Выявление лекарственной устойчивости ВИЧ - важный компонент клинического ведения ВИЧ-инфицированных пациентов, особенно тех, кто получает антиретровирусную терапию [1]. Наиболее распространены методы, основанные на секвенировании генов - мишеней антиретровирусной терапии ВИЧ, позволяющие получать информацию о наличии мутаций, ответственных за развитие лекарственной устойчивости.

В России зарегистрированы и применяются 3 тест-системы на основе метода секвенирования: ViroSeq HIV-1 Genotyping System («Abbott», США), АмплиСенс-ВИЧ-генотип-Eph (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) и TruGene HIV1 genotyping kit («Siemens», Германия).

Процедура выявления мутаций устойчивости, мало различающаяся у разных производителей тест-систем, состоит из нескольких этапов, часть из которых достаточно трудоемкие. Качество исследований во многом зависит от профессиональной подготовки сотрудников, правильной организации работы и лаборатории. Поскольку правильность полученных результатов влияет на дальнейшую тактику врача по изменению схемы терапии, очень важно, чтобы лаборатории, выполняющие подобные исследования, проходили сертификацию (аккредитацию).

С целью аккредитации лаборатории Референс-центра по мониторингу ВИЧ и ВИЧ-ассоциированных инфекций (на базе ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора) в качестве Национальной референс-лаборатории ВОЗ по определению лекарственной устойчивости ВИЧ были протестированы рекомендованные ВОЗ контрольные панели из VQA (Virology Quality Assessment) Program (Программа по контролю качества вирусологических исследований).

Контрольные панели GEN012.DR и GEN014.DR из VQA Program, предназначенные для контроля качества исследований лекарственной устойчивости ВИЧ. Состав панелей отражен в (табл. 1 и 2).

Образцы панели представляли собой плазму крови. Субтип ВИЧ в образцах был определен в ходе настоящей работы.

Методы анализа. Каждая панель проанализирована с помощью двух тест-систем: ViroSeg HIV-1 Genotyping System («Эбботт», США) и АмплиСенс-ВИЧ-генотип-Eph (ФБУН ЦНИИЭ, Россия) согласно инструкциям производителей. Для выявления продуктов реакции секвенирования использовали прибор ABI Prism 3100 («Applied Biosystems», США).

Анализ результатов. Полученные результаты загружали на сайт Frontier Science https://www.fstrf.org/, где осуществлялся их автоматический анализ. Frontier Science является некоммерческим научно-исследовательским фондом, одна из задач которого - содействие в применении статистических методов в науке и практике. Фонд разработал систему управления лабораторными данными (Laboratory Data Management System), которая используется для сбора информации об образцах, результатах анализа, а также позволяет управлять этой информацией в пределах нескольких исследовательских сетей.

На основании результатов, полученных от всех лабораторий-участников, формировалась референсная последовательность. Для каждого образца панели существовало три типа референсных последовательностей в зависимости от используемой тест-системы: ViroSeq HIV-1 genotype System, TruGene HIV-genotyping test и in-house тесты. Тест-система АмплиСенс-ВИЧ-генотип-Eph оценивалась как in-house тест.

Сравнение с референсной последовательностью проводили по специальному алгоритму выявления ошибок с системой присвоения штрафных баллов. Выявление ошибок в последовательностях проводили в 3 этапа. На 1-м этапе определяли число ошибок в нуклеотидных последовательностях. Определяли 3 типа выявляемых ошибок: частичные несоответствия, полные несоответствия, недостающие данные. На 2-м этапе оценивали качество секвенирования. Для этого подсчитывали число только полных несоответствий анализируемой последовательности с референсной последовательностью. На 3-м этапе вычисляли число ошибок в аминокислотах в позициях возможного возникновения мутаций лекарственной устойчивости.

В дальнейшем для ошибок, выявленных на всех этапах, оценивали критерий значимости исходя из вероятности возникновения ошибки, которую рассчитывали с помощью статистической модели возможности возникновения этой ошибки. Исходя из значимости выявленных ошибок присваивали штрафные баллы. Затем суммировали количество штрафных баллов на каждом этапе для всех образцов панели и общее количество штрафных баллов для всех образцов панели на всех этапах.

Качество проведенного лабораторией исследования лекарственной устойчивости ВИЧ оценивали согласно следующем критериям:

- 0-7 штрафных баллов - лаборатория может быть сертифицирована на проведение анализа лекарственной устойчивости ВИЧ (уровень С - certified);

- 8-14 штрафных баллов - у лаборатории существует ряд проблем, однако она может быть условно сертифицирована (уровень PC - provisionally certified);

- 15-40 штрафных баллов - у лаборатории существенные проблемы с проведением исследования лекарственной устойчивости ВИЧ (уровень P - probation).

В 2008 г. лаборатория Референс-центра по мониторингу ВИЧ и ВИЧ-ассоциированных инфекций (на базе ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) была номинирована в качестве Национальной референс-лаборатории ВОЗ по определению лекарственной устойчивости ВИЧ. По результатам аккредитационного аудита лаборатория набрала 79 баллов из 100 возможных (проходным баллом считался 85), комиссия ВОЗ сделала ряд замечаний по организации работы, в частности по конфигурации рабочего пространства, и рекомендовала разработать схему лаборатории и стандартные операционные процедуры для каждого этапа анализа. Необходимым условием аккредитации лаборатории является также ежегодное участие в программах по оценке качества исследований, поэтому комиссия ВОЗ рекомендовала протестировать две контрольные панели из VQA Program, предназначенные для оценки качества исследования лекарственной устойчивости ВИЧ.

У лаборатории имелся опыт участия в программах по внешнему контролю качества лабораторных исследований. Так, в 2007 г., когда первая отечественная тест-система АмплиСенс ВИЧ-генотип-Eph была зарегистрирована на территории РФ [2], была протестирована панель образцов, содержащих ВИЧ, предоставленная организацией QCMD (Quality Control for Molecular Diagnostics, Великобритания). Эта тест-система состояла из 5 образцов плазмы крови, содержащих ВИЧ различных субтипов (табл. 3).

Результаты секвенирования этих образцов были отправлены для анализа в QCMD и позднее были получены отчеты (один отчет касался наших собственных результатов, второй представлял собой суммарный отчет по результатам всех участников данной программы).

При анализе данных, приведенных в отчете, выявлено два образца, в которых наблюдались несовпадения в результатах сиквенирования. Как оказалось, оба образца содержали смесь квазивидов ВИЧ, последовательности которых в четырех положениях гена протеазы (10, 20, 43 и 89) различались на 1-2 нуклеотида. Поскольку одна из последовательностей находилась в меньшем количестве по сравнению с другой, в результате секвенирования этих образцов были получены данные только по доминирующей в смеси последовательности. Дальнейший анализ результатов хроматограммы показал, что в указанных позициях наблюдалось по два пика, один из которых меньше другого и потому не распознавался программой в ходе расшифровки хроматограммы в нуклеотидную последовательность. Кроме того, выяснилось, что данная проблема связана с устаревшей версией программы (Sequencing Analysis 3.7, «Applied Biosystems», США ), которая была установлена на приборе ABI Prism 3100. Особенностью данной программы является возможность выявления только доминирующего пика. Использование более современной программы для расшифровки тех же хроматограмм позволило выявить все смешанные положения в образцах.

По данным суммарного отчета по результатам всех участников программы было показано, что частота совпадения наших результатов секвенирования с консенсусными данными составляет 99,72%.

Исходя из полученных результатов был сделан вывод о том, что основная проблема, с которой столкнулась наша лаборатория, заключается в недостаточно эффективной биоинформатической составляющей анализа. Была проведена модернизация тест-системы, которая состояла из следующих этапов:

1) введение дополнительных праймеров для секвенирования, позволяющих получить информацию о нуклеотидной последовательности двух цепей, что обеспечило большую надежность анализа;

2) создание программного обеспечения (ПО) Deona [3].

Разработанное ПО Deona позволяет конструировать результирующую нуклеотидную последовательность ВИЧ на основе электрофореграмм, полученных после проведения реакции секвенирования на приборе ABI Prism. В ПО создана внутренняя база данных референсных последовательностей, которая содержит нуклеотидные последовательности всех субтипов ВИЧ-1 и большинства рекомбинантных форм. При анализе результатов исследования каждому образцу ВИЧ из базы данных выбираются наиболее близкие по нуклеотидному составу референсные последовательности, что обеспечивает наиболее правильный алгоритм конструирования результирующей последовательности.

В ПО Deona реализован внутренний справочник позиций возможного возникновения мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ в виде «окна мутаций». Интерпретация результатов происходит через интеграцию с базой данных Стэндфордского университета, что позволяет всегда проводить виртуальное фенотипирование согласно актуальным на настоящий момент алгоритмам.

Контрольные панели из VQA Program были протестированы с помощью тест-системы АмплиСенс ВИЧ-генотип-Eph, которая претерпела вышеописанные изменения, а также с помощью тест-системы ViroSeq HIV-1 genotype System. Результаты тестирования образцов двух контрольных панелей с помощью двух тест-систем представлены в табл. 4 и 5.

По результатам успешного тестирования панелей GEN012.DR и GEN014.DR лаборатория Референс-центра по мониторингу ВИЧ и ВИЧ-ассоциированных инфекций была повторно номинирована на роль Национальной референс-лаборатории ВОЗ по определению лекарственной устойчивости ВИЧ в России с использованием двух тест-систем: ViroSeq HIV-1 Genotyping System и АмплиСенс-ВИЧ-генотип-Eph. В настоящее время лабораторный модуль создаваемой Национальной референс-лаборатории признан специалистами ВОЗ удовлетворительным, что позволило приступить к аккредитации эпидемиологического модуля.