Крапивница — одна из наиболее часто встречаемых нозологий в дерматологии, аллергологии и среди ургентных состояний. Распространенность крапивницы, длительное и упорное течение, а также низкая эффективность диагностических и лечебных мероприятий обусловливают социальную значимость патологии [1]. Превалирование в клинической картине заболевания выраженного зуда и сопутствующее ему нарушение сна приводят к значительному снижению качества жизни больных [2, 3].
Хроническая спонтанная крапивница (ХСК) развивается в отсутствие специфических триггерных факторов и проявляется появлением волдырей, сопровождаемых зудом и/или ангиоотеками, заболевание длится более 6 нед [4]. ХСК встречается чаще в возрастной категории 20–40 лет, популяционная частота составляет 0,5–1% [5, 6]. В последние десятилетия отмечается рост распространенности ХСК [4, 6]. Доля больных с выявленной причиной первичной манифестации в случаях ХСК колеблется от 0 до 43% [2], в остальных случаях крапивница является идиопатической.
Механизм действия инфекционных агентов на активацию тучных клеток при крапивнице не изучен, однако достаточное количество работ указывает на взаимосвязь крапивницы и инфекционных агентов, вероятно, выступающих в роли триггерного фактора в альтерации иммунного ответа [6—8]. Изменения в звене врожденного и адаптивного иммунитета в свою очередь могут привести к формированию аутореактивности. Результаты исследований свидетельствуют о высокой степени носительства Staphylococcus aureus в носовых ходах на фоне высоких титров антител IgE к антигенам стафилококка [7]. В последние десятилетия встречаются сообщения об ассоциации хронических форм крапивницы с вирусной инфекцией, в том числе с активностью герпесвирусов [8, 9].
Среди патогенетических механизмов на современном этапе выделяют несколько теорий гистаминолиберации. Аутоиммунная теория патогенеза ХСК подтверждается исследованиями, в которых в уртикариях при крапивнице и в волдырях при выполнении теста с аутологичной сывороткой выявляют инфильтраты из Т-лимфоцитов [10]. Помимо этого, в пользу аутоиммунной теории свидетельствуют дисбаланс в сывороточных цитокинах [11—13], наличие антител класса IgG к молекулам IgE и высокоаффинных рецепторов FcεRIα к IgE на тучных клетках и базофилах, анти-IgE-антител к двуспиральной ДНК, тиреопероксидазе и другим аутоантигенам у 50% больных [14, 15], хороший ответ на иммуносупрессивную терапию [16], терапию рекомбинантными гуманизированными анти-FcεRIα-антителами, а также генетическая предрасположенность к аутоиммунным реакциям.
Механизмы участия инфекционных агентов в патогенезе крапивницы не до конца изучены, однако в формировании аутореактивности их ведущая роль неоспорима. Наличие хронической инфекции способствует изменению иммунологической реактивности, что в свою очередь создает благоприятные условия для развития реакций гиперчувствительности [9, 17, 18]. У больных хронической крапивницей отмечается гиперпродукция провоспалительных цитокинов на фоне угнетения клеточного звена иммунитета [18—20]. Изучение эффекторов врожденного иммунитета при ХСК носит фрагментарный характер. Первую линию защиты от антигенов осуществляет ряд факторов, в первую очередь клетки-эффекторы, участвующие во врожденном распознавании патогенов, являющихся связующим звеном между молекулярными высококонсервативными структурами микробов, так называемыми PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns), к которым относятся липополисахариды, пептидогликан, липотейхоевая кислота, одно- и двуспиральная РНК ssРНК, dsРНК, бактериальная и вирусная ДНК, и клетками адаптивного иммунного ответа. Эта взаимосвязь осуществляется посредством сигналов от эффекторных клеток с образ-распознающих рецепторов (Pattern-Recognitions Receptors — PRRs) через быстро действующие растворимые цитокины/хемокины. Одними важными представителями образ-распознающих рецепторов, играющими ключевую роль в патогенезе ряда дерматозов, являются toll-подобные рецепторы (TLRs), экспрессирующиеся на нейтрофилах, макрофагах, дендритных клетках, эндотелиальных и эпителиальных клетках слизистых оболочек. Результатом взаимодействия патоген-ассоциированных молекулярных структур со специфическими рецепторами врожденного иммунитета является реализация врожденного иммунитета — развитие воспаления. В зарубежной литературе исследованиям роли TLRs в патогенезе крапивницы посвящены единичные работы [21].
Недостаточность знаний о клеточных и молекулярных механизмах патогенеза ХСК ограничивает возможности для усовершенствования терапии данного заболевания. Углубленное изучение эффекторов врожденного и адаптивного иммунитета при ХСК — актуальное и перспективное направление научных исследований, позволяющее оптимизировать терапию ХСК с учетом особенностей функционирования врожденного иммунитета.
Материал и методы
Обследованы 134 больных ХСК в возрасте 18–60 лет, из них 76 (56,71%) мужчин. В состав контрольной группы вошли 15 здоровых доноров (8 мужчин и 7 женщин) в возрасте от 16 до 65 лет. Бактериологическое исследование отделяемого органов дыхания у больных ХСК проводили в соответствии с Приказом МЗ СССР от 22.04.85 №535 «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в лабораториях лечебно-профилактических учреждений», регламентирующим набор стандартных питательных сред, позволяющих выявить наиболее максимально возможный спектр микроорганизмов. Вирусологические методы включали ДНК-диагностику слюны методом ПЦР с целью верификации вирусов (ВПГ 1, 2, ВЭБ, ЦМВ, ВГЧ-6), а также исследование на наличие в сыворотке крови противовирусных антител IgG, IgM к ВПГ 1, 2, ВЭБ, ЦМВ, ВГЧ-6 методом твердофазного ИФА. В ходе иммунологических исследований определяли экспрессию TLR 2, 3, 4, 9 на мононуклеарных лейкоцитах периферической крови (МЛПК) с помощью моноклональных антител («Caltag Laboratories» США) на проточном цитометре Cytomix FC-500 («Beckman Coulter», США), иммунофенотип лимфоцитов (CD3+/CD45+, CD3+/CD4+, CD3+/CD8+, CD16+/CD56+, CD45+/CD25+, CD72+, CD45+/CD95+) методом проточной цитометрии. Изучали цитокиновый профиль (IFN-γ, IL-1β, -2, -4, -5, -10) сывороток/плазмы крови методом иммуноферментного анализа (Elisa) c использованием реагентов фирмы «eBioscience» (США). Статистическую обработку результатов выполнили с помощью параметрической и непараметрической статистики (W-критерий Шапиро—Уилка, U-критерий Манна—Уитни, критерий Вилкоксона, критерий Пирсона и Спирмена, метод χ2), используя стандартный пакет статистических программ Windows 7 (StatSoft 7.0). Сравнили все исследуемые показатели в группах больных и здоровых, а также уровни экспрессии TLR 2, 3, 4, 9 в зависимости от длительности заболевания. Исследование одобрено этическим комитетом, все пациенты, включенные в исследование, и здоровые добровольцы подписали добровольное информирование согласие.
Результаты
Под наблюдением находились 134 больных ХСК, преобладали мужчины — 76 (56,71%), причем большинство их них были молодого трудоспособного возраста — 20–40 лет. Медиана среднего возраста при дебюте заболевания составила 32 (23–40) года. При оценке степени активности крапивницы у 60 (44,8%) больных отмечена низкая активность ХСК (1,5±0,3 балла), у 67 (50%) — средняя степень (3,2±0,4 балла), у 7 (5,2%) — тяжелая степень (4,7±1,6 баллов). Рецидивы ХСК ассоциированы с обострениями хронических воспалительных заболеваний лор-органов у 24 (17,8%) больных, вспышками ОРВИ и гриппа у 27 (20%).
Среди сопутствующих заболеваний часто встречались хронические воспалительные заболевания лор-органов — у 35 (26,11%) больных, органов мочевыводящей системы в виде уретритов, циститов — у 19 (14,17%) и ОРВИ — у 37 (27,61%). В анамнезе отмечена хроническая патология желудочно-кишечного тракта у 27 (20,14%) больных, в том числе хронический панкреатит у 8, хронический холецистит у 12, хронический гастродуоденит у 18, хронический колит у 2, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки у 8. Герпесвирусная инфекция в виде орофациального и генитального герпеса отмечена у 19 (14,17%) больных. Микозы кожи, слизистых оболочек и онихомикозы установлены у 21 (15,56%) больных. Сопутствующая патология не выявлена у 31 (23,13%) пациента. При этом частота рецидивов хронических воспалительных заболеваний лор-органов, органов дыхания составила 3,6±0,4 случая в год, хронических воспалительных заболеваний органов мочеполовой сферы — 1,1±0,2, ОРВИ — 3,7±0,5, простого герпеса — 2,9±0,2.
В зеве/носовых ходах выявлена колонизация Staphylococcus aureus носоглотки у 50 (37%) больных, Klebsiella pneumoniae у 26 (75,4%), Proteus vulgaris у 21 (15,6%/), реже Streptococcus spp. — у 16 (11,9%) больных, Moraxella catarrchalis — у 10 (7,46%), P. aeruginosa — у 5 (3,7%), Candida — у 9 (6,7%). Бактериальную колонизацию в клинически значимых концентрациях в сочетании с клиническими проявлениями хронических воспалительных заболеваний лор-органов наблюдали у 72 (53,73%) больных, органов урогенитального тракта — у 31 (32,13%) больного (в том числе хламидийную и микоплазменную инфекцию у 3 (2,24%) и 5 (3,73%) пациентов соответственно), H. pylori-ассоциированные гастрит, гастродуоденит и язвенную болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки — у 20 (14,92%), дисбактериоз кишечника — у 19 (14,17%).
При проведении вирусологических исследований слюны зафиксировано 29 (15,93%) положительных результатов в отношении ДНК ВПГ1, 4 (2,20%) в отношении ВПГ 2, ВЭБ идентифицирован у 35 (19,23%) больных, ВГЧ-6 — у 21 (15,6%), ВГЧ-7 — у 13 (9,7%), аденовирус — у 20 (14,9%).
Исследование сыворотки крови методом ИФА выявило антитела IgG-анти EA EBV у 18 (13,43%) больных, IgM-анти VCA EBV у 13 (9,71%), антитела IgG-анти EBNA у 104 (77,61%). Наличие положительных титров IgG-анти EA, IgM-анти VCA на фоне положительных IgG-анти EBNA ВЭБ и позитивных ответов ПЦР наблюдали у 13 (9,70%) больных в период рецидива крапивницы, что в ассоциации с идентификацией ДНК ВЭБ является основанием для регистраци у этих больных реактивации ВЭБ. В сыворотке крови больных определили IgM-анти HHV-6 у 9 (6,71%) больных, IgM-анти HHV-7 у 10 (7,46%). У этих же больных выявили титры противовирусных антител, превышающие нормальные (референсные) значения.
Признаки реактивации вирусов в сочетании с клиническими признаками вирусных инфекций выявлены у 46 (34,3%) больных. Вирусная инфекция Эпштейна—Барр в фазе реактивации установлена у 13 (9,71%) пациентов. Герпесвирусная инфекция, проявляющаяся в виде простого герпеса в клинической, субклинической и атипичной формах, выявлена у 27 (20,14%) больных.
В целом по группе больных установлена сниженная экспрессия toll-подобных рецепторов по сравнению с группой здоровых лиц, особенно выражены различия в отношении TLR 2, 4 и 9 — соответственно 16,1±2,3, 9,6±1,2, 20,6±5,2% (p<0,05). С повышением длительности заболевания отмечен рост уровней экспрессии TLR 2 и 4 — 28,7±4,9 и 17,3±3,4% (табл. 1).
Таблица 1. Уровни экспрессии toll-подобных рецепторов при хронической спонтанной крапивнице
Table 1. Expression levels of toll-like receptors in chronic spontaneous urticaria
| Группа исследуемых | Число клеток с экспрессией, % (M±σ) | р<0,05 | ||||
| TLR 2 | TLR 4 | TLR 3 | TLR 9 | |||
| 1 | Длительность заболевания 6 мес и менее (n=36) | 3,7±0,9* | 1,8±0,1* | 21,5±6,7* | 21,8±7,4* | TLR 2, 4 (1 и 2, 3, 4), TLR 3 (1 и 3), TLR 9 (1 и 2, 3) |
| 2 | Длительность заболевания более 6 мес (n=98) | 28,7±4,9* | 17,3±3,4* | 30,1±6,9 | 30,4±11,2* | TLR 2, 4 (2 и 1, 4), TLR 9 (2 и 4) |
| 3 | Контроль (здоровые доноры) (n=15) | 27,8±3,6* | 15,2±2,3* | 34,1±6,4* | 32,8±6,3* | TLR 2 (3 и 1, 4), TLR 4 (3 и 1), TLR 3 (3 и 1), TLR 9 (3 и 1, 4) |
| 4 | Больные (n=134) | 16,1±2,3* | 9,6±1,2* | 25,4±8,8* | 20,6±5,2* | TLR 2, 4 (4 и 1, 2, 3), TLR 3, 9 (4 и 3) |
Примечание. *p<0,05 — достоверность различий между группой больных и группой доноров (U-test Манна—Уитни); n — число больных; M — средняя арифметическая.
С целью выявления различий в экспрессии TLRs в зависимости от длительности заболевания все больные ранжированы на две группы: в 1-ю вошли 36 больных с длительностью ХСК до 6 мес включительно, во 2-ю — 98 больных с длительностью ХСК более 6 мес. У больных с длительностью процесса до 6 мес выявлено снижение экспрессии TLR 2 и 4 (3,7±0,9 и 1,8±0,1%) — ниже значений в группе здоровых лиц (16,1±2,3 и 9,6±1,2%). У длительно болеющих показатели TLR 2 и 4 составляют 28,7±4,9 и 17,3±3,4%, что выше показателей в группе здоровых лиц соответственно в 6 и 4 раза. Это может указывать на рост уровней экспрессии этих рецепторов в динамике развития крапивницы. Длительность заболевания не влияла на экспрессию TLR 3 и 9 (см. табл. 1).
Группа больных крапивницей характеризовалась снижением уровня CD3+ (58,5±4,3%), CD4+ (37,9±6,6%). Выявлено повышение содержания активационных молекул CD25+ (14,0±2,0%), рецептора к IL-2. Нахождение на верхней границе нормы уровня лимфоцитов CD95+ (60,0±15,5%) можно интерпретировать как признак активации апоптоза лимфоцитов. Отмечено повышение содержания CD72+ (16,7±4,1%). Остальные показатели субпопуляционного состава исследуемых лимфоцитов не отличались от нормальных (референсных) значений, выявленных в многочисленных когортах здоровых добровольцев в лаборатории механизмов регуляции иммунитета ФГБНУ НИИВС и согласующихся с исследованиями других авторов.
При изучении ряда цитокинов в сыворотке крови в целом по группе больных выявлена гиперпродукция провоспалительного IL-1β (24,16±2,28 пг/мл), а также противоспалительных IL-4 (27,87±3,75 пг/мл) и IL-5 (23,61±4,11 пг/мл) (табл. 2).
Таблица 2. Уровни цитокинов в сыворотке крови больных ХСК по сравнению с группой здоровых лиц, M±σ; Me (LQ—UQ)
Table 2. Serum cytokine levels in patients with CSU compared with a group of healthy individuals, M±σ; Me (LQ—UQ)
| Цитокины, пг/мл | Здоровые (n=15) | Больные ХСК (n=134) |
| IL-1β | 12,0±3,1*; 12,5 (11–13,5) | 24,16±2,28*; 25 (23–27) |
| IL-2 | 26,2±3,3; 26 (23,7–28) | 19,51±4,17; 21 (17,9–23,8) |
| IL-4 | 11,0±4,3*; 11,1 (10–11,9) | 27,87±3,75*; 26 (26–29,1) |
| IL-5 | 14,0±2,3*; 14,2 (13,4–15,2) | 23,61±4,11*; 24 (20–25,8) |
| IL-10 | 16,1±2,8; 16,3 (15,5–16,9) | 14,12±2,55; 14,8 (13,2–15,9) |
| IFN-γ | 28,0±1,5; 27,8 (26,4–29,6) | 30,90±4,23; 31 (28,5–33,8) |
Примечание. *p<0,05 — достоверность различий между группой больных и группой доноров (U-test Манна—Уитни); n — число больных; M — средняя арифметическая; Me — медиана;. σ — стандартное отклонение; LQ—UQ — 25—75-й перцентили.
Повышенные средние значения IgE выявлены в погруппах больных ХСК, сопровождаемой рецидивами вирусных инфекций, и при наличии сочетанной вирусно-бактериальной патологии (131,74±25,41 и 115,43±30,13 кЕ/л соответственно). Повышение уровня IgE также наблюдалось при наличии сопутствующих атопических заболеваний — у 21 (15,67%) больного (бронхиальная астма у 3 (14,28%), аллергический ринит у 17 (80,95%), атопический дерматит у 5 (23,80%)). В подгруппе больных ХСК, сопровождаемой рецидивами бактериальных инфекций, а также в подгруппе больных без признаков активности инфекционных агентов уровни общего IgE были в пределах нормальных значений.
Заключение
Установлено, что ХСК сопровождается значительными иммунологическими нарушениями, часть из которых характерна для группы в целом. Выявлены также иммунологические особенности в зависимости от характера течения процесса.
Для группы обследованных больных ХСК характерен низкий уровень экспрессии toll-подобных рецепторов TLR 2, 3, 4, 9 на клетках крови. В группе исследуемых наиболее низкими являлись уровни экспрессии TLR 2 и 4, что указывает на нарушение распознавания PAMPs грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также дрожжеподобных грибов. В то же время выявлены особенности экспрессии TLR 2 и 4 в зависимости от длительности заболевания ХСК. У больных ХСК с длительностью заболевания до 6 мес уровни экспрессии TLR 2 и 4 снижены. При дальнейшем развитии ХСК происходит нарастание уровней экспрессии этих рецепторов. Снижение экспрессии TLR 2 и 4 при ХСК может указывать на роль дисфункций в системе toll-подобных рецепторов в развитии хронических форм крапивницы, что приводит к изменениям взаимодействия клеток в ходе иммунного ответа.
Исследование субпопуляций лимфоцитов также выявило наличие нарушений при ХСК. Отмечено снижение содержания Т-лимфоцитов с маркерами CD3/CD45, CD3/CD4. У больных повышение экспрессии маркера ранней активации лимфоцитов (CD45/CD25) наблюдали на фоне усиленной экспрессии маркера CD45/CD95, отражающего индукцию апоптоза лимфоцитов. Это можно расценить как готовность лимфоцитов к апоптозу, и это условие усугубляет вторичный иммунодефицит. В ходе исследования у больных ХСК также выявили снижение содержания Т-лимфоцитов с маркером CD3+/CD8+ на фоне повышения содержания субпопуляций В-лимфоцитов (CD72+).
Изучение цитокинового профиля у больных ХСК выявило повышенную продукцию провоспалительного IL-1β, противовоспалительных IL-4 и -5. Повышение синтеза IL-4 и -5, а также результаты изучения субпопуляций лимфоцитов указывают на вероятную активацию Т-лимфоцитов по Th2-пути. Анализ содержания общего IgE в сыворотке крови больных ХСК выявил его повышение только у 27,61% пациентов, у этих же больных отмечено повышение уровня IL-4 в сыворотке крови. Таким образом, спектр синтезируемых цитокинов, выявленный у больных ХСК, соответствует усилению роли Th2-лимфоцитов (IL-4, -5).
Повышенные средние значения IgE выявлены у больных ХСК, сопровождаемой рецидивами вирусных инфекций и при наличии сочетанной вирусно-бактериальной патологии, а также у пациентов при наличии сопутствующих атопических заболеваний.
Таким образом, в исследовании эффекторов врожденного иммунитета у больных ХСК показано снижение количества мононуклеарных лейкоцитов периферической крови, экспрессирующих все исследуемые toll-подобные рецепторы, особенно TLR 2 и 4, что указывает на возможную связь между врожденным иммунитетом и этиопатогенезом ХСК. Рецепторы TLR 2, 4 распознают ряд PAMPs, включая бактериальные липопротеины, пептидогликан и липотейхоевые кислоты. Агонисты TLR 2, 4 в многочисленных исследованиях показывают высокую иммуномодулирующую активность и адъювантные свойства, что открывает перспективы для использования агонистов TLR 2 в качестве фармацевтических препаратов для терапии аллергических заболеваний, в том числе ХСК, которые могут выступать в роли молекулярной мишени в лечении ХСК [22].
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Сорокина Е.В., Ахматова Н.К.
Сбор и обработка материала: Сорокина Е.В., Сивакова Н.Г., Сходова С.А.
Статистическая обработка данных: Сорокина Е.В., Сивакова Н.Г., Сходова С.А.
Написание текста: Сорокина Е.В.
Редактирование: Сорокина Е.В., Ахматова Н.К.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
<