Альтернативой для лечения пациентов с рецессивным дистрофическим буллезным эпидермолизом (РДБЭ) может служить применение мезенхимальных стволовых/стромальных клеток (МСК), которые могут быть получены из многих постнатальных тканей организма [1]. МСК — это негемопоэтические мультипотентные клетки мезодермального происхождения, впервые выделенные из костного мозга А.Я. Фриденштейном и соавт. [2] и охарактеризованные как популяция адгезивных клоногенных фибробластоподобных клеток, способных образовывать монослойную культуру. Впоследствии эти клетки были получены практически из всех тканей организма — кожи [3], десны [4], жировой ткани [5], пуповинной крови (ПК) [6] и др. МСК характеризуются рядом свойств, благодаря которым представляют большой интерес для регенеративной медицины: способности к самоподдержанию [7, 8] и дифференцировке в несколько клеточных линий [9, 10], способности синтезировать множество факторов роста/цитокинов, хемокинов, внеклеточных везикул/экзосом (способствующих восстановлению поврежденных тканей) [11], выраженным противовоспалительному и иммуномодулирующему потенциалам [12]. Эти свойства, а также простота выделения и размножения делают МСК идеальным кандидатом для лечения многих заболеваний [13, 14].

По данным реестра клинических испытаний (ClinicalTrials.gov), в настоящее время во всем мире проводится более 1300 клинических исследований (КИ), связанных с МСК, охватывающих более 300 заболеваний, большинство из которых — заболевания нервной, иммунной систем, опорно-двигательного аппарата, раны и травмы, сосудистые, ревматические и желудочно-кишечные заболевания [15]. Результаты этих КИ продемонстрировали, что МСК являются безопасным и эффективным терапевтическим инструментом, обеспечивающим новую стратегию лечения сложных мультисистемных заболеваний. МСК признаны в качестве клеточной терапии для восстановления кожи благодаря индукции процессов неоваскуляризации, иммуномодуляции и регенерации тканей посредством механизмов, основанных на паракринной и аутокринной передаче сигналов [16].

В статье обобщены механизмы, с помощью которых МСК способствуют заживлению ран при РДБЭ, а также противовоспалительному эффекту при системном введении, обсуждены результаты доклинических и клинических исследований.

Часть II. Актуальные стратегии применения мезенхимальных стромальных/стволовых клеток в терапии РДБЭ

Особый интерес к МСК вызван тем, что эти клетки обладают способностью секретировать множество ростовых факторов, цитокинов, хемокинов, экзосом, которые участвуют в восстановлении тканей посредством паракринного действия [17], выражающегося в активации миграции, дифференцировки и пролиферации эндогенных стволовых/прогениторных клеток [18], а также индукции васкулогенеза и подавлении апоптоза, предотвращая гибель клеток и тем самым способствуя восстановлению локального микроокружения данных клеток в поврежденных тканях [19, 20]. Они обладают противовоспалительным и иммуномодулирующим свойствами [21] за счет перепрограммирования провоспалительных макрофагов M1 в противовоспалительные макрофаги M2, увеличения продукции противовоспалительных цитокинов IL-10 и TGF-β, ингибирующих рекрутирование нейтрофилов цитокинами эндотелиальных клеток [22, 23]. In vitro МСК продемонстрировали способность переносить белок C7 и COL7A1 мРНК в соседние клетки посредством внеклеточных везикул [24]. Все эти механизмы, ассоциированные с МСК, способствуют ранозаживлению и снижению воспалительных процессов в организме [17, 20, 21].

Анализ культивированных МСК подтвердил отсутствие экспрессии MHC II (Major Histocompatibility Complex II), что исключает развитие после их введения иммунологических реакций [21]. При этом было показано, что МСК можно использовать как интрадермально, так и системно, что особенно важно в случае РДБЭ-пациентов, у которых наблюдается не только поражение кожи, но и системное воспалительное заболевание [25], в патогенезе которого существенную роль играет постоянно продуцируемый K-провоспалительный цитокин IL-1β [26]. Этот эпидермальный цитокин, помимо локального воздействия на окружающие клетки, которое приводит к устойчивому воспалению кожи, при чрезмерном высвобождении может через системное кровообращение повреждать другие ткани и органы и способствовать развитию опасных для жизни осложнений РДБЭ, таких как нефро- и кардиомиопатия. МСК дают иммуномодулирующий и противовоспалительный эффекты [20, 21], ассоциированные с влиянием этих клеток на провоспалительные сигнальные пути, включая эпидермальный цитокин IL-1β (за счет адаптивного высвобождения антагониста рецептора IL-1 — IL-1RA) [27]. Поэтому можно с уверенностью предположить, что системное применение МСК будет способствовать улучшению состояния РДБЭ-пациентов [28]. Недавно была описана хорошо изученная субпопуляция МСК, экспрессирующих IL-1Ra [27]. МСК также способны изменять профиль секреции цитокинов дендритных клеток, что ведет к увеличению секреции цитокина IL-10, оказывающего противовоспалительное действие, и к снижению секреции IFN-γ и IL-12, оказывающих воспалительное действие [29]. МСК обладают и способностью регулировать иммунный ответ посредством увеличения количества CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺-регуляторных T-клеток [30].

Выявлено также, что введенные системно МСК за счет характерного для них эффекта хоминговой рецепции способны мигрировать к поврежденным участкам тканей [31], где они путем паракринного воздействия способствуют их репарации [32]. Следует отметить, что с IL-1RA, синтезируемым МСК, связан еще один противовоспалительный механизм: под влиянием этого белка в кожных ранах наблюдается перепрограммирование макрофагов M1 в макрофаги M2 и, соответственно, снижается инфильтрация кожных тканей макрофагами M1 [22, 32].

Результаты доклинических исследований, проведенных на иммунодефицитных мышах, продемонстрировали безопасность как интрадермального [33], так и внутривенного [34] введения МСК, выделенных из костного мозга (МСК-КМ) человека. В обоих случаях наблюдали заживление кожных ран. Показано, что внутривенно введенные МСК-КМ способны мигрировать в кожу и слизистые оболочки и увеличивать продукцию C7 и образование якорных волокон (ЯВ) [34]. Показано также, что внутривенное введение МСК-КМ мышам с диабетическими ранами приводит к неоваскулогенезу, реэпителизации и заживлению ран [19]. Ряд исследователей [17, 19—21], проанализировав секретом и учитывая способность МСК мигрировать в зоны повреждения, заключили, что после введения в организм эти клетки за счет паракринного действия способны оказывать противовоспалительное, иммуномодулирующее, проангиогенное, антиапоптическое, репаративное действия, тем самым способствуя подавлению системного воспаления, заживлению ран кожи и слизистых оболочек.

При этом показано, что аллогенные МСК после введения сохраняются в организме недолго, улучшение же состояния пациента происходит за счет паракринного действия секретома этих клеток [35].

Полученные многообещающие результаты доклинических исследований послужили основанием для проведения КИ, цель которых — изучение возможности применения МСК-КМ для лечения РДБЭ-пациентов. M. El-Darouti и соавт. [25] провели рандомизированное двойное слепое КИ, в котором 14 детям с РДБЭ были внутривенно введены аллогенные МСК-КМ от здоровых доноров (см. таблицу). На протяжении 12 мес наблюдения не отмечено побочных эффектов или нежелательных явлений. Результаты исследования продемонстрировали редукцию эритемы, заживление ран и уменьшение образования пузырей, гистологический анализ биоптатов кожи выявил увеличение уровня C7 и образование ЯВ.

Клинические исследования по использованию аллоМСК в лечении РДБЭ

Клиническое исследование G. Petrof и соавт. [36] с участием 10 детей с РДБЭ, которым трехкратно внутривенно вводили аллогенные МСК-КМ (см. таблицу), продемонстрировало выраженный клинический эффект — заживление ран, снижение эритемы кожи и болевого синдрома, уменьшение образования пузырей, который сохранялся 4—6 мес, побочные эффекты и нежелательные явления не зарегистрированы. Интересно отметить, что гистологический анализ биоптатов кожи пациентов не выявил увеличения образования C7 и ЯВ, в отличие от результатов, полученных M. El-Darouti и соавт. [25].

В КИ (проспективное, I/II фазы, открытое) E. Rashidghamat и соавт. [37] наблюдали 9 взрослых РДБЭ-пациентов, которым выполнили 2 внутривенные инфузии МСК, полученные из КМ здоровых доноров (см. таблицу). На протяжении 12 мес серьезных побочных эффектов не выявлено. Наблюдались преходящее снижение показателей активности заболевания и значительное уменьшение кожного зуда. У 1 пациента выявлено преходящее увеличение уровня C7. Общее количество пузырей на теле участников клинического исследования уменьшилось в среднем в 2,8 раза на 28-й день и в 2,9 раза на 60-й день.

Следует отметить, что после инфузии МСК-КМ повышение уровня C7 и образование новых ЯВ как у детей, так и у взрослых РДБЭ-пациентов регистрируют не всегда, при этом заживление ран и уменьшение количества пузырей по сравнению с исходным уровнем наблюдают практически у всех пациентов. По всей видимости, такой эффект может развиваться в результате повышения уровня других белков адгезии в дермально-эпидермальном соединении (ДЭС), а также вследствие снижения уровня провоспалительных медиаторов [38]. Меньшую же выраженность клинического эффекта у взрослых РДБЭ-пациентов по сравнению с детьми E. Rashidghamat и соавт. связывают с тем, что взрослые претерпевают гораздо более длительный период воспаления и фиброза и, соответственно, имеют гораздо более высокий риск развития сквамозно-клеточной карциномы (СКК) [37]. В частности, у 2 участников КИ обнаружили СКК после системного введения МСК-КМ [38]. Однако исследователи напрямую не связывают эти события и считают, что выводы нужно делать после проведения масштабных КИ, поскольку у РДБЭ-пациентов исходно значительно повышен риск развития СКК вследствие хронического воспаления кожных ран и фиброза [39]. Выполнено уже более 700 КИ с использованием МСК для лечения различных заболеваний, и ни в одном из них не зарегистрировано развитие злокачественных новообразований [38]. Однако вопрос, может ли инфузия MSCs вызвать или ускорить развитие СКК у РДБЭ-пациентов, должен быть одним из ключевых в будущих КИ [37].

В целом системное введение МСК-КМ проявило себя как перспективный и хорошо переносимый пациентами метод. У многих исследователей данный подход вызывает особый интерес, поскольку есть вероятность получения системного противовоспалительного клинического эффекта, что чрезвычайно актуально для РДБЭ-пациентов.

Весьма перспективным подходом для лечения кожных ран у РДБЭ-пациентов является и внутрикожное введение МСК-КМ. В доклинических исследованиях на ксенографтной модели было показано, что при внутрикожном введении этих клеток наблюдается заживление кожных ран, отмечены продукция C7 и образование ЯВ [33, 40].

P. Conget и соавт. [41] в плацебо-контролируемых КИ наблюдали 2 РДБЭ-пациентов (OMIM 226600), которым интрадермально по краям хронических ран были введены МСК (см. таблицу). Через 1 нед после введения клеток в области базальной мембраны регистрировали C7 и улучшение состояния ДЭС. Реэпителизацию хронических ран наблюдали только в местах введения МСК. Клинический эффект сохранялся в течение 4 мес. Побочные эффекты или нежелательные явления не зарегистрированы.

По данным T. Kuhl и соавт. [40], при внутрикожном введении МСК-КМ получен клинический эффект, аналогичный эффекту дермальных фибробластов, но при этом требуется в 10 раз меньше клеток. Использование меньшего количества клеток позволяет уменьшить объем одной инъекции и тем самым снизить болевые ощущения, связанные с внутрикожным введением препарата, и обрабатывать большие площади поверхности тела. Еще одним преимуществом МСК по сравнению с ДФ служит более выраженное иммуномодулирующее действие, которое способствует более выраженному уменьшению воспаления в кожных ранах [42]. Таким образом, можно заключить, что при РДБЭ МСК-КМ, по сравнению с ДФ, обладают большим потенциалом для заживления ран и восстановления целостности кожи.

Еще одним, не менее перспективным источником МСК для лечения пациентов с РДБЭ является ПК человека. Так, S. Lee и соавт. [43] провели КИ (фазы I/IIa, NCT04520022) с целью оценки безопасности и клинической эффективности внутривенной инфузии аллогенных МСК, полученных из ПК человека (см. таблицу). Шестерым РДБЭ-пациентам (4 взрослых и 2 детей) выполнили 3 внутривенные инфузии МСК-ПК с интервалом 2 нед, наблюдение проводили в течение 8—24 мес после терапии. Исследование показало, что лечение не сопровождалось какими-либо серьезными побочными эффектами. Отмечены снижение тяжести РДБЭ по Бирмингемскому индексу, сокращение поражения площади поверхности тела, уменьшение количества пузырей, боли, зуда, улучшение качества жизни с максимальным эффектом через 56—112 дней после проведенной терапии. Введение МСК-ПК также индуцировало перепрограммирование фенотипа макрофагов M1 на фенотип макрофагов M2, что приводило к снижению инфильтрации M1 и тучных клеток в кожных ранах. Увеличение продукции C7 в ДЭС наблюдали у 1 из 6 пациентов на 56-й день. Таким образом, результаты исследования показали безопасность и клиническую эффективность внутривенного введения МСК-КМ РДБЭ-пациентам. Со временем клинический эффект от введения МСК-КМ постепенно ослабевал, но у некоторых пациентов наблюдали устойчивое улучшение вплоть до 6 мес.

Установлено, что в коже РДБЭ-пациентов происходят уменьшение плотности нервных волокон и увеличение численности активированных тучных клеток, что, по всей видимости, и вызывает наблюдающиеся у пациентов нейропатическую боль и зуд [44]. Исследования показали, что системное применение МСК-ПК приводит к уменьшению количества вырабатываемых сенсорными клетками нейропептидов, субстанции P и других факторов, участвующих в нейрогенном воспалении, возникновении нейропатической боли и зуда [45]. Этому способствует и значительное снижение инфильтрации кожных ран тучными клетками, которые принимают активное участие в воспалительных процессах в коже РДБЭ-пациентов.

Полученные S. Lee и соавт. [43] результаты сопоставимы с результатами КИ по системному введению МСК-КМ [25, 36, 37]. Однако ПК является более удобным источником МСК благодаря неинвазивности процедуры ее сбора и быстрой доступности в банках ПК [46]. Кроме того, показано, что МСК-ПК обладают более высокой пролиферативной способностью и меньшей иммуногенностью по сравнению с МСК-КМ и бо`льшим иммуносупрессивным и регенеративным потенциалами по сравнению с МСК, выделенными из жировой ткани [47].

Еще одним многообещающим вариантом МСК может служить выявленная в последних исследованиях в дерме человека новая субпопуляция иммуномодулирующих клеток, получившая название ABCB5⁺-МСК (см. таблицу) [48, 49]. Она характеризуется экспрессией классических маркеров МСК [50], сохраняющейся способностью к образованию колоний и клональной трехлинейной дифференцировке in vitro, супрессивным эффектом в отношении эффекторных T-клеток при одновременном усилении эффекта регуляторных T-клеток [48]. S. Beken и соавт. [51] показали, что эту хорошо охарактеризованную клеточную субпопуляцию можно успешно выделять из дермы человека по единственному маркеру — P-гликопротеину ABCB5, благодаря чему она представляет собой высокоочищенную гомогенную линию дермальных МСК. Это открытие является значительным шагом вперед для регенеративной медицины, поскольку выделение посредством одного маркера МСК позволяет стандартизировать клеточный препарат и получать статистически достоверные результаты при проведении клинических исследований [52, 53].

Субпопуляция ABCB5⁺-МСК характеризуется выраженным иммуномодулирующим и противовоспалительным эффектами, в том числе за счет влияния на популяцию макрофагов, приводя тем самым к снижению инфильтрации ран макрофагами M1 [51], уровня нейтрофилов и регуляторных T-клеток [54]. При этом ABCB5⁺-МСК улучшают кровоснабжение тканей за счет продукции МСК эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF) и усиления ангиогенеза в поврежденной кожной ткани.

Выявлено также, что ABCB5⁺-МСК являются отличным источником IL-1Ra — ключевого цитокина, эффективно подавляющего воспаление, связанное с макрофагами M1, которое лежит в основе нарушений восстановления хронических ран [51, 55]. S. Beken и соавт. [51] при интрадермальном введении ABCB5⁺-МСК на мышиной модели впервые выявили синтез этого цитокина, эффективно подавляющего выраженное воспаление в ранах, что напрямую коррелировало с их заживлением. Исследователи показали, что при введении ABCB5⁺-МСК мышам по краям хронических ран под действием секретируемого клетками IL-1RA происходит переключение чрезвычайно активных макрофагов M1 на способствующие заживлению ран макрофаги M2.

Доказано, что хронические раны, независимо от этиологии, характеризуются стабильно высокой численностью чрезмерно активированных макрофагов M1 [56]. Последние отличаются повышенной секрецией IL-1β, TNF-α и других провоспалительных цитокинов, которые вместе с протеазами и реактивными формами кислорода приводят к повреждению кожных тканей и сенесценции ДФ, тем самым препятствуя ранозаживлению. При этом в отличие от нормального ранозаживления при хроническом течении наблюдается нарушение перепрограммирования макрофагов M1 в макрофаги M2, вырабатывающие факторы роста и метаболиты, стимулирующие репарацию тканей [57]. Напротив, выделяемые макрофагами M1 цитокины TNF-α и IL-1β поддерживают порочный круг аутокринной постоянной активации M1-макрофагов и содействуют персистирующему воспалению [51]. При использовании же ABCB5⁺-МСК секретируемый ими IL-1RA, воздействуя на рану, инфильтрированную макрофагами M1, приводит к перепрограммированию макрофагов M1 в противовоспалительные M2 и разрывает этот порочный круг, тем самым способствуя заживлению ран.

Проведенные доклинические исследования на мышиной модели RDBE при однократном и многократном внутривенном введении ABCB5⁺-МСК продемонстрировали безопасность и клиническую эффективность, проявляющуюся улучшением клинического состояния животных, продлением срока жизни и восстановлением целостности кожи [58].

Эти доклинические исследования послужили основанием для КИ, которые также продемонстрировали, что применение ABCB5⁺-МСК приводит к улучшению состояния/качества жизни РДБЭ-пациентов и репарации кожи [52, 59].

Так, D. Kiritsi и соавт. [60] провели международное КИ по внутривенному введению ABCB5⁺-МСК для лечения РДБЭ-пациентов (фазы I/IIa, NCT03529877; EudraCT 2018-001009-98), в котором 16 пациентам (в возрасте 6—36 лет) были выполнены 3 инфузии этих клеток. Результаты исследования показали значительное снижение активности РДБЭ и индекса рубцевания, а также кожного зуда. На протяжении всего срока наблюдения (12 мес) не отмечено серьезных побочных эффектов и нежелательных явлений.

Исследовательская группа K. Dieter и соавт. провела post-hoc анализ данного лечения для оценки его влияния на заживление кожных ран у РДБЭ-пациентов [61]. Результаты исследования показали, что в течение 12 нед коэффициент заживления ран составил 76%, а медиана частоты появления новых ран снизилась на 79%. Исследователи заключили, что системное введение ABCB5⁺-МСК способствует заживлению хронических ран и препятствует образованию пузырей и новых ран у РДБЭ-пациентов.

Результаты доклинических и клинических исследований позволяют сделать заключение, что выделенная из дермы здоровых доноров специфическая субпопуляция иммуномодулирующих ABCB5⁺-МСК является весьма перспективной популяцией МСК для лечения РДБЭ. Особо следует отметить, что ABCB5⁺-МСК могут поставляться в виде готового к продаже лекарственного препарата, который содержит высокоочищенную популяцию клеток с подтвержденной, стандартизованной противовоспалительной активностью (секреция IL-1RA) [53, 62].

Таким образом, применение МСК представляет собой ценную стратегию лечения РДБЭ-пациентов и при интрадермальном, и при внутривенном введении. MSCs доступны, легко размножаются в условиях GMP (надлежащая практика) и уже используются для лечения человека при ряде заболеваний, что позволит свести к минимуму проблемы безопасности применения этих клеток и облегчит быстрое внедрение в клиническую практику для лечения РДБЭ. Однако для подтверждения полученного результата и безопасности, включая исключение риска развития СКК, необходимо проведение более длительного наблюдения [61].

Подводя итоги вышеизложенного, хотелось бы отметить довольно широкий спектр разрабатываемых клеточных продуктов на основе МСК, применение которых предполагает их весьма высокую эффективность в терапии РДБЭ. Ряд из них имеет большие перспективы выхода на медицинский рынок в обозримом будущем. В частности, к таким продуктам можно отнести МСК-КМ, характеризуемые хорошими противовоспалительным, иммуномодулирующим и регенеративным эффектами, а также выделенные из кожи ABCB5⁺-МСК, продемонстрировавшие еще более выраженные клинические эффекты по сравнению с МСК-КМ. Крайне важно, что МСК можно использовать и интрадермально, и внутривенно для системного действия на организм, что особенно актуально в связи с характером РДБЭ, ассоциированного с системным воспалением. Такая терапия может значительно уменьшить активность заболевания и улучшить качество жизни РДБЭ-пациентов за счет снижения воспалительных процессов в организме и облегчения постоянных и сильно беспокоящих симптомов — зуда и боли. При длительном же системном применении ABCB5⁺-МСК, по мнению D. Kiritsi и соавт. [60], можно ожидать и улучшения структурной целостности кожи и слизистых оболочек за счет накопления C7 в области ДЭС вследствие высокой адгезии этих клеток к поврежденным тканям (причем более высокой, чем у МСК-КМ) и способности секретировать C7.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.