Введение

Распространенность дефицита и недостаточности витамина D, по данным крупных популяционных исследований, в некоторых странах достигает 80% среди мужчин и женщин. Главная функция витамина D — регулирование гомеостаза кальция; другие биологические эффекты включают регулирование быстрой пролиферации и дифференцировки нескольких клеточных популяций, включая кератиноциты, эндотелиальные клетки, остеобласты и лимфоциты. В ходе экспериментов in vitro и in vivo было выявлено существенное влияние метаболитов витамина D на иммунногенез.

В настоящее время ведется активное накопление и анализ клинических данных о влиянии гиповитаминоза D на течение иммунозависимых заболеваний. Изучение методов профилактики заболеваемости и снижение тяжести течения инфекций различной этиологии, в том числе с использованием витамина D, представляется особенно актуальным в свете пандемии COVID-19. В связи с этим встают важные вопросы об оптимальных для клинической практики методах лабораторной диагностики и контроля лечения дефицита и недостаточности витамина D, а также определении уровней 25(OH)D в сыворотке крови, достаточных для снижения восприимчивости к инфекциям.

Цель работы — на основании анализа отечественной и зарубежной литературы уточнить целевые уровни 25(OH)D, достаточные для профилактики и снижения тяжести течения инфекционных заболеваний различной этиологии, выявить оптимальный, с точки зрения практикующего врача, метод определения статуса витамина D и оценить доступность лабораторной диагностики недостаточности и дефицита витамина D в условиях российского мегаполиса.

Иммуномодулирующее действие витамина D

Основной циркулирующий предшественник активных молекул витамина D — это 25(OH)-витамин D (25-D). Биологически активная форма — 1,25 (OH)-витамин D (1,25-D) образуется под воздействием фермента 25-гидрокси-витамин-D-1-α-гидроксилазы (CYP27B1) в почках. Действие активного метаболита 1,25-D реализуется через цитоплазматические и мембранные рецепторы к витамину D (VDR) [1, 2]. Ранее считали, что роль витамина D ограничена в основном регуляцией кальциевого обмена, однако дальнейшее изучение показало его универсальность. Значение метаболитов витамина D в регуляции как врожденной, так и адаптивной иммунной системы была продемонстрирована целым рядом эффектов [3—14]:

— экспрессией VDR не только в эпителиальных клетках (ЭК) барьерных тканей и почечных канальцев и гепатоцитах, но и почти во всех клетках иммунной системы (КИС);

— широкой вне- и внутриклеточной экспрессией CYP27B1 при активации КИС, в частности моноцитами (МЦ), макрофагами (МФ), дендритными клетками (ДК). Активация этих клеток опосредована в основном через Toll-подобные рецепторы (TLR);

— антиген-презентирующие клетки (АПК) самостоятельно метаболизируют 25-D до активного 1,25-D, который модулирует эпигеном иммунных клеток, особенно моноцитов, во время встречи с антигеном и дифференцировки врожденной иммунной системы;

— стимуляция МФ человека через активацию TLR1/TLR2/TLR4 приводит к индукции экспрессии VDR и CYP27B1 и усиленной эндогенной продукции 1,25-D из циркулирующего 25-D, причем степень индукции экспрессии VDR зависит от уровня 25-D в сыворотке (дозозависимый эффект);

— обработка МЦ и МФ человека 1,25-D ингибирует синтез TLR2/TLR4 в зависимости от экспозиции и дозы 1,25-D, что блокирует опосредованные T-хелперами 1-го типа (Th1) воспалительные и аутоиммунные реакции и уменьшает возможность проникновения патогена в клетку. В ЭК, напротив, 1,25-D увеличивает экспрессию TLR2 и усиливает передачу сигналов витамина D за счет индуцирования экспрессии VDR и CYP27B (петля положительной обратной связи). Большое количество TLR позволяет связать больше патогенов на этапе первичного проникновения антигена;

— 1,25-D играет прямую противомикробную роль за счет индукции в МЦ, МФ и нейтрофилах антимикробных пептидов (АМП) кателицидина и дифензинов;

— 1,25-D регулирует экспрессию цитокинов, усиливая синтез хемокинов/цитокинов, дозозависимо снижая уровень некоторых провоспалительных и увеличивая экспрессию противовоспалительных цитокинов;

— 1,25-D модулирует толерогенные ДК в сторону менее зрелого и более толерогенного фенотипа с пониженной экспрессией главного комплекса гистосовместимости II типа, костимулирующих молекул CD80 и CD86, молекул адгезии CD54;

— высокие уровни 1,25-D увеличивают количество и/или функцию циркулирующих CD4+CD25+T-клеток (T-reg) за счет индукции клонспецифического фактора транскрипции FOXP3 (противовоспалительная поляризация лимфоцитов). T-reg контролируют алло- и аутоиммунные T-клеточные ответы путем синтеза противовоспалительных цитокинов (IL-10, трансформирующего фактор роста-β (TGF-β)) и высвобождения гранзимов и перфоринов. Через экспрессию ингибирующих корецепторов, таких как CTLA-4, T-reg предотвращают презентацию антигена и инициацию воспалительного ответа.

Таким образом, существуют неоспоримые доказательства значимого и дозозависимого иммуномодулирующего, в основном противовоспалительного, влияния метаболитов витамина D.

Роль витамина D в развитии инфекционных и инфекционно-воспалительных заболеваний

Введение 1,25-D при использовании животных моделей болезней человека успешно лечит ряд состояний, включая аутоиммунный ретинит, острый колит, диабет, артрит, экспериментальный аллергический энцефалит, астму. Модели на грызунах показали корреляцию между терапевтической эффективностью, повышенным количеством T-reg и экспрессией противовоспалительных цитокинов IL-10, TGF-β и CTLA-4. Однако клинические исследования на людях продемонстрировали гораздо менее убедительные изменения в количестве и функциях T-reg по сравнению с экспериментальными моделями [2, 13]. Это может быть связано с рядом факторов:

— недостаточными дозами и/или продолжительностью лечения;

— генетическими факторами (полиморфизмом) и/или разнообразием факторов окружающей среды в человеческой популяции;

— различиями методик измерения количества и местоположения T-reg;

— используемыми препаратами витамина D. В исследованиях на животных применяли активный метаболит — 1,25-D. В исследованиях на людях использовали колекальциферол, активация которого требует сложного пути с участием гидроксилаз печени и почек, а их экспрессия и активность может варьировать у разных субъектов или систематически снижаться после приема D₃.

Эпидемиологические данные связывают дефицит витамина D с повышенным риском инфекционно-воспалительных заболеваний: острых инфекций дыхательных путей, туберкулеза легких, воспалительных заболеваний кишечника. Была продемонстрирована связь между низким уровнем 25-D и неблагоприятными исходами (как по заболеваемости, так и по смертности) при тяжелом течении инфекционных и иммуноопосредованных заболеваний. Возможно, в некоторых случаях низкий уровень 25-D является маркером или даже следствием, а не причиной болезни [15—22].

Герпес-вирусная инфекция. Описано воздействие антимикробных пептидов, связанных с витамином D, на герпесвирусы. Например, кателицидин снижал уровень титра вируса герпеса 1-го типа у пациентов с кератоконъюнктивитом. У пациентов с хронической болезнью почек риск реактивации опоясывающего герпеса был значительно ниже у получавших добавки витамина D, а риск инфицирования был ниже у субъектов с более высоким или нормальным уровнем витамина D в сыворотке крови [23].

ВИЧ-инфекция. У ВИЧ-инфицированных пациентов распространенность дефицита витамина D колеблется от 70 до 85% [14, 24]. Низкие уровни витамина D связали с повышением риска клинического прогрессирования до синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) и смертности от всех причин. Хроническое воспаление и активация иммунной системы, характерные для ВИЧ-инфекции, усугублялись у пациентов с дефицитом витамина D, что приводило к повышению уровней IL-6 и TNF-α, активации МЦ, нарушению активности 1α-гидроксилазы почек. В то же время в когортном исследовании на людях добавление витамина D не влияло на смертность, количество клеток CD4 или вирусную нагрузку. Высокие уровни витамина D и его рецептора могут быть связаны с естественной устойчивостью к инфекции ВИЧ-1 [25, 26]. В слизистой оболочке серонегативных людей, подвергшихся воздействию ВИЧ-1, были повышены экспрессия ИЛ-10 и индукция дефензинов. Экспрессия VDR положительно коррелировала с экспрессией элафина, кателицидина и других белков, связанных с естественной устойчивостью к ВИЧ-1. Витамин D, запускающий аутофагию в МФ, ингибирует репликацию ВИЧ-1 в зависимости от дозы. Однако есть и другие исследования с противоречивыми результатами, в которых было обнаружено, что витамин D увеличивает репликацию ВИЧ в моноцитах как у пациентов, так и у клонов клеточных линий [14, 26, 27].

Вирус гепатита C. У пациентов, инфицированных вирусом гепатита C, уровни витамина D в сыворотке крови были обратно пропорциональны степени воспаления печени и стадии фиброза. В то же время при метаанализе клинических испытаний не было обнаружено защитного эффекта от приема витамина D [14, 27, 28].

Вирус гриппа. Наиболее важным в противовирусном действии является стимулированное 1,25-D производство АМП: дефенсинов и кателицидина [2, 4, 8, 29]. Уровень кателицидина зависел от сывороточного уровня 25-D: для оптимальной индукции мРНК кателицидина необходим уровень не менее 30 нг/мл, а более высокий уровень 40 нг/мл не был более эффективным.

Коронавирусная инфекция. Одним из факторов тяжелого течения инфекции COVID-19 считают дефицит витамина D. Несколько исследований демонстрируют влияние дефицита витамина D на течение заболевания. Гиповитаминоз D выявили у 81% (n=42) пациентов с COVID-19-ассоциированной острой дыхательной недостаточностью. После 10 дней госпитализации у пациентов с тяжелым дефицитом витамина D вероятность смерти составляла 50%. У пациентов с уровнем 25-D >10 нг/мл риск смертности составлял 5% (p=0,019) [30]. В немецком исследовании у 22% (n=185) пациентов с диагнозом COVID-19 выявлен дефицит витамина D (25-D в сыворотке <12 нг/мл). Дефицит витамина D был связан с более высоким риском искусственной вентиляции легких/смерти (соответственно 6,1/14,7 p<0,001) [31]. В США в марте—июне 2020 г. обследовали 191 779 пациентов (средний возраст 54 года; 68% женщин) из 50 штатов. Позитивный тест на SARS-CoV-2 показал сильную обратную связь с уровнями 25-D, которая сохранялась вне зависимости от широты, расовой/этнической/половой принадлежности и возраста пациентов [32]. В 20 европейских странах отмечали выраженную обратную зависимость между средними концентрациями 25-D в сыворотке и количеством случаев COVID-19/смертностью. Тяжесть дефицита D связана с прогнозом заболевания: уровень смертности в исследовании с участием 780 пациентов с COVID-19 был увеличен в 7,6 раза в когорте людей с уровнем 25-D <75 нмоль/л (средний возраст 46,6 года) (p<0,001) и в 10,1 раза при уровне 25-D <50 нмоль/л (средний возраст 66,9 года) (p<0,001) [33]. Другое обсервационное исследование с участием 212 пациентов показало, что для каждого увеличения стандартного отклонения уровня 25-D в сыворотке вероятность легкого течения COVID-19 по сравнению с тяжелым течением заболевания увеличивалась в 7,9 раз (p<0,001), а по сравнению с критическим — в 19,6 раза (p<0,001) [34].

Витамин D снижает риск инфекций дыхательных путей за счет трех основных механизмов: поддержания плотных контактов между ЭК, уничтожения вирусов путем стимуляции противовирусных механизмов и снижения синтеза провоспалительных цитокинов за счет модуляции иммунной системы, что предотвращает развитие пневмоний и пневмонитов [29, 35]. В то же время существует значительное количество работ с экспериментами in vitro и in vivo, а также результатов исследований на людях, которые свидетельствуют об отсутствии влияния витамина D на профилактику и лечение острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) или даже об ухудшении течения инфекции [29].

Профилактика перинатальных инфекций

Некоторые исследования продемонстрировали связь уровня 25-D в крови матери и частоты инфекций у матери и ребенка. Так, концентрация 25-D в крови у матери обратно коррелировала с количеством всех инфекций новорожденных (p=0,033), инфекций глаз, ушей, носа и горла (p=0,043), кожных инфекций (p=0,021) в первые 6 месяцев жизни [36]. В китайском исследовании 2015—2016 гг. принимали участие 2648 женщин с беременностью высокого риска. В группе женщин с признаками воспалительных изменений плаценты (децидуит, виллит, хориоамнионит, фунизит) была повышена частота неблагоприятных неонатальных исходов, включая сепсис и внутриутробную инфекцию плода (2,4% против 0,5%; 15,6% против 5,7%, p<0,001) [37]. Беременные подростки с концентрацией 25-D <30 нг/мл достоверно чаще имели положительный результат теста на вульвовагинальный кандидоз и бактериальный вагиноз [38].

Целевой уровень витамина D в организме человека

Анализ многочисленных клинических данных позволяет с высокой степенью уверенности утверждать, что для нормального функционирования костно-мышечного аппарата человека целевыми уровнями концентрации 25-D в крови следует считать уровень, превышающий 30 нг/мл. При беременности, а также для осуществления плейотропных эффектов витамина D оптимальным следует считать уровень, превышающий 40 нг/мл [1]. Систематический обзор и метаанализ 26 рандомизированных контролируемых исследований (РКИ), проведенный A. Martineau и соавт. (2017), продемонстрировали значительное снижение риска ОРВИ при приеме добавок витамина D [39]. Защитный эффект наблюдали у тех пациентов, которые получали витамин D ежедневно или еженедельно без дополнительного болюса, в отличие от тех, кто получил одну или несколько болюсных доз. Положительные эффекты обратно коррелировали с исходным уровнем 25-D в крови: чем ниже был уровень витамина D в крови до начала лечения, тем сильнее эффект. Оптимальная доза витаминного препарата варьировала от 1000 до 4000 МЕ/сут колекальциферола [8, 29]. Степень защиты от инфекций увеличивалась по мере повышения уровня витамина D. Отмечено, что уровень 25-D, равный 38 нг/мл, является достаточным для снижения риска ОРВИ. Другие авторы предлагают поддерживать уровень витамина 25-D в сыворотке не менее 30 нг/мл или в диапазоне 40—60 нг/мл [1, 2, 35, 40]. При исследовании сезонных колебаний уровней витамина D не отметили связи с сезонным подъемом заболеваемости ОРВИ. Не было обнаружено устойчивой связи между уровнем витамина D и серологической реакцией на вакцину от гриппа [29].

Лабораторная диагностика недостаточности витамина D

До последнего десятилетия диагностику недостаточности витамина D проводили по косвенными признакам, например по снижению концентрации кальция в крови в связи с отсутствием доступных методов лабораторного анализа. В настоящее время определение уровней витаминов D, B₁₂, фолиевой кислоты в крови стало доступным, в том числе из-за развития крупных сетей клинико-диагностических лабораторий (КДЛ). Исследование уровня витаминов в настоящее время не входит в стандарты оказания медицинской помощи по большинству нозологий, в связи с чем бремя финансирования такой диагностики ложится на плечи пациентов. Немаловажным аспектом взаимодействия врача и пациента оказывается выбор метаболита, который необходимо исследовать, и оптимального метода диагностики, а также степень доверия потребителей к качеству исследований в той или иной лаборатории.

В большинстве КДЛ Москвы и Санкт-Петербурга определяют суммарное содержание D₂ и D₃ в сыворотке крови, обозначаемое как 25(OH)D, или холекальциферол. Для определения этого показателя используют методы высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС), электрохемилюминесцентного иммуноанализа (ECLIA), иммунохемилюминесцентного анализа (CLIA), иммуноферментного анализа (ИФА) [41—43]. Раздельное определение 25(OH)-производных витаминов D₂ и D₃ выполняют в основном в специализированных лабораториях методом ВЭЖХ-МС. Такое обследование иногда назначают при лабораторном контроле приема лекарственных препаратов витамина D. Уровень активного метаболита 1,25(OH)2D — кальцитриола — определяют с помощью иммуноферментного анализа и ВЭЖХ-МС только в нескольких крупных КДЛ. Этот показатель, как правило, не имеет существенного диагностического значения, кроме случаев резистентного к лечению витамином D рахита у детей, так как 1,25(OH)₂D обладает коротким периодом полувыведения (4 ч). Кроме того, при дефиците витамина D увеличение концентрации паратгормона в крови приводит к активации 1α-гидроксилазы, вследствие чего уровень 1,25(OH)₂D может быть нормальным или даже повышенным [41]. Таким образом, наиболее востребованным остается анализ крови на содержание общего 25-D, уровень которого в сыворотке крови является основным диагностическим критерием дефицита и недостаточности витамина D.

ВЭЖХ-МС является референсным методом определения концентрации любых витаминов, в том числе витамина D. Для применения метода необходимы высококвалифицированный персонал, дорогостоящая аппаратура и особо чистые реактивы, при этом метод достаточно трудоемок, поэтому в большинстве клинико-диагностических лабораторий используют методы иммуноанализа (иммуноферментный плашечный и автоматизированный, хемилюминесцентный, электрохемилюминесцентный). Концентрацию 25-D в сыворотке крови в этих случаях определяют с использованием конкурентных методов, основанных на применении меченых антител (предел обнаружения от 3—4 нг/мл, коэффициент пересчета в другие популярные единицы измерения (нмоль/мл) составляет 2,5, т.е. 10 нг/мл соответствует 25 нмоль/мл) [41, 43, 45]. Концентрация 25-D у большинства людей, по данным лабораторий разных стран, варьирует от 5 до 80 нг/мл [1, 44, 46]. У людей, подвергающихся интенсивному солнечному облучению, концентрация 25-D может достигать 120—150 нг/мл на следующий день после инсоляции без какого-либо отрицательного влияния на обмен кальция и здоровье. Вариативность норм во многом связана с методами исследования и используемым лабораторным оборудованием [45—48]. Довольно важной проблемой является стандартизация лабораторных тестов. Недавние исследования с использованием имеющихся на рынке лабораторных тест-систем показали значительный разброс данных 25-D по сравнению с референсным методом ВЭЖХ-МС, что может привести к недооценке [49] или завышению [50] показателей 25(OH)D в сыворотке крови. Отсутствие стандартизации у производителей антител для определения витаминов группы D, недостаточная специфичность антител и перекрестная реактивность с другими метаболитами витаминов группы D могут быть возможными причинами разногласий между результатами, полученными с помощью разных тест-систем иммуноанализа [46, 48].

Методы, в которых перед оценкой связывания проводят хроматографическое разделение определяемых соединений, часто дают более низкие показатели нормы [39, 51]. Использование моноклональных антител против одновременно (OH)-производных витамина D₂ и D₃, а также применение автоматизированных методик иммунохимического анализа (CLIA) способствуют улучшению качества и сопоставимости результатов анализов. Автоматизированный CLIA/ECLIA обладает рядом неоспоримых преимуществ перед ИФА: отсутствием необходимости накапливать пробы, быстротой выполнения (длительность <30 мин), высокой точностью (коэффициент вариации теста ниже 8%), практически полным отсутствием человеческого фактора, хорошей стандартизованностью калибровочных и контрольных материалов у ведущих производителей лабораторного оборудования. Использование такого оборудования позволяет формировать базы данных о концентрации витамина в крови у пациентов в течение месяцев и даже многих лет наблюдения. Методики плашечного ИФА используют в основном в менее крупных КДЛ, но необходимо иметь в виду, что погрешность методики возрастает вдвое при использовании другого планшета даже одной серии того же производителя, а при использовании наборов реагентов разных фирм — еще более [41]. Несмотря на более низкую стоимость выполнения анализа с использованием плашечного ИФА, мы считаем целесообразным применение автоматизированных методик иммуноанализа, которые соответствуют стандартным эталонным материалам (SRM) Национального института стандартов и технологий (NIST) (NIST, Гейтерсбург, Мэриленд) [41, 44—48, 52].

Авторы проанализировали сайты десяти сетевых КДЛ Санкт-Петербурга, предлагающие услуги по исследованию уровней 25-D и его метаболитов в сыворотке крови. Только пять из них указывают методы исследования, четыре — марку лабораторного оборудования, в трех имеется возможность выполнения исследований как с использованием автоматизированного хемилюминесцентного анализа, так и референсной ВЭЖХ-МС. Возможность получения такой информации в открытом доступе, на наш взгляд, увеличивает степень доверия к результатам исследования КДЛ. Важным обстоятельством, которое снижает доверие к результатам определения витамина D в РФ является отсутствие в программе федеральной системы внешней оценки качества лабораторных исследований (ФСВОК) контрольных материалов для определения этого аналита. Поэтому отечественным лабораториям приходится полагаться на контрольные материалы (сыворотки) производителей оборудования и реагентов или подписываться на международные системы контроля качества лабораторных исследований, что является достаточно затратным, особенно для КДЛ в составе бюджетных медицинских учреждений. Стоимость исследования уровня 25(OH)D референсным методом ВЭЖХ-МС в среднем в 1,5—3 раза выше стоимости исследований, выполняемых методами CLIA/ECLIA/ИФА в зависимости от лаборатории. Кроме того, необходимо иметь в виду, что при большом потоке исследований в КДЛ хроматографические колонки сорбируют на себе многие молекулы из разделяемых смесей, что приводит к снижению качества исследований. Поэтому если сравнить хроматограммы на «свежих» колонках и через несколько сотен определений витамина D в сыворотках крови, то разница может быть значительной. Единых стандартов обновления хроматографических материалов в США, Евросоюзе и РФ не существует, а в условиях коммерческих лабораторий всегда существует необходимость экономии финансовых ресурсов. При условии использования стандартизованных методик автоматизированный иммуноанализ, согласованный с NIST SRM и референсным методом ВЭЖХ-МС, является вполне приемлемым для широкого применения в клинической практике, в том числе для выявления дефицита витамина D и контроля за лечением таких состояний, что и имеет место в развитых странах Европы и Америки. Таким образом, мнение некоторых отечественных ученых о преимуществе измерения 25(OH)D с помощью ВЭЖХ-МС не выглядит обоснованным применительно к реальной клинической практике [48].

Вслед за стандартами по определению маркеров для диагностики острого инфаркта миокарда, таких как кардиоспецифичный тропонин, вслед за стандартами определения D-димера в медицинских учреждениях, подчиняющихся Минздраву России, пора закрепить и необходимость определения витамина D для диагностики и контроля лечения состояний, связанных с дефицитом этого важнейшего метаболита организма человека.

Заключение

Таким образом, многочисленные доказательства иммуномодулирующего и защитного эффектов витамина D и данные о значительной распространенности его дефицита и/или недостаточности диктуют необходимость определения уровня 25-D в крови в реальной клинической практике.

Целевыми уровнями концентрации 25-D в крови следует считать уровень, превышающий 30 нг/мл. При беременности, а также для осуществления плейотропных эффектов витамина D оптимальным следует считать уровень, превышающий 40 нг/мл. Степень защиты от инфекций увеличивалась по мере повышения уровня витамина D. Отмечено, что уровень 25-D, равный 38 нг/мл, является достаточным для снижения риска ОРВИ.

В группах повышенного риска развития дефицита витамина D, в том числе у беременных, людей пожилого возраста, лиц, страдающих хроническими заболеваниями, использование методов автоматизированного иммуноанализа особенно показано, однако в силу отсутствия бюджетного финансирования программ по профилактике дефицита витамина D доступность лабораторной диагностики пока явно недостаточна. Опросы сотрудников КДЛ, в которых выполняют анализ на витамин D, подтверждают, что врачи и средний медицинский персонал знают и контролируют уровень метаболита в своем организме, принимают препараты витамина D в правильной дозировке в течение всего года. В связи с этим современные методы определения уровня витамина D должны быстрее внедряться организаторами здравоохранения для использования в клинической практике в рамках системы обязательного медицинского страхования населения при условии применения стандартизованных методик и сертифицированного оборудования. По нашему мнению, это приведет автоматически и к снижению стоимости тест-систем, переходу от анализа, доступного немногим, к широкому внедрению в нашей стране, будет способствовать сохранению здоровья всего населения РФ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.