Введение

Хроническая спонтанная крапивница (ХСК) ― заболевание, для которого характерно возникновение на коже зудящих волдырей на протяжении более 6 нед при невыявленном специфическом триггере [1, 2]. Несмотря на большое количество исследований в данной области, механизмы патогенеза ХСК не ясны, а вопросы диагностики различных форм заболевания изучены недостаточно.

Впервые гипотезу об аутоиммунных механизмах развития ХСК выдвинул Rorsman в 1962 г., предположив, что реакция антиген—антитело может быть причиной базопении в периферической крови [3]. На современном этапе при ХСК принято выделять 2 возможных типа аутоиммунитета: тип I и тип IIb [1, 3, 4]. Для типа I (аутоаллергии) характерны выявление аутореактивных IgE-антител к аутоантигенам, например к тиреопероксидазе (ТПО), ДНК или интерлейкину-24 [1, 3, 5], и быстрый ответ на анти-IgE терапию омализумабом [6, 7]. Ключевую роль в патогенетических механизмах аутоиммунитета типа IIb играют IgG-аутоантитела к IgE или его высокоаффинному рецептору (FcεRI), которые выявляют у 30—50% пациентов с ХСК [3, 8]. Такие аутореактивные IgG-аутоантитела способны связываться с рецепторами FcεRI на тучных клетках и базофилах, вызывая их активацию [1, 4].

Согласно позиционному документу Европейской академии аллергологии и клинической иммунологии (EAACI) 2013 г., аутоиммунную хроническую крапивницу считают самостоятельной нозологической формой [9]. Наиболее распространенным методом скрининга, позволяющим выявить аутореактивность, является внутрикожная проба с аутологичной сывороткой (ПАС). Более точно подтвердить присутствие аутореактивных IgG-антител к рецептору FcεRIα и/или IgE можно с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), теста высвобождения гистамина из базофилов и непрямого теста активации базофилов (ТАБ) [4, 10]. В настоящее время коммерческие наборы для определения данных аутоантител с помощью ИФА недоступны, а их диагностическое значение для выявления функциональных антител не известно. Тест высвобождения гистамина из базофилов является дорогостоящим и трудоемким, применяется крайне редко в единичных зарубежных лабораториях. В связи с этим наибольший интерес представляет тест активации базофилов, осуществляемый методом проточной цитометрии, при котором оценивают степень активации базофилов здоровых доноров под действием сыворотки крови больных ХСК [1, 10, 11]. В нашей стране ТАБ используется для диагностики других аллергических заболеваний [12, 13], однако его применение при ХСК описано лишь в отдельных публикациях [14].

С учетом того, что выявление аутоиммунной природы крапивницы определяет дальнейшую терапевтическую тактику, изучение патогенетических особенностей данной формы заболевания представляет актуальное направление современной персонализированной медицины.

Цель исследования — оценка возможности использования в клинической практике ТАБ для диагностики аутоиммунной формы ХСК.

Материал и методы

В открытое проспективное исследование включены 125 пациентов с ХСК, обследованных на базе клинико-диагностического и II стационарного отделений микологической клиники СЗГМУ им. И.И. Мечникова (Санкт-Петербург) в период с 2019 по 2021 г. На исследование получено одобрение локального этического комитета СЗГМУ им. И.И. Мечникова (протокол №10 от 30.10.19).

Критерии включения пациентов в исследование: возраст от 18 лет и старше; наличие уртикарных высыпаний и/или ангиоотеков, возникающих спонтанно на протяжении не менее 6 нед в соответствии с классификацией EAACI/GA²LEN/EDF/WAO 2018 и РААКИ 2019 [2, 15]; подписанное добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии исключения из исследования: продолжительность появления уртикарных высыпаний менее 6 нед; возраст менее 18 лет; изолированная форма хронической индуцируемой крапивницы; дебют крапивницы после новой коронавирусной инфекции SARS-Cov2; уртикарный васкулит; беременность и лактация; отказ пациента от участия в исследовании.

У всех больных пронализированы демографические данные, анамнез заболевания, возраст начала крапивницы, продолжительность заболевания, наличие гипотиреоза и антител к ТПО. Клеточный состав периферической крови оценивали с помощью гематологического анализатора DxH-800 («Beckman Coulter», США). Определение уровня общего IgE в сыворотке крови осуществляли методом иммуноферментного анализа («Полигност», Россия).

Кожную аутореактивность оценивали с помощью внутрикожной ПАС. Интервал от последнего приема антигистаминного препарата до выполнения пробы составлял не менее 72 ч. В качестве положительного контроля использовали раствор гистамина, в качестве отрицательного — физиологический раствор. Результаты пробы оценивали через 30 мин. При появлении волдыря, диаметр которого превышал на 1,5 мм размера волдыря в отрицательном контроле, ПАС считали положительной [15].

Для проведения непрямого теста активации базофилов использовали сыворотку пациента с ХСК и базофилы здорового донора. Активацию базофилов оценивали в многоцветном анализе методом проточной цитометрии с использованием набора Allerginicity Kit (Cellular Analysis of Allergy, «Beckman Coulter», США) в соответствии с инструкцией производителя. Для идентификации базофилов применяли маркеры CD3-CRTH2+, а для оценки активации базофилов подсчитывали содержание клеток с высокой экспрессией CD203c после инкубации с сывороткой пациента на водяной бане в темноте в течение 15 мин при 37 °C. В качестве отрицательного контроля применяли базофилы здорового донора I + буферный раствор; для положительного контроля — анти-IgE, IgG-антитела и базофилы здорового донора I. За базовое значение активации принимали долю активированных базофилов донора I после инкубации с сывороткой донора II. Рассчитывали индекс стимуляции (ИС) — соотношение доли активированных базофилов после инкубации с сывороткой пациента с ХСК к базовому значению активации. Результат ТАБ считали положительным при ИС >2 [10, 16].

Активность и тяжесть течения крапивницы изучали с помощью индекса недельной активности крапивницы (Urticaria Activity Score 7, UAS7).

Для статистического анализа применили программы Statistica for Windows (версия 10) и StatTech (версия 2.5.2). Распределения показателей, не являющихся нормальными, представляли в виде медианы (Me), нижнего и верхнего квартилей (Q1; Q3). Количественные различия между выборками оценивали с помощью U-критерия Манна—Уитни. Для сравнения процентных долей применяли критерий χ² Пирсона. Корреляционный анализ показателей осуществляли методом Спирмана (r_s). Различия сравниваемых параметров считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Обследованы 125 пациентов с диагнозом ХСК в возрасте от 18 до 75 лет, медиана 42 года (30; 57), доля женщин 72,8% (n=91), мужчин — 27,2% (n=34). Со слов пациентов, первые симптомы крапивницы возникли у них в возрасте 3—75 лет, медиана 37 лет (28; 51). Продолжительность заболевания варьировала от 3 мес до 50 лет, медиана 1,5 года (0,6; 5,0).

Внутрикожная проба с аутологичной сывороткой (ПАС) выполнена 107 (85,6%) пациентам. Ограничениями для проведения ПАС у 18 (14,4%) пациентов явились невозможность отмены Н1-антигистаминных препаратов в связи с высокой активностью ХСК, а также распространенные высыпания на коже предплечий в области предполагаемого введения аутологичной сыворотки. Положительный результат ПАС зарегистрирован у 65 (60,7%) больных.

На следующем этапе всем участникам исследования провели непрямой ТАБ с помощью проточной цитометрии. Контрольная группа включила 10 здоровых добровольцев (6 женщин и 4 мужчин) без аллергических и аутоиммунных заболеваний, средний возраст 45 лет (от 28 лет до 61 года).

В результате проведенного исследования положительный результат ТАБ отмечен у 43 (34,4%) больных. В группе пациентов ТАБ(+) доля активированных базофилов и ИС составили соответственно 17,30 (4,20; 50,00) и 16,80 (4,90; 32,35) и были статистически значимо выше аналогичных показателей в группе ТАБ(-) — 0,85 (0,50; 1,38) и 0,78 (0,44; 1,06) (p<0,001) и группе контроля — 0,60 (0,40; 0,60) и 0,75 (0,38; 0,75) (p<0,001) (рис. 1, 2).

Рис. 1. Количество активированных базофилов в исследуемых и контрольной группах.

*U-критерий Манна—Уитни (p<0,05).

Рис. 2. Индекс стимуляции в исследуемых и контрольной группах.

*U-критерий Манна—Уитни (p<0,05).

Для подтверждения диагностической значимости применения ТАБ при аутоиммунной форме ХСК был провен корреляционный анализ взаимосвязей ИС с клинико-лабораторными показателями пациентов. В результате анализа обнаружена прямая корреляционная связь между ИС и показателем активности крапивницы по UAS7 (r_s=0,211, p=0,039). Кроме того, установлена обратная корреляционная связь между величиной ИС и уровнем общего IgE в сыворотке крови (r_s= –0,313, p<0,001) (рис. 3), количеством эозинофилов (r_s= –0,242, p=0,009) и количеством базофилов (r_s= –0,192, p=0,039) в периферической крови.

Рис. 3. Корреляционная связь уровня общего IgE и индекса стимуляции.

Сравнительный анализ величины ТАБ и клинико-лабораторных данных пациентов с ХСК показал, что показатели возраста больных, возраста дебюта высыпаний, частоты встречаемости ангиоотеков, эозинопении, базопении, гипотиреоза и повышенного уровня АТ к ТПО, а также тяжести течения заболевания у ТАБ(+) пациентов статистически значимо превышали аналогичные показатели у ТАБ(–) пациентов. В то же время продолжительность заболевания и уровень общего IgE были существенно ниже (см. таблицу).

Характеристика ТАБ(+) и ТАБ(–) пациентов с ХСК (n=125)

Примечание. * — статистический анализ проведен с применением критерия χ² Пирсона, ** — U-критерия Манна—Уитни, Me — медиана, Q1 — нижний квартиль, Q3 — верхний квартиль.

Обсуждение

По мнению большинства исследователей, для ХСК, в основе которой преобладают аутоиммунные механизмы, характерно более длительное и тяжелое течение, а также резистентность к антигистаминным препаратам [17].

Согласно позиционному документу EAACI 2013 г. [9], диагностическими критериями аутоиммунной ХСК являются: 1) положительный результат теста высвобождения гистамина из базофилов или ТАБ, выполненного in vitro; 2) наличие аутореактивности (положительной ПАС), демонстрирующей дегрануляцию тучных клеток in vivo; 3) выявление специфических аутоантител IgG к IgE и/или FcεRI методами вестерн-блот или ИФА. Однако в настоящее время доступными для клинической практики методами выявления IgG аутоантител к IgE и FcεRI остаются ПАС и ТАБ [1].

В ходе работы положительный результат ПАС получен у 60,7% пациентов, хотя выполнение пробы у пациентов с высокой активностью заболевания и невозможностью отмены антигистаминных препаратов было ограничено. Наши результаты сопоставимы с данными других исследований, в которых положительная ПАС выявлена у 30—61% пациентов с ХСК [4, 9, 10]. Отрицательный результат ПАС с высокой долей вероятности позволяет исключить наличие аутореактивных антител, однако такое исследование обладает невысокой специфичностью и его значение для дифференциальной диагностики фенотипов и эндотипов ХСК, а также прогноза течения заболевания является неоднозначным [18].

В отличие от ПАС ТАБ не требует отмены приема лекарственных препаратов, является безопасным для пациента, поскольку риск инфицирования через парентеральное введение сыворотки отсутствует, а результаты теста являются количественными. ТАБ позволяет идентифицировать пациентов, у которых имеются аутореактивные аутоантитела, включая анти-FcεRI, анти-FcεRII, анти-IgE и, возможно, другие сегодня не известные ауто-IgG, активирующие базофилы, без точного определения, какие именно аутоантитела присутствуют в сыворотке [11]. Фактически ТАБ является провокационным тестом in vitro.

В нашем исследовании положительный результат ТАБ получен у 34,4% пациентов с ХСК, что позволило предположить у них участие аутоиммунных механизмов. В группе ТАБ(+) пациентов по сравнению с ТАБ(–) пациентами индекс активности заболевания был выше, пациенты были старше, первые симптомы крапивницы у них появлялись в более зрелом возрасте, чаще регистрировались ангиоотеки и патология щитовидной железы. Ряд авторов указывают на повышение АТ к ТПО у пациентов с аутоиммунной ХСК, однако их роль в стимуляции базофилов и тучных клеток окончательно не установлена [8, 19].

Кроме того, у ТАБ(+) пациентов чаще выявлялись эозинопения, базопения и низкий уровень общего IgE в сыворотке крови. Полученные данные сопоставимы с результатами международных исследований PURIST [4] и CORSA [12], согласно которым положительный ТАБ можно рассматривать как высокочувствительный и специфичный маркер аутоиммунной ХСК, ассоциированной с низким уровнем общего IgE в сыворотке крови и тяжелым течением заболевания.

Таким образом, применение ТАБ при обследовании пациентов с ХСК оптимизирует диагностику разных эндотипов заболевания. С учетом того, что у пациентов, в основе крапивницы которых преобладает аутоиммунитет типа IIb, установлен более медленный ответ на лечение омализумабом, перспективным является изучение возможности использования ТАБ в качестве предиктора эффективности иммунобиологической терапии.

Заключение

Результаты исследования свидетельствуют о том, что для аутоиммунной ХСК характерны высокая активность заболевания, более частая встречаемость ангиоотеков, эозинопении, базопении, гипотиреоза, повышенного уровня АТ к ТПО и низкого содержания общего IgE. Включение непрямого ТАБ в диагностическое обследование пациентов с ХСК позволяет идентифицировать пациентов с аутоиммунной формой крапивницы в клинической практике.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Я.И. Козлова, Е.В. Фролова, Н.Н. Климко

Сбор и обработка материала: Е.В. Бурыгина, А.Е. Учеваткина, Л.В. Филиппова, О.В. Аак, А.В. Мельникова

Статистическая обработка: Е.В. Бурыгина

Написание текста: Е.В. Бурыгина, Я.И. Козлова, Е.В. Фролова

Редактирование: К.И. Разнатовский, Н.В. Васильева

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors’ contributions:

The concept and design of the study: Y.I. Kozlova, E.V. Frolova, N.N. Klimko

Collecting and interpreting the data: E.V. Burygina, A.E. Uchevatkina, O.V. Aak, L.V. Filippova, A.V. Melnikova

Statistical analysis: E.V. Burygina

Drafting the manuscript: E.V. Burygina, Y.I. Kozlova, E.V. Frolova

Revising the manuscript: K.I. Raznatovsky, N.V. Vasilyeva