Наследственные болезни обмена (НБО) представляют собой фенотипически и генетически гетерогенную группу заболеваний, возникающих в результате генетических повреждений, приводящих к недостаточной функции или отсутствию ферментативной активности различных метаболических процессов. Из-за тяжелых клинических последствий НБО являются важной причиной заболеваемости и смертности, а во многих случаях имеют долгосрочные последствия для здоровья [1, 2]. На сегодняшний день известно более 1000 нозологий НБО, суммарная частота которых может быть свыше 1 на 800 [3]. В связи с этим во многих странах мира проводится неонатальный скрининг (НС) новорожденных на НБО [4]. НС — это диагностическая технология сплошного безвыборочного лабораторного обследования всех новорожденных. Целью Н.С. является выявление детей с серьезными врожденными нарушениями на доклинической стадии для предотвращения развития симптомов и коррекции осложнений заболевания [5]. Для максимального выявления всех больных чувствительность скринингового теста максимизируется за счет установления относительно низких порогов концентрации анализируемых веществ [6]. Это приводит к получению большого числа ложноположительных результатов [7]. Еще одной проблемой скрининга является недостаточная специфичность исследуемых маркеров — метаболический профиль при различных нозологиях может частично совпадать, из-за чего возможно замедление постановки правильного диагноза. Наряду с этим такая неопределенность может оказать существенное негативное воздействие на психологическое состояние семьи [8]. С целью повышения диагностической точности для оценки находок скрининга большинства заболеваний используются несколько методов: биохимические тесты и генотипирование [9]. С 2006 г. в рамках национального проекта «Здоровье» во всех регионах страны программа массового обследования новорожденных включает следующие заболевания: врожденный гипотиреоз, фенилкетонурию (ФКУ), галактоземию (ГАЛ), адреногенитальный синдром и муковисцидоз (МВ). В Санкт-Петербурге массовый скрининг проводится в соответствии с положениями распоряжения Комитета по здравоохранению № 220-р от 29 мая 2006 г. Алгоритм скрининга включает количественное определение уровней биохимических маркеров соответствующих заболеваний: иммунореактивного трипсиногена (ИРТ), фенилаланина (ФА), общей галактозы (ГАО), тиреотропного гормона и 17-ОН-прогестерона в образцах сухих пятен крови. При получении положительных результатов проводятся повторный забор крови и исследование вышеуказанных метаболитов (ретест). Подтверждающий этап диагностики скринируемых заболеваний подразумевает проведение молекулярно-генетических исследований, однако данный этап является вариативной частью и четко не регламентирован. Вследствие того что используемые на первых двух этапах биохимические маркеры наряду с высокой чувствительностью обладают низкой специфичностью, после скрининга получается примерно 20% ложноположительных результатов. К примеру, биохимический маркер для диагностики муковисцидоза — ИРТ — может повышаться при ряде врожденных патологий, таких как: конъюгационная желтуха новорожденных, внутриутробные инфекции и др. Кроме того, при таком частом осложнении муковисцидоза, как мекониальный илеус, уровень ИРТ может быть нормальным, обусловливая ложноотрицательные результаты скрининга (схема 1).

В связи с изложенным очевидно, что для повышения эффективности НС необходимы разработка и оптимизация алгоритмов подтверждающей диагностики указанных заболеваний.

В отдельных регионах РФ после получения положительных результатов скрининга проводят исследование соответствующих генов на наиболее частые мутации. При этом, учитывая неоднородный этнический состав РФ, в ДНК могут встречаться другие мутации, тестирование которых в рамках этого метода не предусмотрено. В настоящее время технологический прогресс в области ДНК-диагностики наряду с резким снижением ее стоимости привели к тому, что в арсенал скрининговых программ добавились методы секвенирования «нового поколения» (NGS). NGS является новейшим методом секвенирования ДНК. Технологии NGS позволяют осуществлять массовое параллельное прочтение огромного количества относительно небольших фрагментов ДНК, в результате чего становится возможным установить последовательность всех экзонов или даже всего генома за один запуск. Очевидно, что за счет этого метод NGS быстрее и эффективнее, чем исследование каждого из генов по отдельности. Секвенирование соответствующего гена как часть процесса подтверждающей диагностики может иметь решающее значение в установлении предполагаемого диагноза. Выявление мутаций может также дать важную информацию о степени тяжести дефекта и вероятного прогноза [10]. При многих расстройствах была идентифицирована корреляция определенных мутаций генов с тяжелыми, легкими или доброкачественными вариантами заболевания [11—13]. Даже при муковисцидозе некоторые мутации связаны с тяжелой формой заболевания (например, F508del), а другие — с более умеренными [14]. Оптимизация методов молекулярно-генетической диагностики и реформирование организационной структуры подтверждающего этапа для усовершенствования на этой основе программ массового скрининга на наследственные болезни позволят повысить диагностическую эффективность НС.

Настоящее исследование было направлено на сравнение используемого в настоящее время алгоритма НС на МВ, ФКУ и ГАЛ и алгоритма, основанного на методе высокопроизводительного секвенирования (NGS) в популяции новорожденных Санкт-Петербурга.

В исследование включены 105 479 детей, родившихся в Санкт-Петербурге в период с апреля 2015 г. по сентябрь 2016 г. Всем выполнены скрининговые тесты, по результатам которых выявлен 191 новорожденный с положительными результатами. Сформированы группы новорожденных: 1) с повышенными значениями ИРТ (123); 2) с повышенными значениями ФА (27); 3) с повышенными значениями ГАО (41). Кроме того, методом случайной выборки сформирована контрольная группа из 22 новорожденных с отрицательными результатами по биохимическому скринингу. Все обследуемые (191) подверглись молекулярно-генетическому анализу на МВ, ФКУ и ГАЛ. Исследование проводилось одномоментно по двум алгоритмам: стандартному и альтернативному, основанному на методе NGS.

Этапы стандартного алгоритма:

1) МВ: ИРТ1 (первичное исследование)—ИРТ2 (ретест)—потовый тест;

2) ФКУ: ФА1 (первичное исследование)—ФА2 (ретест);

3) ГАЛ: ГАО1 (первичное исследование)—ГАО2 (ретест).

Схема предложенного альтернативного алгоритма (схема 2):

1) МВ: ИРТ1—ИРТ2—NGS секвенирование гена CFTR—потовый тест;

2) ФКУ: ФА1—ФА2—NGS секвенирование гена PAH;

3) ГАЛ: ГАО1—ГАО2—NGS секвенирование гена GALT.

Материалом для биохимических методов исследования (иммунофлюоресцентный, флюориметрический, флюоресцентный методы) являлась капиллярная кровь на бланках фильтровальной бумаги, взятая в родильном доме из пятки новорожденного на 4—5-й день жизни у доношенных и 7—9-й день у недоношенных (прибор Victor 2, «Perkin Elmer», США; наборы реагентов «ИРТ-Неоскрин», «Галактоза-Неонатал», «ФКУ-Неоскрин», Россия). Для проведения ретестов на МВ использовали капиллярную кровь, взятую на 21—28-й дни жизни независимо от срока гестации. Материалом для молекулярно-генетического исследования служили образцы ДНК, выделенные из сухих пятен крови. Проводили анализ 442 мутаций в гене CFTR, 99 мутаций в гене PAH, 40 мутаций в гене GALT методом высокопроизводительного геномного NGS секвенирования на приборе Ion Personal Genome Machine («LifeTechnologies», США).

Выделение ДНК. Процесс выделения ДНК осуществляли с помощью набора PureLink Genomic DNA Mini Kit («Invitrogen/Life Technologies», США) в соответствии с инструкцией производителя.

Амплификация таргетных регионов. Для специфичной амплификации целевых регионов генов PAH, GALT и CFTR проводили реакцию ПЦР с использованием панели праймеров VariFindTM Neoscreen assay («ParseqLab», Россия) и термоциклера Veriti 96-well («Applied Biosystems», CШA). Необходимое количество ДНК составляло 3,3 нг/мкл.

Создание библиотек и секвенирование. Создание библиотек осуществляли с использованием набора Ion Ampliseq Library Kit («Life Technologies», США). Клональную амплификацию фрагментов ДНК методом эмульсионной ПЦР с последующим обогащением фракции сработавших сфер проводили с использованием набора Template OT2 Reaction Kit и прибора One Touch 2 c модулем ES («Life Technologies Thermo Fisher Scientific»). Для секвенирования использовали чипы Ion 318 Chip Kit v2 («Life Technologies Thermo Fisher Scientific»). Секвенирование ДНК проводили с использованием платформы Ion PGM («Life Technologies») в сочетании с настраиваемым автоматизированным биоинформатическим источником информации для анализа и интерпретации данных VariFind v.6.0 («ParseqLab», Россия). По результатам анализа в случае обнаружения клинически значимых мутаций формировали отчет об исследовании, который служил материалом для интерпретации и постановки диагноза врачом-генетиком.

Статистический анализ данных. Анализ результатов проводили с использованием языка программирования R (R version 3.2.1) и пакета epiR 0.9−74.

При сравнении стандартного и предложенного алгоритмов диагностики были выбраны следующие статистические оценки точности классификации: чувствительность, специфичность, прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов, диагностическая эффективность. Для первых четырех оценок были вычислены точные биномиальные доверительные интервалы с 95% уровнем доверия. Для доверительных интервалов диагностической эффективности использовали нормальную аппроксимацию. Для оценки NGS-метода был принят бинарный критерий: при наличии двух мутаций в исследуемом гене (CFTR-МВ, PAH-ФКУ, GALT-ГАЛ) результат считали положительным, а в любом другом случае — отрицательным. В процессе сравнения также использовали данные об окончательном диагнозе обследуемых пациентов, полученных из заключения врача-генетика. Положительный результат NGS у пациента с соответствующим подтвержденным врачом-генетиком диагнозом считали истинно положительным. В случае, если при дальнейшем обследовании диагноз не подтверждался, — ложноположительным. Соответственно отрицательный результат NGS у пациента с неподтвержденным диагнозом считали истинно отрицательным, а отрицательный результат NGS с подтвержденным впоследствии диагнозом был определен как ложноотрицательный.

При проведении молекулярно-генетического анализа методом NGS 123 образцов сухих пятен крови с повышенными значениями ИРТ2 были получены следующие результаты: в 23 образцах идентифицированы 2 патогенные мутации; в 40 образцах — 1 патогенная мутация; в 60 образцах патогенных мутаций обнаружено не было (табл. 1).

При сравнении двух алгоритмов использовали принятые пороги для ИРТ-теста (70 нг/мл для ИРТ1; 40 нг/мл для ИРТ2). Образец, имеющий данные о результатах двух ИРТ-анализов, превышающих принятые пороги, считали положительным, в противном случае — отрицательным.

При расчетах диагностической информативности получены следующие данные:

а) для стандартного алгоритма:

1) чувствительность: 0,91 (95% ДИ: 0,72—0,99); 2) специфичность: 0,88 (95% ДИ: 0,8—0,94); 3) прогностическая ценность положительного результата: 0,64 (95% ДИ: 0,5—0,75); 4) прогностическая ценность отрицательного результата: 0,98 (95% ДИ: 0,92—0,99); 5) отношение правдоподобия для положительного результата: 7,61 (95% ДИ: 4,41—13,13); 6) отношение правдоподобия для отрицательного результата: 0,1 (95% ДИ: 0,03—0,37); 7) преваленс: 0,19 (95% ДИ:0,1—0,94); 8) диагностическая эффективность: 0,89 (95% ДИ: 0,83—0,94).

б) для алгоритма, основанного на NGS:

1) чувствительность: 1,0 (95% ДИ: 0,85—1,0); 2) специфичность: 1,0 (95% ДИ: 0,96—1,0); 3) прогностическая ценность положительного результата: 1,0 (95% ДИ: 0,88—1,0); 4) прогностическая ценность отрицательного результата: 1,0 (95% ДИ: 0,97—1,0); 5) преваленс 0,19 (95% ДИ: 0,13—0,26); 6) отношение правдоподобия положительных результатов теста: Inf (NaN); 7) отношение правдоподобия отрицательных результатов теста: 0,0 (0,00, NaN); 8) диагностическая эффективность: 1,0 (95% ДИ: 0,96 —1,0).

Несмотря на небольшой объем выборки и несбалансированность классов (априорно оцененный риск МВ в славянской популяции приблизительно равен 1 из 10 000 человек), проведенный статистический анализ показал превосходство основанного на NGS метода над традиционным методом диагностики.

В результате анализа методом NGS 27 образцов сухих пятен крови в группе обследуемых на ФКУ получены следующие результаты: в 17 образцах идентифицированы 2 патогенные му-тации; в 3 образцах — 1 патогенная мутация; в 7 образцах патогенных мутаций не обнаружено (табл. 2).

Сравнение традиционного метода диагностики ФКУ и основанного на NGS метода было проведено аналогично, с использованием двух ФА-тестов и порога в 122 мкмоль/л.

Полученные результаты:

а) для традиционного алгоритма:

1) чувствительность: 1,0 (95% ДИ: 0,80—1,0); 2) специфичность: 0,2 (95% ДИ: 0,02—0,56); 3) прогностическая ценность положительного результата: 0,63 (95% ДИ: 0,42—0,81); 4) прогностическая ценность отрицательного результата: 1,0; 5) преваленс 0,63 (95% ДИ: 0,45—0,81); 6) отношение правдоподобия положительных результатов теста: 1,25 (95% ДИ: 0,92—1,7); 7) отношение правдоподобия отрицательных результатов теста: 0,0 (0,00, NaN); 8) диагностическая эффективность: 0,7 (95% ДИ: 0,53—0,88).

б) для алгоритма, основанного на NGS:

1) чувствительность: 1,0 (95% CI: 0,80—1,0); 2) специфичность: 1,0 (95% CI: 0,69—1,0); 3) прогностическая ценность положительного результата: 1,0 (95% CI: 0,77—1,0); 4) прогностическая ценность отрицательного результата: 1,0 (95% CI: 0,66—1,0); 5) преваленс 0,63 (95% CI: 0,42—0,81); 6) отношение правдоподобия положительных результатов теста: Inf (NaN); 7) отношение правдоподобия отрицательных результатов теста: 0,0 (0,00, NaN); 8) диагностическая эффективность: 1,0 (95% CI: 0,85—1,0).

Преимущества основанного на NGS метода были показаны и для диагностики ФКУ.

Выборка из популяции образцов с повышенным значением ГАО2 состояла из 41 образца, все они были исследованы с помощью основанного на NGS алгоритма. В 3 образцах выявлены 2 патогенные мутации (генотипы: Q188R/K285N, IVS3−2A>C/Q188R, P66L/Q188R), в 18 образцах обнаружена 1 патогенная мутация, в 20 случаях патогенных мутаций не обнаружено. При сравнении традиционного метода диагностики ГАЛ и основанного на NGS метода также использовались два теста ГАО и порог в 390 мкмоль/л.

Полученные результаты:

а) для традиционного алгоритма:

1) чувствительность: 0,67 (95% ДИ: 0,09—0,99); 2) специфичность: 0,05 (95% ДИ: 0,01—0,18); 3) прогностическая ценность положительного результата: 0,06 (95% ДИ: 0,02—0,11); 4) прогностическая ценность отрицательного результата: 0,67 (95% ДИ: 0,20—0,94); 5) преваленс 0,08 (95% ДИ: 0,02 —0,21); 6) отношение правдоподобия положительных результатов теста: 0,7 (95% ДИ: 0,32—1,57); 7) отношение правдоподобия отрицательных результатов теста: 6,33 (95% ДИ: 0,78—51,36); 8) диагностическая эффективность: 0,1 (95% ДИ: 0,01—0,20).

б) для алгоритма, основанного на NGS:

1) чувствительность: 1,0 (95% ДИ: 0,29—1,0); 2) специфичность: 1,0 (95% ДИ: 0,91—1,0); 3) прогностическая ценность положительного результата: 1,0 (95% ДИ: 0,31—0,97); 4) прогностическая ценность отрицательного результата: 1,0 (95% ДИ: 0,89—1,0); 5) преваленс 0,07 (95% ДИ: 0,02—0,21); 6) отношение правдоподобия положительных результатов теста: Inf (NaN); 7) отношение правдоподобия отрицательных результатов теста: 0,0 (0,00, NaN); 8) диагностическая эффективность: 1,0 (95% ДИ: 0,89—1,0).

Исходя из вычисленных значений показателей информативности диагностических методов, можно сделать вывод, что существующий протокол диагностики ГАЛ при условии положительного результата первой пробы имеет низкие диагностические показатели. Иными словами, вторая проба ГАО2 является практически бесполезной для диагностики.

Таким образом, основанный на NGS метод превзошел традиционные методы диагностики для всех трех рассмотренных заболеваний.

Важность проведения скрининга для своевременного выявления генетических заболеваний у новорожденных доказана со времен его внедрения — более 50 лет назад. Профилактическая направленность скрининга подразумевает идентификацию бессимптомных детей и последующее проведение подтверждающих тестов (биохимических или генетических). В то время как дети, у которых симптомы уже проявились, сначала проходят первичную клиническую оценку и последовательное диагностическое тестирование на основании представления анамнеза заболевания или клинических заключений, что способствует снижению скорости постановки диагноза и ограничивает диагностическую эффективность [15, 16]. Появление технологии NGS создает беспрецедентные возможности проведения полного скрининга наследственных заболеваний. Таргетное секвенирование следующего поколения (TNGS) является перспективным методом экономически эффективного решения диагностического тестирования новорожденных второго уровня, благодаря возможности выборочного секвенирования геномных областей, представляющих интерес, как правило, экзонов. Такое селективное исследование ДНК имеет преимущества экспресс-теста (TAT 4,5 рабочих дня), более низкую стоимость, а кроме того, позволяет избежать этических проблем, связанных с полногеномным секвенированием.

В то время как использование ДНК-диагностики на первом этапе скрининга новорожденных в силу объективных причин не рекомендовано экспертами Американского общества медицинских генетиков, применение секвенирования на этапе подтверждения диагноза доказывает свою эффективность на примере скрининговых программ некоторых стран [17]. Во избежание задержек в диагностике и для минимизирования последовательных анализов имеет практический смысл использование мультигенных панелей. «Время оборота теста» (ТАТ) разработанных методических подходов с использованием комплексных экспресс-панелей для тестов второго этапа НС, включающих несколько генетических расстройств, приближается к 2—3 дням. Несомненным преимуществом NGS для массового обследования является то, что в зависимости от характеристик используемой панели за одну реакцию может быть протестировано от 8 до 48 образцов в течение 105 ч (примерно 4,5 рабочих дня). Еще одним немаловажным фактором, существенно упрощающим и удешевляющим процесс анализа, является достаточность количества ДНК, выделенной из образцов сухих пятен крови, для генетических исследований.

Указанные преимущества могут способствовать возможности централизованного использования тестов NGS при обследовании новорожденных на наследственные заболевания.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.