Введение

Редкие (орфанные) заболевания являются одной из важнейших областей здравоохранения. Особенности этих патологий, включая небольшую их распространенность и высокую стоимость лечения, требуют отдельного нормативно-правового регулирования организации медицинской помощи, отдельного эпидемиологического анализа, а также повышенного внимания к своевременной диагностике и разработке эффективных методов лечения. В большинстве случаев такие заболевания носят прогрессирующий характер и без соответствующего лечения приводят к летальному исходу или инвалидизации человека [1].

Не существует единого, широко принимаемого определения редких заболеваний. Некоторые определения полагаются на количество людей, живущих с орфанным заболеванием, другие могут включать иные факторы, например, доступность лечения болезни или возможность облегчения ее течения.

Впервые термин «орфанные» применительно к заболеваниям и лекарственным средствам (от англ. orphan — сиротские) использовали в США в 1983 г. в законодательном акте «Акт об орфанных препаратах» (Orphan Drug Act), выделив около 1600 известных на тот момент заболеваний и синдромов и около 300 лекарственных средств, отнесенных к категории редких [2—4].

В США «Акт о редких заболеваниях» (Rare Disease Act) от 2002 г. дает определение редких болезней как «болезни или состояния, затрагивающие менее 200 000 людей в США» (any disease or condition that affects less than 200,000 persons in the United States).

В Европе болезнь считается редкой, если она поражает менее 1 из 2 тыс. человек [5].

Согласно анализу, проведенному S. Nguengang и соавт. (2019), в мире насчитывается 6172 редких заболевания, а общее количество пациентов с такими патологиями составляет примерно 263—446 млн — от 3,5 до 5,9% населения [6].

В законодательство РФ определение орфанного заболевания введено в 2011 г.: «Редкими (орфанными) заболеваниями являются заболевания, которые имеют распространенность не более 10 случаев заболевания на 100 тыс. населения» (согласно поправкам к Федеральному закону №323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» (далее — Закон об охране здоровья граждан). Впоследствии введено понятие и орфанного лекарственного препарата [7]. В 2019 г. в список орфанных болезней внесено 256 заболеваний [8].

В мире, по данным Всемирной организации здравоохранения, насчитывается около 400 млн человек, страдающих редкими заболеваниями, среди которых 30 млн проживают в Европе и более 25 млн в США. Российский регистр включает около 30 тыс. человек с орфанным заболеванием в анамнезе [9].

Общие сведения

К группе орфанных относятся врожденные или приобретенные заболевания, частота которых определена законодательством различных стран для выбранной нозологии [10, 11]. Повышенный интерес и особая важность изучения подходов к терапии редких заболеваний связаны в том числе и с тем, что они так или иначе охватывают все области медицины.

Клиническая картина пациентов с орфанным заболеванием в анамнезе многогранна, включает в себя большое количество синдромов и симптомов, которые, в свою очередь, могут как помочь в диагностике, так и смазать истинные проявления орфанного заболевания. Примерно 70—75% проявлений имеют генетическую природу, остальные являются следствием воздействия различных экзогенных факторов (например, факторов окружающей среды, инфекций и др.) [12]. При этом более 70% генетических патологий проявляют себя уже в детстве и сопровождают больных на протяжении всей жизни, около 30% пациентов с редкими диагнозами не доживают до 5 лет [12]. Следует отметить, что если нарушения (замена нуклеотидов, небольшие дупликации, делеции, инверсии) затрагивают один ген, то речь идет о моногенных патологиях, если же затрагивают большие участки или целые хромосомы (крупные структурные перестройки, изменение числа хромосом), то такие патологии представляют собой хромосомные заболевания и, как правило, характеризуются большей симптоматикой [1]. Возможно также нарушение исключительно в одном аллеле гена, что приводит к рецессивному носительству патологии и проявляется более простой клинической формой. Если же заболевание передалось по обоим аллелям гена — доминантно, оно сопровождается тяжелой клинической картиной и требует серьезного терапевтического подхода.

Важно отметить, что единого, принятого на международном уровне определения частоты патологии для отнесения нозологических форм к орфанным заболеваниям пока не существует, также нет единых критериев их включения в данную группу [12].

Существуют некоторые схожие во всем мире проблемы, связанные с группой орфанных заболеваний, это недостаток опыта ведения таких пациентов, отсутствие единой системы анализа результатов исследований [12], а также экономическая нерентабельность разработки лекарственных препаратов (следствием которого является недостаток/отсутствие этиопатогенетического лечения), высокая стоимость лечения, и, что очень важно, несвоевременность диагностирования. Так, согласно экспертным данным, лишь 5% орфанных заболеваний в России диагностируют на I стадии, 10—12% — на II, 60—70% — на III, все остальные — на IV, терминальной. Методы лечения и эффективные лекарственные препараты существуют примерно для 300 из примерно 6 тыс. генетических заболеваний, медицинская помощь преимущественно сводится к симптоматическому и паллиативному лечению (Закон «Об орфанных лекарствах» (Orphan Drug Act, ODA), Регламент ЕС N 141/2000 от 16.12.99 «Об орфанных лекарственных средствах»).

В связи с этим разработка современных молекулярно-генетических методов диагностики орфанных заболеваний и инновационных методов их лечения приобретает особую актуальность с учетом также того, что решение этих задач предусмотрено Концепцией предиктивной, превентивной и персонализированной медицины, утвержденной приказом Минздрава России от 24.04.18 №186 [12].

Примером орфанного заболевания является рецессивный дистрофический буллезный эпидермолиз — один из наиболее тяжелых вариантов врожденного буллезного эпидермолиза (ВБЭ).

Врожденный буллезный эпидермолиз

Врожденный буллезный эпидермолиз (ВБЭ) — наследственная пузырчатка, механобуллезная болезнь — представляет группу редких наследственных кожных заболеваний, включающую генетически гетерогенные и фенотипически различающиеся формы, которые проявляются «хрупкостью кожи» в виде пузырей и эрозий. Популяционная частота ВБЭ в России составляет около 1:50 000—1:300 000. Ежегодно прогнозируется 14—34 случая на 1,7 млн новорожденных [13]. По оценкам Национального регистра США заболевание встречается у 20 из 1 млн новорожденных [14].

Все формы ВБЭ связаны с генетически обусловленными структурными нарушениями белков, так или иначе связанных с обеспечением эпидермо-дермального соединения — мутациями 19 генов, кодирующих эти белки [15, 16]. Основным клиническим проявлением является исключительная хрупкость кожи — при малейшем физическом воздействии происходит образование пузырей и появление буллезных элементов [17—20].

Согласно классификации, утвержденной в 2008 г. на III Международной согласительной встрече по диагностике и классификации ВБЭ (Third International Consensus Meeting on Diagnosis and Classification of RDEB) [21], в зависимости от расположения структурного дефекта кожи, а также вида патологически измененного белка, выделяют следующие крупные группы ВБЭ: простой, пограничный, дистрофический (доминантная и рецессивная формы) и синдром Киндлера (впервые описанный в 1954 г.).

Одним из наиболее тяжелых вариантов ВБЭ является аутосомно-рецессивный дистрофический буллезный эпидермолиз (РДБЭ), который представляет собой следствие гомозиготных или гетерозиготных мутаций гена COL7A1, кодирующего синтез коллагена VII типа (C7) [22—24], важнейшего белка, продуцируемого кератиноцитами и фибробластами. Именно этот белок отвечает за образование якорных волокон, которые стабилизируют эпидермо-дермальное соединение (ДЭС) в зоне базальной мембраны эпидермиса (под плотной пластинкой — sublamina densa). В результате мутации COL7A1 наблюдается или полное отсутствие C7 (самые тяжелые клинические варианты течения заболевания), или незначительная его продукция (доминантная или более локализованная рецессивная формы — более мягкие варианты) [18, 25].

РДБЭ развивается с рождения и характеризуется множественными, генерализованными крупными пузырями, часто с геморрагическим содержимым, которые могут быть расположены на любой части кожного покрова [17, 20, 26]. Поверхность пузыря легко травмируется, вследствие чего возникают обширные медленно заживающие, зачастую глубокие эрозии. Поражается не только кожа, но и слизистые оболочки, что вовлекает в процесс многие органы, наблюдается системное воспаление, зуд, повышается риск развития плоскоклеточного рака [27]. Следует отметить, что образование рубцов на коже в местах заживших ран может приводить к контрактурам, что является причиной ранней инвалидизации [17, 28—30]. Пациентам требуются тщательный уход, психологическая и социальная помощь.

В настоящее время утвержденного этиопатогенетического лечения РДБЭ не существует. Все мероприятия являются паллиативными и направлены в первую очередь на предотвращение травмирования кожных покровов, а также включают симптоматическое лечение [1, 17, 31, 32]. Тем не менее можно отметить определенный прогресс в разработке качественно новых методов в лечении РДБЭ.

Инновационные методы лечения РДБЭ

Основная задача при лечении пациентов с РДБЭ заключается в восстановлении в коже и слизистых оболочках содержания и функций C7 в зоне базальной мембраны. В связи с этим одним из перспективных направлений при лечении этого заболевания могут быть методы регенеративной медицины — клеточная терапия (как монотерапия, так и в сочетании с генной терапией). Сегодня в качестве главных кандидатов для этой терапии рассматривают следующие типы клеток.

I. Аллогенные клетки. Это направление включает: 1) локально инъекции фибробластов кожи [33—35]; 2) системно (внутривенно) трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) [36, 37] и мезенхимальных стромальных клеток (МСК) [38].

II. Аутологичные (генно-модифицированные) клетки. Это генетически модифицированные ex vivo собственные клетки кожи (кератиноциты и фибробласты) пациента, которые могут быть трансплантированы ему в виде кожных эквивалентов, а также методом интрадермальных инъекций. При этом трансдуцированные эпидермальные стволовые клетки и фибробласты демонстрируют свой потенциал к делению, обеспечивая возможность долгосрочной экспрессии соответствующих белков, необходимых для формирования и укрепления эпидермо-дермальных связей [1, 39, 40].

I.1. Применение аллогенных фибробластов кожи

Наибольший интерес представляют биопродукты, применение которых сопряжено с минимальным риском развития у пациентов побочных эффектов и нежелательных явлений, и которые относительно просты в использовании [41, 42]. Аллогенные фибробласты кожи относятся к категории таких продуктов, и их использование представляет собой терапевтическую стратегию, наиболее подходящую к регулярному клиническому применению при многих заболеваниях с клиникой дефектов кожи, включая РДБЭ.

Фибробласты — это одни из основных секреторных клеток кожи, участвующих в продукции и организации внеклеточного матрикса (ВКМ), репарации повреждений, стимуляции эпидермального морфогенеза и сосудов, продукции цитокинов и факторов роста, оказывающих ауто- и паракринное действие [43].

Эти клетки легко культивируются, сохраняют диплоидный кариотип, не экспрессируют антигены главного комплекса гистосовместимости класса II (MHC II), не проявляют онкогенных свойств, после трансплантации в дерму их биосинтетическая активность сохраняется [44, 45]. Отмечено также, что аллогенные фибробласты кожи за счет продукции цитокинов и других компонентов внеклеточного матрикса стимулируют пролиферацию и дифференцировку клеток по краям раны, обеспечивая тем самым ее заживление [25, 46].

Таким образом, вышеописанная характеристика фибробластов подтверждает, что эти клетки могут служить основной составляющей для клеточной терапии пациентов с РДБЭ. Подтверждают это и результаты доклинических исследований, проведенные на гипоморфных по C7 мышах (животная модель для РДБЭ), которые продемонстрировали, что интрадермальное введение таким животным фибробластов кожи человека способствует повышению содержания C7 и якорных волокон в области ДЭС и, соответственно, заживлению ран [47, 48]. T. Wong и соавт. (2008) показали, что при однократном введении аллогенных фибробластов кожи у 3 из 5 пациентов с РДБЭ наблюдается увеличение экспрессии COL7A1 как минимум в течение 3 мес и, соответственно, заживление ран [49]. Клеточную суспензию вводили интрадермально по краям раны. Результаты исследования подтвердили, что аллогенные фибробласты кожи обладают низкой иммуногенностью, их введение не сопровождается какой-либо патологической реакцией со стороны организма пациента. (Длительность и выраженность клинического эффекта, по мнению исследователей, может быть связана с уровнем экспрессии COL7A1.)

Результаты рандомизированного плацебо-контролируемого двойного слепого клинического исследования у пациентов с РДБЭ, проведенного двумя исследовательскими группами Г. Петроф (G. Petrof) и соавт. (2013) [34, 50] с использованием аллогенных фибробластов кожи (Vavelta, Intercytex Ltd, UK), также продемонстрировали хороший клинический результат. У большинства пациентов реэпителизация наблюдалась в течение первых 28 дней, полученный результат сохранялся не менее 6 мес [34]. Не выявлено ни одного побочного эффекта и нежелательного явления. При этом отмечено значительное снижение эритемы и улучшение качества жизни пациентов, в том числе и за счет сокращения времени на ежедневную рутинную обработку ран.

По всей видимости, трансплантированные фибробласты кожи за счет паракринного эффекта индуцируют повышение продукции резидентными клетками кожи (фибробластами и кератиноцитами) фактора роста HB-EGF, который, в свою очередь, усиливает экспрессию COL7A1 в этих клетках, что способствует увеличению продукции C7 [49]. Следует отметить, что аллогенные фибробласты после трансплантации в дерму сами также продуцируют C7, который встраивается в ДЭС, но процесс этот кратковременный — не более 2 нед, пока трансплантированные клетки присутствуют в коже [25, 51].

Имеющиеся данные дают основания полагать, что применение аллогенных фибробластов кожи для лечения пациентов с РДБЭ представляет собой достаточно эффективный терапевтический подход. Преимуществом применения является также и то, что при необходимости можно быстро повторить процедуру. Однако следует учитывать, что ожидать хороший клинический результат стоит только у пациентов с некоторой базовой экспрессией COL7A1, для пациентов же с низкой базовой экспрессией COL7A1 или ее отсутствием следует использовать альтернативные стратегии лечения.

Кроме того, следует отметить, что в ходе плацебо-контролируемого исследования выявлено, что при внутрикожном введении плацебо (солевой раствор) также наблюдалось заживление ран, как и при введении аллогенных фибробластов [34, 35]. Механизм, способствующий заживлению ран при введении плацебо, неясен, возможно, что стимуляция активности COL7A1 наблюдается вследствие травматизации кожи иглой. Однако G. Petrof (2013), показал, что эффективность заживления при введении аллогенных фибробластов, тем не менее, выше и клинический эффект сохраняется дольше по сравнению с введением плацебо [34]. Этот вопрос требует дополнительного изучения. Возможно, для того чтобы добиться еще более эффективного заживления ран, необходимо использовать большую концентрацию аллогенных фибробластов. Так, в частности, показано, что оптимальная концентрация аутологичных фибробластов для коррекции возрастных изменений кожи составляет 15×10⁶ клеток/мл физиологического раствора [44, 45], в то время как G. Petrof и соавт. использовали концентрацию 5×10⁶ клеток/мл [34].

Было проведено несколько клинических исследований I и II фаз, по результатам которых доказаны эффективность и безопасность метода внутрикожного введения клеточного продукта — аллогенных фибробластов для пациентов с РДБЭ [34, 35, 50].

I.2. Применение гемопоэтических и мезенхимальных (стромальных) клеток

В качестве одной из терапевтических стратегий для пациентов с РДБЭ рассматривается применение стволовых клеток костного мозга, поскольку показано, что трансплантация аллогенного костного мозга может играть значительную роль в восстановлении поврежденных органов, включая кожу и слизистые оболочки, поскольку позволяет обеспечить организм стволовыми клетками без генетических дефектов [37, 52].

Результаты доклинических исследований, проведенных на животной модели РДБЭ (мыши COL7 -/-), показали высокую выживаемость этих животных при введении аллогенного костного мозга [52, 53].

Полученные данные послужили основанием для проведения J. Wagner и соавт. с 2007 по 2009 г. ограниченного клинического исследования, 6 пациентам с РБДЭ трансплантировали костный мозг от здоровых доноров (COL7A1+) (ClinicalTrials.gov номер, NCT00478244). У всех пациентов в период наблюдения 30—130 дней после трансплантации костного мозга выявлено увеличение C7 в области ДЭС и значительное улучшение клинического состояния. Четырехлетнее последующее наблюдение продемонстрировало стабильность достигнутого клинического результата [36]. Однако следует отметить, что такая процедура не лишена риска, поскольку у 2 пациентов развились не совместимые с жизнью осложнения, связанные с предшествующей трансплантации миелоаблятивной химиотерапией.

В качестве альтернативы трансплантации костного мозга Liao (2018) [54] предложено применение стволовых клеток, выделенных из плаценты (СКП) посредством процессинга CCT (Celgene Cellular Therapeutics) [55].

Показано, что СКП содержат высокий процент гемопоэтических и негемопоэтических стволовых клеток (плацента является не только важнейшей системой для выживания и роста плода, но и кроветворным органом во время его внутриутробного развития [56, 57]), не экспрессируют MHC II, обладают высокими регенеративными свойствами [55] и могут быть рассмотрены в качестве универсальных донорских клеток при аллогенной трансплантации у пациентов с РДБЭ.

Результаты доклинических исследований, проведенных на мышах COL7a12/2, продемонстрировали безопасность и эффективность применения таких клеток. У животных после внутривенного введения СКП выявлен на достаточно высоком уровне C7 в области ДЭС, зарегистрировано заживление ран. Если учесть, что у данных мышей полностью отсутствует C7, то весь зарегистрированный белок — следствие его продукции трансплантированными СКП [55].

Механизм образования C7 и регенерации кожи при РДБЭ после применения СКП в настоящее время активно изучается. Y. Liao и соавт. (2018) полагают, что данный механизм имеет многофакторный характер, в котором принимают участие как ГСК, так и МСК, входящие в состав СКП [54].

Другим перспективным кандидатом для клеточной терапии при РДБЭ являются МСК, выделенные из костного мозга (МСКкм) здоровых доноров [58, 59].

МСК обладают мультипотентным дифференцировочным потенциалом, включая способность к дифференцировке в фибробласты, способность продуцировать компоненты ВКМ и широкий спектр факторов роста/цитокинов, усиливающих миграцию, пролиферацию и дифференцировку эндогенных клеток-предшественников [60—64], способствующих репарации тканей, включая васкулогенез и эпителизацию, оказывающих противовоспалительное и иммуномодулирующее действие.

Культивированные МСК не экспрессируют MHC II, что исключает развитие иммунологических реакций после их трансплантации [65—69].

Результаты доклинических исследований, проведенные на иммунодефицитных мышах, показали, что трансплантация ММСКкм человека как локально (внутрикожно), так и системно (внутривенно) безопасна, наблюдается заживление ран. Так, J. Tolar и соавт. (2009) на животной модели RDEB (COL7A1, мыши) продемонстрировали, что внутривенно введенные МСКкм способны мигрировать в кожу и слизистые оболочки и увеличивать продукцию C7 и образование якорных волокон, способствуя заживлению ран [52].

Полученные данные послужили основанием для проведения ряда клинических исследований с целью изучения возможности трансплантации МСКкм при лечении пациентов с РДЭБ. Предполагается, что МСКкм мигрируют в зоны повреждений, где, оказывая паракринное действие, способствуют заживлению ран кожи и слизистых оболочек организма [34, 57, 70]. По мнению K. Tamai и соавт. (2011), популяция МСКкм включает субпопуляцию эпителиальных клеток-предшественников, которые и дают регенеративный эффект [53].

M. El-Daraut и соавт. (2016) представили результаты рандомизированного двойного слепого клинического исследования, проведенного с целью изучения эффективности системного (внутривенного) введения МСКкм 14 пациентам (дети) с РДБЭ [70]. Срок наблюдений 1 год. Результаты исследования показали у всех пациентов улучшение клинического состояния. Отмечено снижение количества пузырей, не регистрировали появление новых; при гистологическом исследовании биоптатов кожи выявлено увеличение содержания якорных волокон. Побочные эффекты и нежелательные явления не зарегистрированы. G. Petrof и соавт. (2015) также провели клиническое исследование, в котором приняли участие 10 детей с РДБЭ, которым трехкратно (0; 7; 28-й дни лечения) выполнена внутривенная трансплантация ММСКкм [71]. Следует отметить, что инфузию ММСКкм осуществляли в течение 10 мин, через 1 ч пациенты возвращались к обычному образу жизни. При трехкратном введении аллогенных ММСКкм побочные эффекты не зарегистрированы. Клинически отмечено уменьшение тяжести проявлений заболевания, улучшение качества жизни.

Среди взрослых пациентов с РДБЭ (n=10) клиническое исследование (I/II фазы) проведено E. Rashidghamat и сотр. (2020) [72]. У пациентов отмечены преходящие улучшения клинического состояния, максимальная выраженность которых зарегистрирована на 28-й и 60-й дни после инфузии МСК, что проявилось преимущественно снижением зуда и уменьшением количества пузырей, снижением индекса рубцевания, улучшением качества жизни. Интересно отметить, что в отличие от детей с РБДЭ [70, 71] у взрослых пациентов с РБДЭ увеличения C7 и якорных волокон в ДЭС не зарегистрировано, однако выявлено повышение уровня белков адгезии, характерных для ДЭС, которые, вероятно, и способствовали улучшению состояния кожного покрова. Меньшая выраженность клинического эффекта у взрослых пациентов с РБДЭ по сравнению с детьми, по мнению исследователей, связана с тем, что у взрослых РДЭБ ассоциируется с гораздо большим системным воспалением и большим количеством рубцов [72], так же как и со значительно более высоким риском развития плоскоклеточного рака. Таким образом, результаты проведенных клинических исследований продемонстрировали клиническую эффективность применения инфузий МСКкм и у детей, и у взрослых. Однако в процессе исследования у 2 взрослых пациентов отмечено развитие плоскоклеточного рака, но пока исследователи не связывают данный факт с инфузией МСКкм, поскольку у взрослых с РБДЭ риск самостоятельного развития этого злокачественного процесса очень высок. К настоящему времени в мире проведено более 700 клинических исследований с использованием МСК из различных источников при разных заболеваниях, увеличения онкогенного риска не зарегистрировано. Тем не менее применение МСК у взрослых с РДБЭ требует серьезного анализа и дальнейшего изучения [72]. На этот тип клеточной терапии возлагаются большие надежды, поскольку при внутривенном использовании МСКкм есть вероятность получить системный клинический эффект при восстановлении в первую очередь слизистых оболочек организма.

Следует отметить также еще один тип клеточной терапии, разрабатываемый для лечения пациентов РДБЭ, — это лечение ревертантными кератиноцитами. У пациентов с наследственными заболеваниями кожи порой могут спонтанно появиться участки кожи, в которых есть ревертантные клетки — клетки, геном которых вторично приобрел мутацию, приводящую к заболеванию. Это явление получило название «ревертантный мозаицизм» или «естественная генная терапия» [11, 58]. В культуре клеток или в сформированных эпидермальных лоскутах может содержаться до 30% ревертантных кератиноцитов, однако после их трансплантации в патологические участки объем таких клеток доходит до 3%. Несмотря на это, продемонстрировано клиническое улучшение состояния кожи пациентов — реэпителизация тканей, однако отмечено повторное образование буллезных элементов [1, 11, 73].

Все же одним из самых перспективных подходов к лечению больных с РДБЭ является сочетание методов клеточной терапии, основанной на применении аутологичных клеток и редактировании генома. Данная стратегия включает культивирование первичных клеточных линий (биоптат кожи), дальнейшую генетическую коррекцию клеток и трансплантацию трансгенного аутологичного эквивалента кожи, основная ее задача — создание молекулярных конструкций, способных исправить работу мутантных генов, отвечающих за синтез структурных белков [17, 74, 75]. Такие генетические модификации, основанные на применении векторных конструкций и систем редактирования генома, позволяют осуществить устранение гена с мутацией или внесение копии корректного гена в геном предварительно выделенных из организма донора клеток (генная терапия ex vivo) [11, 75].

В настоящее время исследования проводятся в двух направлениях.

Первое направление — генное модифицирование аутологичных клеток кожи посредством вирусных векторов (ленти-, ретро- и аденовирусного), несущих нормальный COL7A1. В продукции C7, как было описано выше, участвуют 2 типа клеток кожи — кератиноциты и фибробласты, многочисленные группы работают с этими двумя типами клеток. Так, получены обнадеживающие результаты клинических исследований, в которых пациентам с РДБЭ на кожные раны накладывали графты с аутологичными генетически модифицированными эпидермальными стволовыми клетками. Графты полноценно приживались, отмечено нормальное функционирование кератиноцитов, синтезирующих белок C7, не отличающийся от белка здоровой кожи [76, 77].

Z. Siprashvili и соавт. (2016) с помощью ретровирусного вектора, содержащего копию кДНК гена COL7A1 восстановив в аутологичных кератиноцитах пациентов синтез и секрецию полноразмерного белка C7, выполнили трансплантацию аутологичных трансгенных кожных эквивалентов 4 пациентам с РДБЭ [75, 77]. После трансплантации последних в коже больных выявлено образование прикрепляющих фибрилл, в зонах трансплантации наблюдали восстановление целостности кожного покрова. Однако следует отметить, что эффект оказался недолговременным: через 6 мес после трансплантации экспрессия C7 снизилась, а через 1 год у всех пациентов возобновилась клиника РДБЭ [75]. Z. Siprashvili и соавт. связывают данный факт с недостаточным количеством стволовых эпидермальных клеток в используемых эпидермальных трансплантатах [77], поскольку показано, что важным условием успеха такой терапии является наличие в первичных культурах достаточного количества стволовых эпидермальных клеток — генетическая коррекция этих клеток имеет решающее значение для обеспечения долговременного терапевтического эффекта в результате аутологичной трансплантации [75, 78].

Следует также отметить, что негативное действие на приживление трансдуцированных эпидермальных трансплантатов у пациентов с РДБЭ может оказывать их плохая адгезия вследствие аномального ДЭС и обсемененность ран у больных бактериальными и грибковыми агентами [79, 80]. В связи с этим многие исследователи рассматривают фибробласты в качестве более перспективного кандидата для использования генной терапии пациентов с РДБЭ [81]. Так, установлена возможность модификации фибробластов различными векторами, включая ретровирус [79—82] и лентивирус [83], а результаты проведенных доклинических исследований на мышах при местном или системном применении генно-модифицированных фибробластов (посредством инъекций) продемонстрировали возможность восстановления целостности кожи [84].

Первое клиническое исследование (одноцентровое, открытое, фаза I, ClincalTrials.gov NCT02493816.) проведено M. Lwin Su и соавт. (2019), в котором 4 взрослым пациентам с РДБЭ были введены внутрикожно COL7A1-модифицированные посредством самоинактивирующегося лентивируса аутологичные фибробласты кожи, срок наблюдений составил 12 мес [85]. Результаты исследования продемонстрировали безопасность трансплантации генномодифицированных фибробластов (не выявлено побочных эффектов и нежелательных явлений) и раннюю эффективность терапии. На протяжении всего срока наблюдений в местах введения клеток регистрировались трансген COL7A1 и продукция C7. Полученные данные свидетельствуют о перспективности данной разработки для лечения пациентов с РДБЭ и делают возможным проведение II фазы клинического исследования.

Второе направление заключается в использовании систем редактирования генома с целью исправления в нем мутантной последовательности: TALENs (transcription activator-like effector nucleases) — эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции и CRISPR/Cas (the clustered regularly interspaced short palindromic repeats nuclease system) — короткие, расположенные группами, равномерно удаленные друг от друга палиндромные повторы.

Так, W. Wu и соавт (2017) использовали Cas9/sgRNA (локальная доставка рибонуклеопротеинов Cas9/sgRNA) для редактирования COL7A1 в стволовых эпидермальных клетках в коже мышей с РБДЭ [86]. Используя Cas9/sgRNA на животной модели исследователи доказали, что рибонуклеопротеины Cas9/sgRNA способны эффективно удалять экзон с точечной мутацией в COL7A1 in vivo, тем самым восстанавливая продукцию C7, соответственно, восстанавливая целостность кожного покрова.

Разработанная генная терапия на основе рибонуклеопротеинов Cas9/sgRNA имеет ряд преимуществ перед традиционной генно-клеточной терапией и вирусными системами редактирования генов, поскольку: восстанавливает дефектный ген на уровне стволовых клеток in vivo, а это подразумевает долгосрочную (возможно и пожизненную) эффективность в восстановлении дефектного гена; значительно снижает стоимость по сравнению с традиционной генной или клеточной терапией; позволяет обойти возможные риски, связанные с вирусными системами доставки, такие как потенциальные интеграция вирусной ДНК в геном хозяина и активация вызванных вирусом иммунных реакций организма хозяина.

Интерес представляет также и редактирование генов клеток кожи пациентов с РДБЭ с помощью системы TALEN, заключающееся в разрушении мутантного аллеля COL7A1. Так, Magomet Aushev и соавт. (2017), используя данную систему редактирования генов, разрушили мутантный аллель KRT5 в стволовых эпидермальных клетках и выделили клоны кератиноцитов, несущих нормальный COL7A1. [87]. Учитывая, что популяции эпидермальных стволовых клеток способны пройти не менее 180 удвоений, то аутологичные кератиноциты с нормальным COL7A1П могут быть размножены до нужного количества [88] и затем могут быть использованы в виде эпидермальных пластов.

M. Osborn и соавт. (2013) осуществили TALEN-опосредованное редактирование генома на первичной культуре фибробластов кожи пациента с РДБЭ, устранив посредством гомологичной рекомбинации мутацию в гене COL7A1, что способствовало выработке клетками C7 [89]. Впоследствии авторы репрограммировали генномодифицированные фибробласты в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) и продемонстрировали их способность in vivo на основе тератомы к экспрессии COL7A1 и отложению C7 в области ДЭС.

Следует отметить, что подход к лечению пациентов с РБДЭ с использованием ИПСК является одним из наиболее перспективных. ИПСК — это продукт перепрограммирования соматических клеток в эмбриональное состояние [90], соответственно, эти клетки обладают неограниченным пролиферативным потенциалом, а их плюрипотентность позволяет им дифференцироваться в различные клеточные линии, которые могут быть использованы для терапевтического применения. В настоящее время многие исследователи используют ИПСК в комбинации с методами генного редактирования и тканевой инженерии для разработки подхода к лечению пациентов с РДБЭ [91—93], что позволяет разработать персонализированную терапию для пациента и долговременный клинический эффект.

Многообещающий результат был получен J. Jackówa и соавт. (2019) [94] в доклиническом исследовании. Исследователи получили ИПСК от пациентов с РДБЭ, выполнили в них коррекцию COL7A1 путем гомологичной репарации с помощью системы рибонуклеопротеинового комплекса РНК CRISPR-Cas9 (Cas9-gRNAs), затем, дифференцировав полученные ИПСК в кератиноциты и фибробласты, создали на их основе кожные эквиваленты. Эти эквиваленты, состоящие из генокорректированных фибробластов и кератиноцитов, были трансплантированы иммунодефицитным мышам и проанализированы через 2 мес после трансплантации. Анализ выявил экспрессию C7 и образование якорных волокон в области ДЭС. Полученные данные свидетельствуют о том, что с помощью генной коррекции эффективно восстановлены функции белка в полученных из ИПСК фибробластах и кератиноцитах. Результаты данного исследования послужили основой для инициации проведения клинических исследований.

Заключение

Таким образом, за последние годы достигнут значительный прогресс в разработке методов терапии РДБЭ, включающий подходы, основанные и на применении аллогенных клеток (преимущество которых в простоте, быстром масштабировании производственного процесса, возможности неоднократного применения по необходимости, относительно невысокой стоимости), и на применении аутологичных клеток в комбинации с генной терапией на основе вирусов и программируемых синтетических нуклеаз. Преимущество последнего подхода — в персонализированной терапии и долгосрочном (возможно, пожизненном) клиническом эффекте, однако это терапия, которая требует очень высоких затрат. На сегодняшний день все имеющиеся стратегии находятся на разных стадиях изучения и требуют существенной доработки, прежде чем будут внедрены в клиническую практику. И возможно, имеет смысл развивать все стратегии, доказавшие безопасность и клиническую результативность, поскольку только наличие нескольких эффективных, доступных и малодоступных методов, а возможно и их сочетание, позволит своевременно оказывать помощь пациентам с таким тяжелым, изнуряющим заболеванием.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: М.В. Рубаненко, Н.Е. Мантурова, А.Ю. Устюгов, В.Л. Зорин, А.И. Зорина

Сбор и обработка материала: М.В. Рубаненко, А.Ю. Устюгов, О.В. Поршина, В.В. Петунина, Палинкаш А.М.

Написание текста: М.В. Рубаненко

Редактирование: Н.Е. Мантурова, А.Ю. Устюгов, В.Л. Зорин, А.И. Зорина

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.