Разработка метода определения мРНК гена ROR1 в лейкоцитах крови

ROR1 — эволюционно консервативная рецепторная трансмембранная тирозинкиназа, член семейства receptor tyrosine kinase-like orphan receptor (ROR) активирует один из важнейших молекулярных сигнальных путей — Wnt-путь, регулирующий эмбриональное развитие и дифференцировку, определяя клеточную полярность и направленность миграции клеток [1]. ROR1 интенсивно экспрессируется клетками в течение эмбрионального периода, но не детектируется в тканях взрослого организма за исключением короткой фазы дифференцировки B-лимфоцитов. Следует отметить, что экспрессия ROR1 не обнаружена при миелоидных злокачественных опухолях, в том числе при острых миелоидных лейкозах (ОМЛ) [2]. Вместе с тем известно, что белок ROR1 экспрессируется на поверхности опухолевых B-клеток у пациентов с ХЛЛ, но не детектируется в нормальных B-клетках, полученных от здоровых людей, или в клетках других здоровых тканей [3, 4]. Недавно было показано, что ROR1 может экспрессироваться также и в B-лимфоцитах при неходжкинских лимфомах (B-НХЛ), фолликулярных лимфомах, лимфоме зоны мантии и при B-клеточных острых лимфобластных лейкозах [5]. Функция ROR1 способствует активации и выживанию лейкозных клеток и ускоряет прогрессирование заболевания у пациентов с хроническим B-лимфоцитарным лейкозом (B-ХЛЛ) [6]. Важно отметить, что, по данным литературы, не у всех пациентов с ХЛЛ (в 85—94%) удается обнаружить детектируемые уровни антигена ROR1 иммуноцитометрическими методами, что может говорить об отдельном варианте ROR1-негативного фенотипа заболевания с вероятными особенностями протекания заболевания и (или) ответа на терапию.

Экспрессия протеина ROR1 на клетках ХЛЛ считается одним из возможных маркеров оценки прогноза и эффективности терапии и рассматривается как потенциальная мишень для иммунотерапии. Появление новых лекарственных препаратов с направленным действием на ROR1 определяет актуальность разработки доступных методов выявления экспрессии ROR1 у пациентов. Учитывая, что технология полимеразной цепной реакции (ПЦР) становится все более доступной в клинико-диагностических лабораториях, разработка и клиническая апробация метода количественного определения уровня мРНК ROR1 представляется перспективной для включения его в перечень диагностических тестов при ХЛЛ.

Цель исследования — разработка метода определения уровня экспрессии мРНК гена ROR1 в лейкоцитах крови и оценка его диагностического значения при ХЛЛ.

В работе были использованы образцы венозной крови, отобранной в раствор стабилизатора РНК (ООО «Формула гена») 37 пациентов (медиана возраста 62 года, 5 женщин и 32 мужчины) с подтвержденным диагнозом B-ХЛЛ до начала и в динамике терапии, 10 пациентов с хроническим миелолейкозом (ХМЛ) (медиана возраста 64 года, 1 женщина, 9 мужчин), 6 пациентов с B-клеточной лимфомой из малых лимфоцитов (медиана возраста 62 года, 4 женщины, 2 мужчин), 11 пациентов с множественной миеломой (медиана возраста 64 года, 5 женщин, 6 мужчин). Группа контроля включала 21 здорового донора (медиана возраста 21 год, 9 женщин, 12 мужчин). Исследование было одобрено локальным этическим комитетом Красноярской краевой клинической больницы.

Выделение РНК осуществляли с использованием набора реагентов «РИБО-золь D» (ФБУН ЦНИИЭ, Россия), обратную транскрипцию проводили с использованием набора реагентов РЕВЕРТА-L (ФБУН ЦНИИЭ, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

Уровень мРНК ROR1 определяли методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), разработанным в лаборатории Красноярского филиала ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России. Для дизайна праймеров и зонда использовали программу Primer3 (https://primer3.ut.ee/).

Амплификацию проводили в 25 мкл смеси, содержащей 100 мМ Трис-HCl, pH 8,8; 0,5 М KCl; 0,8% Nonidet P-40; 2 мМ MgCl₂; 0,2 мМ каждого из дНТФ; 10 мкл кДНК; по 0,3 мкМ праймеров и TaqMan зонда; 1 единицу активности SynTaq ДНК-полимеразы (ООО «НПО Синтол», Россия). ПЦР-РВ проводили на амплификаторе CFX96 («Bio-Rad», США). Использовали следующую программу амплификации: предварительный прогрев при 95 °C — 5 мин, далее 50 циклов: 95 °C — 15 с, 60 °C — 60 с, детекция флюоресцентного сигнала проводилась по каналу FAM, осуществлялась непосредственно в ходе ПЦР-РВ. Для нормализации получаемых данных в качестве гена «домашнего хозяйства» использовали ген ABL1. Расчет уровня относительной экспрессии мРНК гена ROR1 производили по методу ∆∆Ct [7]. Аналитическая вариация метода рассчитывалась по результатам тестирования одного образца не менее чем в 10 повторах в разных аналитических сериях, начиная со стадии выделения РНК. В каждом случае считали относительную экспрессию мРНК ROR1, для полученных значений определяли коэффициент вариации, который в наших постановках не превышал 9%. Параллельно в сыворотках крови пациентов с ХЛЛ определяли уровень β-2 микроглобулина методом ИФА с использованием набора β-2-микроглобулин ЗАО «ДРГ Техсистемс». Статистический анализ проводили с использованием программного пакета R, корреляцию (по Спирмену) считали статистически значимой при p-уровне <0,05.

На рис. 1 представлены графики накопления флюоресцентного сигнала, полученные с использованием разработанного метода при исследовании проб крови пациентов с разным уровнем мРНК ROR1.

Рис. 1. Примеры графиков накопления флюоресцентного сигнала, полученных при исследовании проб пациентов с ХЛЛ с помощью разработанного метода.

Для нормализации результатов использовался ген «домашнего хозяйства» ABL1. 1 — пациент с ХЛЛ, экспрессия ROR1=0,21 отн. ед.; 2 — пациент с ХЛЛ, экспрессия ROR1=0,03 отн. ед.; 3 — пациент с ХЛЛ, экспрессия ROR1 отсутствует.

Ни в одной из исследованных проб крови здоровых доноров или у пациентов с множественной миеломой, с лимфомой из малых лимфоцитов или с ХМЛ мРНК ROR1 не выявлялась, но при этом детектировалась у 23 (62%) из всех 37 обследованных пациентов с ХЛЛ, в том числе у 16 (70%) из 23 пациентов с первично установленным на момент тестирования диагнозом (см. таблицу). Детектируемый уровень мРНК в клетках венозной крови пациентов с ХЛЛ находился в диапазоне от 0,03 до 3,0 относительных единиц (Me=0,17). За время наблюдения в течение 32 нед за включенными в исследование 23 первичными пациентами у 6 ROR(+) из них в дальнейшем была отмечена прогрессия заболевания, однако прогрессирования не наблюдалось ни у кого из 7 ROR(–).

Характеристика групп пациентов по определению уровня экспрессии ROR1 (ROR1 (–) экспрессия не выявлена и ROR1 (+) — выявлена)

Нами не было обнаружено значимой корреляционной связи между уровнем мРНК ROR1 с количеством циркулирующих лейкоцитов и лимфоцитов, а также с уровнем β-2 микроглобулина в сыворотке крови пациентов (p>0,05).

Для 11 пациентов с первично выявленным ХЛЛ проводили повторные исследования уровня мРНК ROR1 в динамике терапии. У 9 из них с изначально высоким уровнем мРНК ROR1 наблюдалось резкое снижение уровня этого маркера в течение уже первых недель после начала терапии (рис. 2). Падение уровня мРНК ROR1 прямо не коррелировало (p<0,05) с динамикой количества клеток крови в периферической крови и концентрацией сывороточного β-2 микроглобулина (p<0,05), что говорит о независимом характере такого снижения от других маркеров. Ни в одном из повторных образцов, взятых после начала терапии у пациентов с ХЛЛ мы ни разу не наблюдали увеличения уровня мРНК ROR1.

Рис. 2. Уровень экспрессии мРНК ROR1 у 11 пациентов с ХЛЛ в динамике терапии.

Цифры указывают на рег. № пациента.

Повышенная экспрессия антигена ROR1 была обнаружена в клетках ряда злокачественных опухолей человека [8, 9], в том числе при онкогематологических заболеваниях: множественной миеломе, остром лимфобластном лейкозе, некоторых лимфомах и ХЛЛ.

В подавляющем большинстве исследований активности гена ROR1 авторы оценивали экспрессию непосредственного белкового продукта гена и только в единичных случаях одновременно определяли и уровень мРНК гена ROR1. При этом в работе [2] было показано, что выявление антигена ROR1, как правило, совпадало с детекцией экспрессии мРНК этого гена. Эти данные позволяют предложить использование теста ПЦР-РВ наряду с иммуноцитометрическим определением данного маркера.

В нашей работе мы наблюдали экспрессию мРНК ROR1 у 70% пациентов с впервые выявленным диагнозом B-ХЛЛ, что ниже, чем данные литературы о частоте встречаемости антигена ROR1 на мембранах трансформированных клеток у больных ХЛЛ, полученных при иммуноцитометрическом исследовании. Различия могут быть обусловлены как относительно меньшей и более гетерогенной группой пациентов в нашей выборке, так и разницей в регуляции интенсивности синтеза и распада мРНК данного гена и его белкового продукта. Вероятно, терапевтические воздействия быстрее отражаются на синтезе мРНК ROR1, чем на жизненном цикле трансформированных клеток ХЛЛ и их мембранных протеинах. Отсутствие корреляционной связи уровня мРНК ROR1 с количеством лейкоцитов подтверждает это предположение.

В литературе описаны различия между мРНК и антигеном ROR1 в отношении к их ассоциации с другими маркерами ХЛЛ. Так, в исследовании S. Baskar и соавт. [4] на выборке из 107 пациентов с B-ХЛЛ было выявлено, что увеличенная экспрессия мРНК ROR1 наблюдалась во всех пробах РНК, выделенной из мононуклеаров, независимо от экспрессии хорошо известных прогностических маркеров — ZAP-70 и мутационного статуса IgV_H, а также от экспрессии маркеров активации лимфоцитов.

Отсутствие корреляции между экспрессией мРНК ROR1 и β-2 микроглобулином в нашем исследовании соответствует описанному ранее аналогичному результату и для антигена ROR1 и может объясняться тем, что количество β-2 микроглобулина при ХЛЛ отражает не столько количество опухолевых клеток, сколько общий уровень активации циркулирующих лимфоцитов.

В нашем исследовании мы не выявили мРНК ROR1 в пробах крови пациентов ни при одном из других онкогематологичексих заболеваний (см. таблицу), что, очевидно, можно связать с отсутствием достаточного количества свободно циркулирующих опухолевых клеток у пациентов при более локализованных формах опухолей либо с вовлечением в онкологический процесс в данных случаях сигнальных путей в обход регуляции ROR1. Это также свидетельствует в пользу достаточно высокой специфичности теста на экспрессию ROR1 в клетках венозной крови именно для ХЛЛ.

В нашей работе впервые продемонстрировано резкое снижение до минимального определяемого уровня мРНК ROR1 у всех пациентов после назначения терапии, что может служить дополнительным параметром эффективности терапии.

В исследовании авторов [6] было показано, что высокий уровень антигена ROR1 на CD19+ клетках ассоциирован с высоким уровнем ZAP-70, отрицательным мутационным статусом IgV_H и более короткой выживаемостью пациентов с ХЛЛ. Одновременно описано, что уровень антигена ROR1 на мембранах лимфоцитов повышался при прогрессировании ХЛЛ [9]. Однако в статье авторов [4] показано, что уровень антигена ROR1 на CD19+ клетках не изменяется на фоне применяемой терапии. Для понимания причин различий необходимы измерения уровня мРНК и антигена ROR1 в параллельных исследованиях образцов крови пациентов с использованием стандартизованных методик иммунофенотипирования и ПЦР-РВ.

При разных злокачественных новообразованиях ROR1 может быть вовлечен в различные сигнальные каскады и задействовать разные факторы транскрипции, но при этом конечным результатом активности ROR1 всегда является увеличение устойчивости опухолевых клеток, их способности к пролиферации и метастазированию [8]. В большинстве исследований отмечают преимущественное вовлечение ROR1 в реализацию сигнального пути PI3K/AKT/mTOR [10]. Это позволяет надеяться, что направленные на данный путь ингибиторы могут быть потенциально эффективными у пациентов с позитивными ROR1 опухолевыми клетками [11]. Рассматривается также и сам ROR1 как мишень для химиотерапии пациентов с ХЛЛ [3]. Это обусловливает перспективность внедрения технологий оценки экспрессии ROR1 в рутинную практику клинических лабораторий.

Нами разработан метод определения уровня мРНК ROR1 в клетках крови. Данный маркер выявлялся у 70% пациентов с впервые выявленным диагнозом ХЛЛ, но не при других онкогематологических заболеваниях среди включенных в исследование пациентов. Нами впервые было продемонстрировано значительное падение уровня мРНК ROR1 в лейкоцитах пациентов с ХЛЛ в динамике терапии. Полученные результаты позволяют предложить использование технологии ПЦР-РВ в качестве дополнительного или альтернативного иммуноцитометрическому методу определения экспрессии гена ROR1.

Метод может иметь перспективное диагностическое и прогностическое значение как дополнительный тест при выборе терапии и оценки ее эффективности у пациентов с ХЛЛ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.