Использование гетеродуплексного анализа и пиросеквенирования в алгоритме диагностики истинной полицитемии, ассоциированной с соматическими мутациями в 12 экзоне гена JAK2

Ключевым звеном патогенеза хронических миелопролиферативных опухолей (ХМО), в том числе и истинной полицитемии (ИП), является независимая от эритропоэтина активация JAK-STAT сигнального пути. По данным разных авторов, в 77—97% случаев развитие ИП обусловлено мутацией V617 °F в 14-м экзоне гена JAK2 [1—5]. В остальных случаях, чаще всего обнаруживаются мутации, происходящие в онкоассоциированной последовательности 12-го экзона гена JAK2. Согласно базе данных COSMIC [6], в последовательности 12-го экзона гена JAK2 описано более 40 соматических мутаций (микроделеции, микроинсерции и точечные мутации, затрагивающие аминокислотные остатки в положениях 533—547 белка Jak2), имеющих клиническое значение для подтверждения диагноза ИП [7] (рис. 1). Следует отметить, что мутации в 12-м экзоне гена JAK2 высокоспецифичны для диагноза ИП и в отличие от мутации V617 °F не встречаются при других ХМО. В соответствии с клиническими рекомендациями ВОЗ [8] и РФ [9] выявление мутации JAK2 в сочетании с повышенным содержанием гемоглобина и повышенным гематокритом позволяет диагностировать И.П. Для обнаружения мутаций в 12-м экзоне гена JAK2, как правило, используют методы секвенирования. Ранее нами был разработан количественный анализ мутаций в 12-м экзоне гена JAK2 с использованием пиросеквенатора PyroMark Q24 [10, 11]. Вместе с тем метод пиросеквенирования для всех V617F-отрицательных пациентов с подозрением на ИП требует серьезных финансовых затрат. В связи с этим актуально предварительное проведение менее дорогостоящего скринингового теста, позволяющего отсеять пробы с минимальной вероятностью искомой мутации. На наш взгляд, таким скрининговым методом может стать гетеродуплексный анализ с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ).

Цель — разработать метод выявления мутаций в 12-м экзоне гена JAK2, основанный на гетеродуплексном анализе с последующим электрофорезом в ПААГ.

В работе были использованы образцы венозной крови 140 пациентов: 28 женщин (средний возраст 53,1±14,9 года) и 112 мужчин (средний возраст 44,2±15,2 года), направленных врачами-гематологами в лабораторию Красноярского филиала ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России.

Для первичной оценки возможности использования метода, предусматривающего ПЦР-амплификацию фрагмента ДНК 12-го экзона гена JAK2 с образованием гетеродуплексов и последующего электрофореза в вертикальном ПААГ, были выбраны 5 образцов ДНК, полученных в разные периоды заболевания от пациента № 1 с ранее выявленной мутацией N542-E543del (c.1624_1629delAATGAA), и 3 образца ДНК, полученные в разные периоды заболевания от пациента № 2 с ранее выявленной мутацией I540-E543delinsKK (с.1619_1627 TCAgAAATg

Для дальнейшей работы использовали алгоритм, предусматривающий проведение скринингового теста методом гетеродуплексного анализа с электрофоретической детекцией в ПААГ и последующее пиросеквенирование.

Амплификацию проводили с использованием набора реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии EVAGreen («Синтол», Москва) и праймеров, заимствованных из статьи А. Jones и соавт. 2008 [12] и фланкирующих участок длиной 126 пар оснований (п.о.), включающих нуклеотиды как 12-го экзона, так и 12-го интрона гена JAK2 (прямой: 5’-AATGGTGTTTCTGATGTACC-3’ и обратный: 5’-AGACAGTAATGAGTATCTAATGAC-3’). Количество вносимой ДНК в реакционную пробу составило 30—40 нг. ПЦР с дополнительным этапом для образования гетеродуплексов проводили на приборе CFX-96 («Bio-Rad», США) по следующей программе: 3 мин — 95 °C; 40 циклов: 6 с — 95 °C, 6 с — 58 °C, 6 с — 72 °C, 6 с — 75 °C; цикл образования гетеродуплексов: 1 мин — 96 °C, 1 мин — 60 °C. Далее с продуктами амплификации проводили электрофорез в 8% вертикальном ПААГ (акриламид и бисакриламид в соотношении 29:1) в ТВЕ-буфере. Детекцию результатов проводили путем окрашивания ПААГ бромистым этидием в течение 7—10 мин с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете c использованием системы гель-документирования Gel Doc («Bio-Rad», США). Соответствие молекулярных весов продуктов амплификации оценивали с помощью маркера молекулярного веса pUC19/Msp I (размер фрагментов от 501 до 34 п.о.). Заключение о наличии мутаций в 12-м экзоне гена JAK2 в гетерозиготном состоянии составляли по образованию дополнительных полос в геле, имеющих электрофоретическую подвижность фрагментов ДНК длиной более 126 п.о., и соответствующих гетеродуплексам, которые не выявляются в образцах ДНК, не содержащих искомые мутации.

Подтверждение выявленных мутаций проводили методом пиросеквенирования в количественном формате на приборе PyroMark Q24 («Qiagen», Германия) с использованием программного обеспечения PyroMark Q24 2.0.6 в формате SQA (секвенирование неизвестных последовательностей) и AQ (количественное определение мутаций, таких как SNP и InDel) как было описано ранее [10, 11, 13].

На рис. 2 приведена электрофореграмма с результатами анализа мутаций в 12-м экзоне гена JAK2 для двух пациентов с диагнозом ИП в динамике заболевания. Для обоих пациентов диагноз ИП был подтвержден морфологическим исследованием биоптата костного мозга. Количественный анализ уровня аллельной нагрузки соматическими мутациями N542-E543del для первого пациента и I540-E543delinsKK для второго пациента в динамике заболевания проведен ранее методом пиросеквенирования. Согласно информации, представленной в базе данных COSMIC [6], обе выявленные мутации находятся в онкоассоциированной последовательности 12-го экзона гена JAK2 и ранее были описаны в литературе как ассоциированные с развитием И.П. Также важно отметить, что обе мутации приводят к делеции шести нуклеотидов в последовательности 12-го экзона гена JAK2.

При анализе полученной электрофореграммы на дорожках от обеих проб, имеющих мутации, четко визуализируется основной фрагмент, соответствующий дикому типу — 126 п.о., а ниже — тонкой полосой — продукты, соответствующие мутантным аллелям, на уровне 120 п.о. Кроме того, визуализируются по 2 дополнительные полосы выше фрагмента дикого типа, соответствующие гетеродуплексам (на уровне примерно 200 и 250 п.о. для пациента с мутацией N542-E543del и на уровне примерно 180 и 200 п.о. для пациента с мутацией I540-E543delinsKK), образованным сочетанием фрагментов дикого и мутантного типов аллелей. Таким образом, на образцах проб пациентов с клинически и морфологически подтвержденным диагнозом показано совпадение положительных результатов в гетеродуплексном анализе с результатами последующего пиросиквенирования.

Всего в ходе работы гетеродуплексный анализ в качестве скринингового метода был проведен для 140 пациентов с подозрением на ИП и отсутствием мутации V617 °F. К настоящему времени мутации в 12-м экзоне гена JAK2 с использованием предлагаемой технологии выявлены еще у двух пациентов (№ 3 и № 4). ДНК пациента № 3 также проанализирована методом пиросеквенирования, определена мутация N542_E543del (c.1623_1628delAAATGA), уровень аллельной нагрузки составил 11%. Фенотипически обнаруженная мутация аналогична мутации N542-E543del (c.1624_1629delAATGAA), обнаруженной ранее у пациента № 1, но на уровне нуклеотидов выпадающий гексануклеотид смещен на один нуклеотид влево. У пациента № 4 методом пиросеквенирования определена мутация R541_E543>K (c.1622_1627delGAAATG), уровень аллельной нагрузки в динамике заболевания составил 20 и 50%.

При анализе литературы, посвященной методам анализа мутаций в 12-м экзоне гена JAK2, мы не встретили работ, в которых бы использовался метод гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ. В 2012 г. была опубликована работа, в которой авторы показали возможность использования гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в 4% агарозном геле для анализа мутаций в 12-м экзоне гена JAK2 [14]. Но нужно отметить, что при данном подходе разрешающая способность агарозного геля позволяет увидеть полосы, соответствующие гетеродуплексам, но не позволяет увидеть полосы, соответствующие продуктам, содержащим мутантный аллель, что, на наш взгляд, несколько ограничивает использование такого метода.

В качестве предварительного скринингового теста предлагается также использование метода HRM (метод анализа кривых плавления с высокой разрешающей способностью) [12]. Вместе с тем метод HRM требует наличия определенного оборудования и специального программного обеспечения, что в отличие от электрофореза не всегда доступно для клинико-диагностических лабораторий.

Таким образом, использование метода гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ позволяет выявлять высокоспецифичные для диагноза ИП мутации в 12-м экзоне гена JAK2.

В настоящем исследовании показана возможность использования метода гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ для выявления ИП-специфических мутаций в 12-м экзоне гена JAK2. Включение данного метода в алгоритм лабораторного тестирования позволяет повысить эффективность и доступность молекулярно-генетических технологий диагностики ХМО.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Источники финансирования: бюджетная программа СФУ; ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора; НИР КНЦ СО РАН.