Сопоставимость результатов измерений тестостерона иммунохимическими (ИХ) методами разных производителей остается неудовлетворительной. Особенно явно это проявляется при измерении в наиболее диагностически значимой области низких концентраций тестостерона [1—5]. Такая ситуация — следствие плохой стандартизации методов и присущей ИХ методам матрикс-зависимой интерференции. Методы жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией позволяют преодолеть эти проблемы, но пока недоступны для широкого рутинного применения. В большинстве клинических лабораторий мира по-прежнему основными методами измерения тестостерона являются прямые ИХ методы.
Цель исследования — оценить возможность гармонизации измерений тестостерона ИХ методами путем проведения пилотного исследования по сопоставимости результатов измерения тестостерона в разных лабораториях и вторичной коррекцией к методу высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС).
Материал и методы
Измерения концентрации тестостерона проводились в 4 лабораториях ИХ методами. В лабораториях ГАУЗ СО ОДКБ (в дальнейшем Architect 1) и ООО «Европейский медицинский центр «УГМК-Здоровье» (Architect 3) использовали анализатор Abbott Architect i1000SR (тест-ситемы 2-го поколения), в лаборатории ГБУЗ СО СОКБ №1 — Abbott Architect i2000SR (Architect 2) и в лаборатории ООО МФЦ «Гармония» — Siemens Immulite 1000. Кроме того, в лаборатории ОДКБ измерение тестостерона в части проб выполнялось и на анализаторе Beckman Coulter Access II (Testosterone assay, Beckman Coulter). Определение тестостерона методом ВЭЖХ-МС/МС выполнено в лаборатории метаболомных исследований института персонифицированной медицины «НМИЦ эндокринологии» (ЭНЦ) на коммерческих условиях в рамках договора о выполнении исследований для пациентов медицинского центра «Кволити Мед».
Для исследования использовали образцы сывороток крови пациентов с измеренными концентрациями тестостерона, оставшиеся после проведения всех назначенных лабораторных анализов. Всего было приготовлено 43 пула сывороток. Для сравнения измерений ИХ методами и методом ВЭЖХ-МС/МС из образцов сывороток мальчиков (возраст от 2 до 15 лет) были приготовлены 10 пулов сывороток по 7—10 мл, примерно охватывающих диапазон концентраций тестостерона от 0,7 до 17,0 нмоль/л. Сыворотки с гемолизом, гипербилирубинемией и гиперлипемией (по индексу LIH на анализаторе Beckman AU 680) не использовались. До приготовления пулов сыворотки хранили в течение 1—6 дней при температуре –40°C. После пулирования пробы аликвотировались по 1 мл и доставлялись в лаборатории в течение 2 ч в термоконтейнерах с охладителем. Измерения в лабораториях проводились в тот же день. В лабораторию ЭНЦ пробы доставлялись экспресс-почтой в термоконтейнере с сухим льдом. Исследование методом ВЭЖХ-МС/МС были выполнены через 1 день после отправки проб.
В дальнейшем были приготовлены еще 33 пула из сывороток мужчин, в которых измерения тестостерона проводились только ИХ методами. Пулы сывороток доставлялись в лаборатории тремя партиями по 10—13 пулов в каждой в течение 1 нед.
Принципиальным условием для лабораторий, участвующих в исследовании, было однократное измерение концентрации тестостерона в исследовательских пулах сывороток в общем потоке рутинных иммунохимических исследований.
Статистический анализ сопоставимости результатов измерений концентрации тестостерона проводили с помощью программ Analyse-it и cp-R [6].
Результаты
Из 43 пулов измерения были выполнены в 21 пуле на Architect 1, в 13 пулах на Access, в 32 пулах на Immulite и во всех 43 пулах на Architect 2 и Architect 3. Результаты измерения тестостерона ИХ методами в четырех лабораториях представлены на рис. 1 и в табл. 1. Концентрации тестостерона, определенные в каждой лаборатории, сравнивались со средним значением, рассчитанным из результатов определения тестостерона для каждого образца во всех лабораториях, включенных в исследование. Согласованность результатов находилась в пределах от –30 до 27,9%. Смещение результатов в лабораториях, использующих анализаторы Architect, составило 5,3, 9,2 и 2,3%. Результаты измерений на Access и Immulite находились по другую сторону от средних значений и отклонялись в среднем на –4,6 и –21,5%.
Рис. 1. Линейный регрессионный анализ Passing-Bablok (а) и график отличий результатов измерения тестостерона различными методами от средней концентрации по всем методам (б). По оси абсцисс — средняя концентрация тестостерона по всем методам в нмоль/л; а — по оси ординат — концентрация тестостерона в пробе для каждого метода, пунктирная линия — линия совпадения значений, сплошная линия — линия регрессии, серым цветом обозначена область 95% доверительного интервала линии регрессии. б — по оси ординат — разница между каждым измерением и средней концентрацией тестостерона по всем методам в данной пробе в нмоль/л; разными символами показаны значения для различных методов.
Таблица 1. Значения концентраций тестостерона в пулах сывороток, измеренных ИХ методами
| Architect* | Immulite | Access | |
| n=32 | |||
| Медиана, нмоль/л | 6,44 | 4,43 | |
| Межквартильный диапазон, нмоль/л | 2,40—10,62 | 1,86—7,86 | |
| p<0,0001** | |||
| n=13 | |||
| Медиана, нмоль/л | 5,85 | 3,92 | 4,60 |
| Межквартильный диапазон, нмоль/л | 1,30—10,93 | 0,96—8,20 | 1,23—8,85 |
| p=0,0266*** | |||
Примечание. Architect* — приведены данные, рассчитанные для средних трех анализаторов. Медианные значения (Me, нмоль/л) между различными анализаторами Architect статистически не отличались друг от друга (для выборки из 13 пулов Me 6,0, 6,0, 5,55 для Architect 1, 2, 3, для выборки 32 пулов Me 6,65 и 6,23); ** — достоверное отличие Immulite и Architect, *** — достоверное отличие Access и Architect.
В дальнейшем сравнивали результаты измерений тестостерона между различными методами. Результаты, полученные на анализаторах Architect, были достоверно выше, чем на Immulite и Access (см. табл. 1). Взаимоотношения между методами (Architect с Immulite и Access) описываются зависимостью со значимым пропорциональным смещением — угловой коэффициент достоверно отличается от единицы, а доверительные интервалы (ДИ) коэффициента пересечения включают ноль (табл. 2, рис. 1, а— б).
Таблица 2. Регрессионный анализ Passing-Bablok
| Методы | Уравнение линейной регрессии | 95% ДИ для углового коэффициента | 95% ДИ для коэффициента пересечения | Коэффициент детерминации, r2 |
| Каждый метод к среднему по всем методам | y=0,07+1,05x | 1,02; 1,078 | –0,155; 0,028 | 0,960 |
| Среднее всех Architect и Immulite | y=0,08+0,71x | 0,639; 0,812 | –0,269; 0,235 | 0,952 |
| Среднее всех Architect и Access | y=0,152+0,81x | 0,711; 0,898 | –0,082; 0,589 | 0,971 |
| Architect 1, 2, 3 и среднее всех Architect | y=0,02+1,00x | 0,988; 1,02 | –0,046; 0,049 | 0,997 |
| Immulite и Access | y=0,31+1,02x | 0,076; 0,80 | 0,0893; 1,127 | 0,975 |
Различия в концентрациях тестостерона, определенных на анализаторах Immulite и Access, от результатов Architect (табл. 3) превышают даже минимальные требования к допустимому среднему смещению в ±9,0% и общей ошибки в ±23,3%, рассчитанных на основе биологической вариации и представленных на сайте Европейской федерации клинической химии и лабораторной медицины (EFLM) [7]. Результаты измерений концентрации тестостерона на трех анализаторах Architect хорошо согласуются (рис. 2, г, табл. 2 и 3). Смещения единичных результатов от средних значений всех результатов (верхний и нижний 95% пределы согласия) значительно меньше, чем приемлемые требования для общей ошибки ±15,5% [7].
Таблица 3. Относительные различия (по Bland-Altman) результатов определения тестостерона ИХ методами
| Методы | Среднее смещение, % (95% ДИ) | Нижний 95% предел согласия, % (95% ДИ) | Верхний 95% предел согласия, % (95% ДИ) | SD, % |
| Каждый метод к среднему по всем методам | 1,02 (–3,41; 1,357) | –30,0 (–34,0; 25,9) | 27,9 (23,8; 32,0) | 14,8 |
| Среднее всех Architect и Immulite | –28,9 (–35,5; –22,4) | –64,7 (–76,1; –53,4) | 6,83 (–4,5; 18,2) | 18,3 |
| Среднее всех Architect и Access | –11,0 (–23,4; 1,4) | –52,3 (–73,1; –29,5) | 29,2 (7,4; 51,0) | 20,5 |
| Architect 1, 2, 3 и среднее всех Architect | –0,1 (–0,9; 0,7) | –8,3 (–9,7; –6,9) | 8,11 (6,7; 9,5) | 4,2 |
| Immulite и Access | 15,0 (3,0; 27,1) | –24,0 (–45,1; –2,9) | 54,0 (32,9; 75,1) | 19,9 |
Рис. 2. Линейный регрессионный анализ Passing-Bablok результатов измерения тестостерона различными ИХ методами. а — Architect и Immulite, б — Architect и Access, в — Immulite и Access, г — между различными анализаторами Architect. По оси X на графиках а, б, г отложены средние значения измерений на трех анализаторах Architect в нмоль/л, на графике в — концентрация, измеренная на анализаторе Immulite. Пунктирная линия — линия совпадения значений, сплошная линия — линия регрессии, серым цветом обозначена область 95% ДИ линии регрессии.
Такие отличия между ИХ методами отражаются и на соотношении с результатами определения тестостерона ВЭЖХ-МС/МС, выполненного в 10 пулах сывороток мальчиков. Результаты суммированы в табл. 4 и представлены на рис. 2. Концентрации тестостерона, полученные на анализаторах Architect, значимо выше, чем измеренные методом масс-спектрометрии. Отличия результатов Architect, абсолютные и относительные, больше, чем таковые для Immulite и Access (см. табл. 4). При этом смещение результатов Architect имеет пропорциональную зависимость с относительно небольшим разбросом значений вокруг линии регрессии и коэффициентом детерминации 0,996. Это позволило провести достаточно успешную математическую коррекцию результатов по уравнению линейной регрессии (см. рис. 3, а; табл. 4). Такая же ситуация наблюдалась и с результатами Access (см. рис. 3, в). Из всех исследованных ИХ методов, результаты Immulite наиболее близки к результатам измерений методом масс-спектрометрии. Но характер линейной зависимости — достаточно большое относительное стандартное отклонение (SD), широкий доверительный интервал линии регрессии, коэффициент детерминации 0,961 — не позволил существенно улучшить результаты сравнения с масс-спектрометрией путем математической коррекции. Тем не менее абсолютное смещение концентрации тестостерона снизилось в 2 раза (см. табл. 4, рис. 3, б).
Рис. 3. Линейный регрессионный анализ Passing-Bablok результатов измерения тестостерона различными ИХ методами и методом ВЭЖХ-МС/МС. График слева — до математической коррекции; график справа — после математической коррекции. На оси абсцисс на всех графиках концентрации тестостерона для метода ВЭЖХ-МС/МС в нмоль/л. По оси ординат — концентрация тестостерона, определенная ИХ методом в нмоль/л: а — Architect 1, 2, 3 (все результаты трех анализаторов), б — Immulite, в — Access. Пунктирная линия — линия совпадения значений, сплошная линия — линия регрессии, серым цветом обозначена область 95% ДИ линии регрессии.
Таблица 4. Регрессия Passing-Bablok и смещения иммунохимических методов по отношению к ВЭЖХ-МС/МС (результаты исходные и после математической коррекции)
| Методы | Уравнение линейной регрессии | 95% ДИ для углового коэффициента | 95% ДИ для коэффициента пересечения | r2 | Смещение абсолютное, нмоль/л (SD) | Смещение относительное, % (SD%) |
| Architect 1, 2, 3 | y=–0,22+1,52x | 1,485; 1,56 | –0,282;–0,068 | 0,996 | 2,18 (1,86) | 32,5 (11,0) |
| y=0,0+1,0x | 0,99; 1,02 | –0,014; 0,009 | 0,996 | 0,007 (0,146) | 2,4 (6,9) | |
| Immulite | y=–0,37+1,14x | 0,982; 1,53 | –2,18; –0,007 | 0,965 | 0,58 (1,30) | 1,29 (16,6) |
| y=–0,27+1,05x | –1,9; 0,232 | 0,89; 1,41 | 0,961 | 0,275 (0,966) | 1,96 (12,1) | |
| Access | y=–0,23+1,24x | 1,12; 1,30 | –0,6; 0,127 | 0,995 | 0,87 (0,93) | 11,8 (12) |
| y=0,0+1,0x | 0,91; 1,04 | –0,154; 0,364 | 0,995 | 0,011 (0,261) | 2,7 (11,5) |
Примечание. Здесь: и в табл. 5: Полужирным шрифтом выделены данные после математической коррекции, SD — стандартное отклонение.
Конечно, математическая коррекция на той же группе значений, на которой было получено уравнение регрессии, приводит к завышенно положительным результатам. Мы попытались проверить возможность улучшения согласованности результатов иммунохимических методов путем математической коррекции значений концентрации тестостерона в пулах сывороток, которые не использовались для получения уравнения линейной регрессии, описывающей отношения иммунохимических методов и метода ВЭЖХ-МС/МС (тестовая выборка). Кроме того, эти пулы имели иной матрикс — уравнения регрессии получали на пулах сыворотки детей (мальчиков 2—15 лет), а оставшиеся пулы готовились из сыворотки взрослых мужчин. Для коррекции использовали результаты определения тестостерона в 23 пулах методами Architect и Immulite, в которых измерения методом масс-спектрометрии не проводилось. Как было описано выше, отличия результатов между этими методами были существенны (см. табл. 1, рис. 2, а). Такую же процедуру провели на результатах измерения тестостерона в 33 пулах на анализаторах Architect 2 и Architect 3. Несмотря на удовлетворительную согласованность результатов трех анализаторов, наблюдалось большее смещение значений концентраций тестостерона на Architect 3 от Architect 2 и Architect 1, чем между Architect 2 и Architect 1 (результаты не представлены).
Результаты подтверждают принципиальную возможность улучшения согласованности определения тестостерона иммунохимическими методами путем вторичной математической коррекции к выбранному методу ВЭЖХ-МС/МС (табл. 5), который в нашем случае априори имеет лучшие аналитические характеристики. Матричные эффекты коррекция не может компенсировать. Это хорошо видно на примере пары Architect — Immulite: смещение значимо компенсировано, но разброс результатов остается достаточно большим.
Таблица 5. Регрессия Passing-Bablok и смещения между ИХ методами до и после математической коррекции к методу ВЭЖХ-МС/МС (тестовая выборка)
| Методы | Уравнение линейной регрессии | 95% ДИ для углового коэффициента | 95% ДИ для коэффициента пересечения | r2 | Смещение абсолютное, нмоль/л (SD) | Смещение относительное, % (SD%) |
| Architect 3 и Architect 2 | y=0,05+1,08x | 1,05; 1,10 | –0,074; 0,202 | 0,996 | 0,57 (0,51) | 7,7 (4,7) |
| y=0,1+1,0x | 0,982; 1,02 | 0,052; 0,179 | 0,996 | 0,05 (0,37) | 3,5 (5,4) | |
| Architect* Immulite | y=0,19+0,67x | 0,615; 0,833 | –0,534; 0,398 | 0,956 | –2,16 (2,80) | 27,9 (19,8) |
| Y=0,26+0,93x | 0,831; 1,15 | –0,565; 0,554 | 0,957 | 0,035 (1,145) | 5,61 (19,3) |
Примечание. * — средние значения измерений тестостерона в трех лабораториях.
Заключение
Проведено локальное пилотное исследование состояния гармонизации прямых ИХ методов определения тестостерона между собой и с методом ВЭЖХ-МС/МС с использованием коммутативного материала — пулов сывороток крови пациентов. Подтверждена выраженная зависимость результатов от используемого метода. Такая ситуация известна давно, и мы еще долго будем сталкиваться с такими проблемами. При этом следует учитывать, что ставшее уже незыблемым утверждение о метод-зависимости результатов иммунохимического определения тестостерона не дает реального представления о согласованности различных методов. Например, в публикации коллектива сотрудников ЭНЦ получены иные, чем в нашем исследовании, взаимоотношения между измерениями тестостерона на анализаторе Architect и методом ВЭЖХ-МС/МС [5]. Поэтому важно мониторировать согласованность иммунохимических методов измерения тестостерона с использованием нативных проб пациентов. Наш эксперимент по математической коррекции результатов подтверждает возможность значительно улучшить сопоставимость результатов иммунохимических методов определения тестостерона за счет калибровки к референтному методу. К сожалению, в международной программе стандартизации измерения тестостерона (CDC Hormone Standardization Program — CDC HoSt) на март 2020 г. прошли сертификацию только ИХ методы Siemens Healthcare Diagnostics [8].
Наше исследование имеет ряд ограничений, связанных с малым количеством проб, отсутствием сывороток крови женщин. В использованных пулах сывороток пациентов не было отклонений в уровнях других стероидов (измерение тестостерона методом масс-спектрометрии проводилось в панели из 9 стероидных гормонов), что не дает возможности оценить их интерферирующее влияние.
Авторы выражают благодарность Кармацких О.Г., Сац А.П. за помощь в организации исследования.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.