Проведение молекулярно-генетических исследований с использованием ДНК клеток опухоли, полученных из цитологических препаратов

В настоящее время молекулярно-генетические методы все шире используются для диагностики, прогноза и выбора оптимальной терапии при онкологических заболеваниях. Успехи молекулярной онкологии привели к созданию таргетных препаратов, воздействующих на внутриклеточные молекулярные мишени опухолевой клетки. Наиболее демонстративны успехи таргетной терапии при немелкоклеточном раке легкого, колоректальном раке, гастроинтестинальных стромальных опухолях, раке молочной железы, меланоме и других опухолях [4].

Одним из объектов, наиболее изученных в последние годы в качестве противоопухолевой мишени, является рецептор эпидермального фактора роста (EGFR). Открытие соматических мутаций гена EGFR явилось ключевым моментом в разработке стратегии лечения немелкоклеточного рака легкого и привело к появлению нового молекулярного показателя чувствительности опухоли легкого к ингибиторам тирозинкиназ [17, 19]. В 2004 г. в научной литературе появились сообщения об активирующих соматических мутациях в рецепторе эпидермального фактора роста.

Исследователи обнаружили, что практически у всех пациентов, получающих положительный эффект от лечения гефитинибом и эрлотинибом, обнаружены мутации гена EGFR в ткани опухоли [16, 17]. При немелкоклеточном раке легкого пациенты с активирующими мутациями в гене EGFR, которые могут рассчитывать на выраженный эффект от назначения ингибиторов тирозинкиназы EGFR, составляют 10% [7]. Назначение таргетных препаратов эрлотиниб, афатиниб и гефитиниб показано только тем больным, у которых в опухолевых клетках выявляется мишень действия этих препаратов [16, 21].

Другим изученным объектом являются мутации генов BRCA½, которые приводят к повышению риска возникновения некоторых злокачественных новообразований — рак молочной железы, яичника, предстательной и поджелудочной желез [9, 15]. BRCA1-ассоциированный рак молочной железы характеризуется резистентностью к «золотому стандарту» терапии — препаратам из группы таксанов [3, 9]. В то же время рак молочной железы у BRCA1-гетерозиготных пациентов демонстрирует исключительно выраженный регресс при лечении цисплатином [9,15]. Данный факт позволяет персонализировать процесс лечения и определять прогноз заболевания.

В последнее время появились работы о новых возможностях применения эффективной таргетной терапии при BRCA-ассоциированном раке яичника [1]. При раке яичника мутации генов BRCA½ выявляют в 10—15% наблюдений [3]. В российской популяции превалируют мутации в гене BRCA1, которые составляют около 80% от общего количества мутаций в генах BRCA½, в то время как мутации, идентифицированные в гене BRCA2 (за исключением 6174delT), не так распространены [1]. Назначение новых таргетных препаратов, таких как олапариб для поддерживающего лечения пациенток с рецидивом High Grade серозного рака яичника, показано только пациенткам с мутацией генов BRCA, у которых регистрировался ответ на терапию препаратами платины [12]. Серозный рак яичника Low Grade составляет менее 5% всех карцином яичника. Для этой формы рака характерны в 8% мутации генов BRAF и в 19% — KRAS [20]. У пациенток с мутацией гена BRAF V600, ранее получивших несколько линий химиотерапии, лечение вемурафенибом обеспечивает стойкий симптоматический, радиологический и биохимический ответ [10]. Перечисленные выше препараты объединяет наличие определенной молекулярной мишени в опухолевой клетке. В настоящее время в научных и клинических исследованиях ведется поиск биомаркеров эффективности новых препаратов, что становится основной тенденцией в развитии терапии рака яичника.

Для назначения таргетных препаратов необходима точная диагностика с определением наличия мутаций в клетках опухоли. Для этого в настоящее время существует арсенал различных современных методов молекулярно-генетических исследований. Для детекции известных мутаций в России наибольшее распространение получили методы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также методы с использованием биологических микрочипов [5]. В качестве материала для молекулярно-генетического исследования могут использоваться самые различные биологические образцы — ткань опухоли, кровь, цитологические мазки-отпечатки, выпотная жидкость и т. д. [2]. Наиболее часто анализ выполняется непосредственно на фрагментах опухолевой ткани, полученных в ходе операции или биопсии [2]. В научной литературе с использованием поиска в MEDLINE нами обнаружены результаты успешного использования цитологического материала и клеточных блоков для исследования мутаций гена EGFR в немелкоклеточном раке легкого, полученные исследователями из США, Великобритании, Италии, Сингапура и Австралии (2009—2015 гг.) [8, 11, 13, 14, 18, 22, 23]. Авторами установлено, что цитологический материал, полученный при пункции опухолевых образований, а также клетки опухоли из плевральной жидкости могут успешно использоваться для определения статуса мутаций гена EGFR при условии применения чувствительных методов тестирования.

В отечественной научной литературе отмечены немногочисленные работы по результатам использования цитологических препаратов с целью получения ДНК из клеток опухоли для проведения молекулярно-генетических исследований. Так, в работе Н.В. Митюшкиной и соавт. показано, что цитологический материал пригоден для всех разновидностей молекулярно-генетического анализа — как ДНК-, так и РНК-тестов [6]. Цитологические образцы могут быть представлены в виде окрашенных цитологических стекол, цитоблоков, препаратов, приготовленных с помощью цитоцентрифуги и т. д. Для проведения молекулярного тестирования обычно достаточно всего одного стекла, содержащего не менее 50 опухолевых клеток; в затруднительных ситуациях рекомендуется направлять на исследование несколько цитологических стекол [2, 6].

Цель работы: оценить возможности проведения молекулярно-генетических исследований с использованием ДНК клеток опухоли, полученных из цитологических препаратов.

В исследование были включены 113 пациентов, пролеченных в КГБУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер» в 2014—2015 гг. Использованы клинические данные пациентов и образцы их ДНК, выделенные из цитологических препаратов. Цитологические образцы были получены из материала, взятого при бронхоскопии (n=67), плевральной (n=5) и асцитической (n=25) жидкостей, пункции через задний свод влагалища (n=8) и пункции лимфатических узлов (n=8): паховых (2), забрюшинных (2), аксиллярных (2) и надключичных (2).

При исследовании жидкостей изготавливали препараты с помощью традиционного центрифугирования и с использованием центрифуги Cytospin-4; препараты окрашивали по методу Паппенгейма.

В цитологических препаратах оценивали количество опухолевых клеток и их процентное соотношение с остальным клеточным материалом (Consensus for EGFR mutation testing in NSCLC. Results of European Workshop, J Thor Onc 2010). Отобранные комплексы клеток опухоли на стеклопрепарате отмечали маркером. Клеточный материал растворяли каплей лизирующего раствора и отбирали пипеткой в пробирку типа Эппендорф. ДНК, полученную из цитологических препаратов, выделяли с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit («Qiagen», Германия) по стандартным протоколам, в автоматическом режиме на станции QIAcube. Молекулярно-генетическое исследование материала осуществляли методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени. При этом на первом этапе проводили оценку пригодности полученных образцов ДНК в контрольной ПЦР (в соответствии со стандартным протоколом производителя). Полученные кривые накопления ПЦР-продукта в образцах сопоставляли со стандартами ДНК без мутации в исследуемом гене (отрицательный ДНК-стандарт входящей в набор для постановки ПЦР-реакции, где амплифицируется константный район исследуемого гена). В работе также использовали контроль без матрицы (вода), для учета уровня фона ПЦР-реакции. Таким образом, качество и количество ДНК оценивалось по величине Ct, которая соответствует количеству циклов ПЦР, при которых кривая флуоресценции пересекает заданный уровень фона (т.е. не менее 2 нг очищенной ДНК в образце). На следующем этапе, для дальнейшей аллель-специфической ПЦР, использовали только ДНК-образцы, которые имели величину Ct, сопоставимую с Ct отрицательного ДНК-стандарта. Оценивали статус генов EGFR, BRCA½, KRAS, BRAF. В случае исследования генов BRCA½ ПЦР-реакцию проводили в один этап с одновременным сопоставлением с отрицательным и положительным ДНК-стандартами.

Определение статуса гена EGFR осуществляли методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени с помощью набора EGFR RGQ PCR Kit (Германия) на приборе CFX-96 (США). Исследовалимутации: 18 ex.(G719X); del19 ex.; 20ex.(T790M, S768I, ins); 21 ex.(L858R, L861Q).

Статус гена EGFR изучен у 75 пациентов с цитологическим диагнозом аденокарциномы легкого. На начальном этапе выполнения работы отобран цитологический материал 20 пациентов с установленным диагнозом рака легкого двумя морфологическими методами — гистологическим и цитологическим. При этом на гистологическом материале ранее были выполнены ПЦР-исследования с определением статуса гена EGFR. Полученные результаты определения мутаций из гистологического и цитологического материала были сопоставлены. В последующем у 55 пациентов определение статуса гена EGFR проводили только на образцах ДНК, выделенной из цитологического материала, так как он являлся единственно доступным для исследования.

В группе пациенток (n=38) с серозной карциномой яичников проводили исследование генов BRCA½, BRAF, KRAS. Мутации в генах BRCA½, BRAF, KRAS также детектировали методом аллель-специфической ПЦР с помощью наборов: real-time-PCR, производства ООО «Биолинк» (Россия), на приборе CFX-96 (США). Исследовали следующие мутации: в гене BRCA1 — 5382insC, 4153delA, 185delAG, T300G; в гене BRCA2 — 6174delT; в гене KRAS — G12C, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A, G13D и V600E гена BRAF.

Процедура получения цитологического образца менее инвазивна, проводится на догоспитальном этапе обследования больного и часто является терапевтической процедурой, (например, удаление жидкости из плевральной и асцитической полости). Исследования статуса гена EGFR изучены у 16 женщин и 59 мужчин с установленным цитологическим диагнозом «аденокарцинома легкого» в возрасте от 43 до 77 лет (60,33±17,13 года).

При исследовании ДНК, выделенной из гистологических блоков, обнаружены мутации гена EGFR в 8 из 20 случаев. Высокая частота встречаемости мутированного гена EGFR объясняется целенаправленным отбором пациентов в группу исследования с целью экспериментальной отработки методики определения мутаций из цитологического материала. При исследовании ДНК, выделенной из архивного цитологического материала этих же пациентов, в 18 из 20 наблюдений отмечено совпадение результатов молекулярно-генетического исследования — 90,0%. В 2 (10,0%) случаях результаты исследования гистологических и цитологических образцов не совпали, у этих больных цитологический материал содержал малое количество опухолевых клеток (менее 100). В дальнейшем молекулярно-генетический анализ проводили только на образцах ДНК, выделенной из цитологического материала, содержащего более 200 опухолевых клеток. У остальных 55 пациентов с аденокарциномой легкого для молекулярно-генетического исследования был доступен только цитологический материал, полученный при бронхоскопии (n=47), плевральной жидкости (n=5), лимфатических узлов (n=3). Мутации гена EGFR обнаружены в 6 (10,9%) наблюдениях, в числе которых выявлена точечная мутация L858R (3 наблюдения) и делеции 19 экзона (3 наблюдения).

В группе пациенток с серозной карциномой яичника для молекулярно-генетического исследования использовали цитологический материал асцитической жидкости (n=25), пунктатов через задний свод влагалища (n=8), лимфатических узлов (n=5). По цитологической картине пациентки с серозной карциномой яичника были разделены на группы High Grade (n=31) и Low Grade (n=7). Пациентки первой группы были почти на 10 лет старше пациенток второй группы (60,73±10,47 и 51,29±21,35 года соответственно) (рис. 1).

Для генетического исследования пригодным был материал 35 (92,1%) пациенток, так как в трех случаях концентрация полученной ДНК была недостаточной. В результате проведенных молекулярно-генетических исследований во всех образцах мутация V600E в гене BRAF не обнаружена.

В группе пациенток Low Grade серозной карциномы яичника (рис. 2) генетическая поломка в гене KRAS обнаружена у 5 (71,4%) из 7 женщин, у 4 из них выявлена мутация G12V и у одной — G12D (рис. 3); мутации гена BRCA1 во всех наблюдениях отсутствовали.

В группе High Grade серозной карциномы яичника (рис. 4) были обнаружены только мутации в гене BRCA1 — 4 наблюдения из 28 (14,3%), которые были представлены в трех наблюдениях мутацией 5382insC, в одном — T300G (рис. 5).

В практической работе использование цитологического материала для молекулярно-генетического тестирования особенно актуально, когда доступен лишь цитологический материал. Проведенное исследование показало, что цитологический материал в большинстве случаев является достаточным для тестирования мутаций у пациентов с немелкоклеточным раком легкого и серозной карциномой яичника. С учетом перспективы дальнейшего использования молекулярно-генетических исследований специалисты клинической лабораторной диагностики должны знать об ограничениях использования цитологического материала для поиска мутаций в клетках опухоли и рассматривать каждый конкретный случай с акцентом на достаточное количество материала для получения ДНК. При этом необходима дальнейшая стандартизация данного лабораторного теста.

В эру персонализированной терапии с применением таргетных препаратов для установления точного диагноза важное значение имеет взаимодействие хирургов, цитологов и врачей лаборатории молекулярной диагностики.

Цитологические препараты с наличием достаточного количества клеток опухоли (не менее 200), приготовленные из материала асцитической, плевральной жидкостей, пунктатов лимфатических узлов и пунктатов через задний свод влагалища, а также полученные при бронхоскопии, в большинстве случаев являются полноценным материалом для молекулярно-генетических исследований.

Использование цитологического материала для молекулярно-генетических исследований оправдано для пациентов с местно-распространенным или диссеминированным процессом, у которых цитологический материал является единственно доступным морфологическим материалом для исследования.

Мутации гена EGFR обнаружены в 10,9% наблюдений, в числе которых выявлена точечная мутация L858R (3 наблюдения) и делеции в экзоне 19 (3 наблюдения).

В клетках Low Grade серозной карциномы мутации гена KRAS обнаружены в 71,4% случаев.

Мутации гена BRCA1 отмечены у 14,3% пациенток с High Grade серозной карциномы.