный и трудоемкий процесс, особенно для детей [7], так как требует набора достаточного числа здоровых лиц, сбора относительно больших объемов крови и понимания физиологических изменений в биомаркерах, связанных с нормальным ростом и развитием ребенка [8—10]. Одним из основных шагов в создании детских РИ является набор здоровых детей, представляющих когорту, которую обслуживает конкретная лаборатория [11]. В связи с трудоемкостью и экономическими ограничениями использования прямого подхода установления РИ в соответствии с международным стандартом CLSI C28-A3 [7] в настоящее время отдается предпочтение непрямому подходу к определению РИ той популяции, которую обслуживает лаборатория, на основании анализа результатов массива данных пациентов. Поэтому установление РИ для тестов агрегации тромбоцитов у детей имеет важное значение для диагностики нарушений свертываемости крови.
Цель данного исследования — определение РИ у детей для панели агонистов (АДФ, коллаген, ристомицин) на аналитической системе Sysmex CS-5100 в автоматическом режиме.
Материал и методы
Для установления РИ применялся непрямой метод определения в соответствии с международным документом Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) CLSI C28-A3 [7]. Результаты пациентов в возрасте от 1 года до 18 лет получены из лабораторной информационной системы «Акросс — Клиническая Лаборатория» на платформе «1С: Предприятие» за период с 01.04.21 по 01.04.23 для каждого агониста и разделены по полу. В исследование включены 3067 записей, из них 1635 мужских и 1432 женских. Для агониста АДФ 2 мкмоль/л получено 3066 записей, АДФ 10 мкмоль/л — 3067 записей, коллагена — 3066 записей, ристоцетина — 3066 записей. Единственным критерием включения были результаты пациентов, проходивших однократное исследование агрегации тромбоцитов.
В рамках стандартной практики работы с пациентами, проходящими обследование системы гемостаза в СПб ГБУЗ «Консультативно-диагностический центр для детей» (КДЦД), использовалась венозная кровь, взятая в вакуумные системы фирмы Sarstedt с цитратом натрия 3,2% объемом 3 мл с применением иглы 21G в условиях минимального венозного застоя. Все образцы дважды центрифугировали: для получения богатой тромбоцитами плазмы — 10 мин при 200 g; для получения бедной тромбоцитами плазмы — 15 мин при 1500 g [12]. Для оценки агрегационной способности тромбоцитов проведены следующие тесты:
— агрегация тромбоцитов с коллагеном в концентрации 1 мкг/мл — «Ревохем Коллаген» (Revohem Collagen) (HYPHEN BioMed, Франция);
— агрегация тромбоцитов с АДФ в концентрации 10 мкмоль/л — «Ревохем АДФ» (Revohem ADP) (HYPHEN BioMed, Франция);
— агрегация тромбоцитов с АДФ в концентрации 2 мкмоль/л — «Ревохем АДФ» (Revohem ADP) (HYPHEN BioMed, Франция);
— агрегация тромбоцитов с ристоцетином в концентрации 1 мг/мл — «Ревохем Ристоцетин» (Revohem Ristocetin) (HYPHEN BioMed, Франция).
Концентрации индукторов агрегации, примененных в исследовании, были выбраны как начальные в соответствии с рекомендациями Международного общества по тромбозу и гемостазу (ISTH). Регистрация агрегации на приборе проводилась в течение 6 мин, скорость перемешивания бестромбоцитарной плазмы (БТП) составила 800 об/мин. Исследование агрегации проводилось в течение 2 ч от момента взятия крови из вены в утренние часы.
Статистический анализ данных
Проведен анализ результатов исследований, полученных на анализаторе Sysmex CS-5100. Расчет границ РИ параметров агрегатограммы производился с помощью непрямого метода с использованием алгоритма TMC [13]. Такой подход позволяет вычленить результаты исследований агрегаторамм условно здоровых людей от больных из совокупного распределения всех измерений базы данных. В дальнейшем рассчитывались границы РИ с 90% ДИ.
Результаты и обсуждение
В КДЦД исследование агрегационной способности тромбоцитов проводится в первую очередь с целью оценки тромбоцитарного гемостаза у детей с 1 года до 18 лет. Используя литературные данные, категоризацию по возрастам не проводили по причине отсутствия выраженных различий показателей сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у детей от 1 года до 18 лет [14—16]. Установлены РИ для следующих параметров кривой агрегации при добавлении агонистов: латентный период (Lag-фаза) (с), наклон (%/с), максимальный процент агрегации (%), конечная точка агрегации (%) (табл. 1—4).
Таблица 1. Референтный интервал для агониста АДФ в концентрации 2 мкмоль/л
| Показатель [2,5—97,5 % ДИ] | Референтный интервал (2,5—97,5 %) | ||
| пол: женский | пол: мужской | общие (мужчины и женщины) | |
| Lag-фаза, с | 12,5 [12,2—12,9] — 25,1 [24,4—25,7] | 12,8 [12,5—13,1] — 26,4 [25,8—27,1] | 12,7 [12,4—12,9] — 25,8[25,3—26,2] |
| Наклон | 122,9 [121—124,8] — 164,5 [162,6—166,4] | 88,8 [85,4—92,2] — 169 [165,6—172,4] | 114,3 [112,7—115,9] — 165,8 [164,2—167,4] |
| Максимальный процент агрегации, % | 78,7 [78,1—79,3] — 92,1 [91,6—92,8] | 75,3 [74,6—76,0] — 92,3 [91,6—93] | 77,5 [77,1—78] — 92,1 [91,7—92,6] |
| Конечная точка агрегации, % | 66,7 [65,9—67,5] — 85,2 [84,4—86,1] | 65,1 [64,3—66] — 84,9[84—85,7] | 66 [65,5—66,6] — 85 [84,4—85,6] |
Таблица 2. Референтный интервал для агониста АДФ в концентрации 10 мкмоль/л
| Показатель [2,5—97,5 % ДИ] | Референтный интервал (2,5—97,5 %) | ||
| пол: женский | пол: мужской | общие (мужчины и женщины) | |
| Lag-фаза, с | 11,27 [10,98—1156] — 22,37 [21,8—22,95] | 11,58 [11,31—11,84] — 22,03 [21,53—22,54] | 11,44 [11,24—11,63] — 22,19 [21,81—22,57] |
| Наклон | 137,67 [136,48—138,86] — 168,27 [167,08—169,46] | 138,22 [137,18—139,26] — 165,32 [164,28—166,36] | 137,85 [137,07—138,64] — 166,79 [166—167,57] |
| Максимальный процент агрегации, % | 80,25 [79,74—80,7] — 93,35 [92,84—93,8] | 77,59 [76,96—78,22] — 92,66 [92,03—93,2] | 79,09 [78,67—79,51] — 92,75 [92,33—93,1] |
| Конечная точка агрегации, % | 69,32 [68,61—70,03] — 87,04 [86,33—87,75] | 69,19 [68,45—69,90] — 86,32 [85,61—87,03] | 69,85 [69,34—70,35] — 86,54 [86,03—87,04] |
Таблица 3. Референтный интервал для агониста коллагена в концентрации 1 мкг/мл
| Показатель [2,5—97,5 % ДИ] | Референтный интервал (2,5—97,5 %) | ||
| пол: женский | пол: мужской | общие (мужчины и женщины) | |
| Lag-фаза, с | 44,3 [43,4—45,3] — 73 [71,4—74,6] | 44,1 [43,2—45,1] — 78,3 [76,6—79,9] | 44 [43,7—45,1] — 73,56 [72,4—74,7] |
| Наклон | 98,3 [96,7—100] — 134,2 [132,7—135,8] | 94,5 [93—96] — 134 [132,5—135,5] | 96,5 [95,3—97,6] — 133,9 [132,7—135] |
| Максимальный процент агрегации, % | 81,6 [81,1—82] — 92,3 [91,8—92,8] | 80,4 [80—80,9] — 91,9 [91,4—92,3] | 81,05 [80,7—81,4] — 92,1 [91,8—92,4] |
| Конечная точка агрегации, % | 67,5 [66,8—68,2] — 86 [85,3—86,7] | 68 [67,4—68,7] — 84,9 [84,3—85,6] | 68,8 [69,3—85,5] — 85 [84,5—85,5] |
Таблица 4. Референтный интервал для агониста ристоцетина в концентрации 2 мг/мл
| Показатель [2,5—97,5 % ДИ] | Референтный интервал (2,5—97,5 %) | ||
| пол: женский | пол: мужской | общие (мужчины и женщины) | |
| Lag-фаза, с | 27,19 [26,16—28,23] — 69,3 [66,7—71,97] | 25,56 [24,39—26,73] — 79,3 [75,69—82,93] | 26,99 [26,18—27,8] — 71,48 [69,33—73,63] |
| Наклон | 62,3 [59,1—65,4] — 136,7 [133,6—139,9] | 62,3 [59,1—65,5] — 137,2 [134—140,4] | 64,6 [62,4—66,8] — 136,5 [134,3—138,7] |
| Максимальный процент агрегации, % | 80,3 [79,8—80,8] — 93,2 [92,7—93,7] | 78,8 [78,2—79,4] — 93,2 [92,6—93,8] | 79,9 [79,6—80,3] — 93,2 [92,9—93,6] |
| Конечная точка агрегации, % | 76,3 [75,74—76,96] — 90,47 [89,87—91,08] | 75,93 [75,33—76,53] — 90,62 [90,02—91,22] | 76,19 [75,77—76,61] — 90,52 [90,1—90,95] |
При воздействии индукторов агрегации происходит изменение формы тромбоцитов с образованием псевдоподий и выбросом содержимого гранул во внеклеточное пространство с последующей их агрегацией [17]. Степень агрегации зависит от вида и дозы используемого индуктора. При низкой концентрации агониста и малой его силе происходит высвобождение плотных гранул, в то время как сильные агонисты вызывают выброс биологически активных веществ из α-гранул. Латентный период (Lag-фаза) представляет собой время с момента добавления агониста до начала агрегации тромбоцитов (подъема кривой агрегации); наклон характеризует начальную скорость агрегации (т.е. интенсивность ответа тромбоцитов на активацию индуктором); максимальный процент агрегации позволяет оценить максимальную степень агрегации в ходе проведения исследования; конечная точка агрегации — максимальный процент агрегации, характеризующий степень агрегации и дезагрегации тромбоцитов в конце проведения исследования.
При использовании АДФ в качестве индуктора агрегация тромбоцитов носит двухфазный характер и зависит от концентрации АДФ. При воздействии малых доз АДФ (2 мкмоль/л) формируется первая фаза (первичная волна) — за счет того, что АДФ связывается со своим рецептором P2Y12 на поверхности тромбоцита, что влечет за собой изменение формы клетки. Первая фаза агрегации является обратимой, поскольку агрегаты рыхлые и с течением времени распадаются. РИ для максимальной агрегации тромбоцитов для АДФ 2 мкмоль/л составил 77,5—92,1%, дезагрегация в конечной точке отмечается от 65,5%, латентный период — 12,7—25,8 с.
При добавлении АДФ в более высокой концентрации (10 мкмоль/л) происходит высвобождение АДФ из гранул хранения тромбоцитов, что характеризуется необратимой агрегацией и слиянием первичной и вторичной волн. РИ для максимальной агрегации тромбоцитов для АДФ 10 мкмоль/л составил 79,09—92,75%, дезагрегация в конечной точке отмечается от 69,34%, латентный период — 11,44—22,19 с.
Необходимо обратить внимание на то, что врач клинической лабораторной диагностики помимо сравнения полученных результатов с РИ должен давать описание кривых агрегатограммы. Так, при добавлении АДФ в концентрации 2 мкмоль/л появление двухволновой агрегации указывает на повышение чувствительности тромбоцитов, а появление одноволновой (неполной) агрегации при использовании АДФ в более высокой концентрации (10 мкмоль/л) указывает на нарушение высвобождения из гранул хранения тромбоцитов.
Агрегация тромбоцитов с использованием индуктора коллагена дает выраженный латентный период — от нескольких секунд до нескольких минут. За счет связывания коллагена с рецепторами тромбоцитов высвобождается содержимое гранул, пула тромбоксана А2, что сопровождается усилением межтромбоцитарного взаимодействия с формированием монофазной кривой. РИ для максимальной агрегации тромбоцитов с использованием коллагена в концентрации 2 мг/л составил 81,05—92,1%, процент агрегации тромбоцитов в конечной точке — 68,8—85%, дезагрегация не выявлена, латентный период после добавления агониста составил 44—73,56 с.
Индуктор ристоцетин представляет собой антибиотик, который стимулирует агглютинацию тромбоцитов через взаимодействие фактора Виллебранда с комплексом GPIb-IX-V. Данное исследование позволяет предположить болезнь Виллебранда вследствие нарушения агрегации с ристоцетином при нормальном ответе на воздействие АДФ коллагена. РИ для максимальной агрегации тромбоцитов с использованием ристоцетина в концентрации 2 мг/л составил 79,9—93,2%, процент агрегации тромбоцитов в конечной точке — 76,19—90,52%, дезагрегация не определяется с данным индуктором, латентный период после добавления агониста составил 26,99—71,48 с.
Как известно, в инструкции к наборам реагентов производитель рекомендует установить собственные РИ для той популяции, которую обсуживает лаборатория. В соответствии с ГОСТ Р ИСО 15189-2015 [18] изменение аналитических или преаналитических процедур в лаборатории также влечет за собой пересмотр или валидацию используемых РИ. В нашем случае произошла смена аналитической системы для определения агрегации тромбоцитов (с ручного оптического метода на автоматизированный метод LTA). РИ, предложенные производителем новой аналитической системы для используемых индукторов агрегации тромбоцитов приведены в таблице 5. В начале своей работы, как и большинство лабораторий [16], мы использовали РИ фирмы-производителя, но они не нашли одобрения у детских врачей гематологов Центра в соответствии с той клинической картиной, которая наблюдалась у пациентов. В отечественной литературе представлены референтные значения анализа агрегации тромбоцитов в автоматическом режиме на анализаторе Sysmex CS-5100 для взрослых [5], поэтому перенос РИ не представлялся возможным. В силу того, что применение прямого метода установления РИ в лаборатории имело ряд существенных ограничений по причине экономических и организационных сложностей, было принято совместное решение с врачами клиницистами о наборе базы данных результатов пациентов с целью установления собственных РИ агрегации тромбоцитов у детей непрямым методом. Оценка кривой агрегации проводится врачом КЛД. Основные параметры графика в автоматическом режиме передаются в ЛИС с дополнительным описанием полученных результатов в случае необходимости.
Таблица ٥. Рекомендуемые производителем РИ агонистов для измерения агрегации тромбоцитов
| Показатель [2,5—97,5 % ДИ] | АДФ, 2 мкмоль/л | АДФ, 10 мкмоль/л | Коллаген, 1 мкг/мл | Ристоцитина, 1,2 мг/мл |
| Lag-фаза, с | 24 [18—45] | 24 [16—60] | 76 [41—100] | 33 [23—191] |
| Наклон | 105 [72—140] | 117 [45—158] | 122 [64—143] | 101 [37—130] |
| Максимальный процент агрегации, % | 82 [42—98] | 87 [48—106] | 88 [77—102] | 92 [78—99] |
| Конечная точка агрегации, ٪ | 73 [0—92] | 79 [25—97] | 80 [70—96] | 89 [70—98] |
Вывод
В выявлении тромбоцитопатий у детей ключевую роль играет проведение агрегации тромбоцитов с различными видами агонистов. Правильная интерпретация результатов лабораторных исследований зависит от установленного РИ в лаборатории в совокупности с клинической картиной предполагаемого заболевания у пациента. Ввиду разного состава агонистов и оборудования отсутствуют единые РИ. Поэтому в соответствии с международной и национальной практикой РИ должны быть разработаны или валидированы в каждой лаборатории.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.