Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.
Иммуногистохимическое исследование кожи после мезотерапии полипептидами и препаратом на основе нуклеиновых кислот
Журнал: Клиническая дерматология и венерология. 2018;17(3): 22‑31
Прочитано: 2950 раз
Как цитировать:
При «омоложении» кожи главными целями являются увеличение биосинтетической активности фибробластов, оптимизация физиологических функций, усиление клеточной активности, увеличение синтеза коллагена, эластина и гиалуроновой кислоты, благодаря чему кожа становится более плотной, блестящей и увлажненной [1].
Мезотерапия — метод профилактики и лечения возрастных изменений кожи, в том числе морщин, так как позволяет легко проникнуть во внутренние слои кожи и доставить непосредственно во внеклеточное пространство препараты, необходимые для активизации метаболических процессов стареющих тканей [2].
Одним из эффектов, который достигается при мезотерапии, является пунктуационный, связанный с воздействием иглы на кожу. Микроигольчатая терапия стимулирует выработку коллагена путем запуска синтеза и секреции каскада сигнальных молекул, способствующих ранозаживлению после травмы. Время восстановления после процедуры микроукалываний (микронидлинг) минимальное [3].
Другим эффектом является фармакологическое воздействие лекарства. При изучении фармакокинетики интрадермально вводимых препаратов было показано, что при более поверхностных инъекциях (не более 2 мм глубиной) препарат элиминирует значительно дольше. Создание депо фармакологически активных веществ в коже позволяет доставить непосредственно к клеткам кожи витамины, микроэлементы, микропептиды, биологически активные энергосберегающие вещества, являющиеся строительным и питающим клетку материалом. Этот путь введения дает возможность применять при лечении пациента более низкие дозы препаратов [2].
Наше внимание привлекли препараты, содержащие ДНК- и РНК-комплексы, а также низкомолекулярные фракции пептидов, аптечной сети. Нуклеиновые кислоты выполняют важную роль в процессах жизнедеятельности организма. Их функция заключается прежде всего в сохранении и передаче генетической информации и проявляется в биосинтезе белка [4]. Нуклеиновые кислоты — один из важных компонентов интегрального и иммунологического гомеостаза организма [5].
Геронтологами показано, что при старении наблюдается резкое снижение синтеза многих регуляторных пептидов с потерей чувствительности к ним клеток-мишеней [6]. Экстракты различных животных тканей являются источником получения регуляторных тканеспецифичных пептидов [7]. Эндогенные пептиды участвуют в регуляции дифференцировки и пролиферации клеток, изменяя функциональную активность генома и процессы синтеза белка в зависимости от состояния многоклеточной системы [8]. Пептидные регуляторы являются многофункциональными. Они способны воздействовать как на дифференцированные клетки взрослого организма, запуская пролиферацию клеток и поддерживая при этом тканевую специфичность, так и на полипотентные эмбриональные клетки, индуцируя тканеспецифическую дифференцировку [6].
Цель исследования — изучить влияние мезотерапии полипептидами тимуса и эпифиза, а также препаратом, содержащим нуклеиновые кислоты, на иммуногистохимические показатели кожи.
Трем пациентам в разных стационарах города за 1 нед до плановой абдоминопластики и иссечения рубца на ограниченном участке кожи по методике «глубокий наппаж» вводили нуклеотидный препарат (1-я группа), низкомолекулярные фракции полипептидов тимуса (2-я группа) и эпифиза (3-я группа), изотонический раствор NaCl (4-я группа) и обкалывали кожу иглой (5-я группа). Все пациенты подписали информированное согласие на процедуру. После хирургического лечения кусочки кожи были доставлены на кафедру косметологии ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России для иммуногистохимического исследования (ИГХ) с целью выявления экспрессии маркеров апоптоза (р53), антиапоптоза (Bcl-2), пролиферации (Ki-67), антигена гистосовместимости (HLA-DR) и рецептора к эпидермальному фактору роста (EGFR).
Биоптаты кожи транспортировали из клиники в лабораторию в салфетке, пропитанной 0,9% раствором NaCl, затем образцы кожи 10×10×5 мм монтировали на криостатные блоки и замораживали в холодильнике при температуре –40 °С. Изготавливали криостатные срезы толщиной 5 мкм таким образом, чтобы плоскость сечения проходила вертикально; срезы помещали на предметные стекла, высушивали на воздухе при комнатной температуре не менее 2 ч, затем фиксировали в течение 10 мин в абсолютном ацетоне и высушивали. Приготовленные срезы окрашивали или хранили при температуре –20 °С.
Экспрессию клеточных маркеров определяли методом непрямой ИГХ. ИГХ проводили полимерным методом с использованием системы детекции Super Sensitive IHC Detection Systems («Bio Genex»). Характеристика моноклональных антител к исследуемым маркерам представлена в табл. 1.
После первой инкубации срезы отмывали в буфере в течение 10 мин, затем инкубировали с реактивом Super Enhanser («Bio Genex», США), а после того — с реактивом Polymer-HRP (конъюгат с пероксидазой; компания «Bio Genex», США) в течение 30 мин с дальнейшей 3-кратной промывкой. Затем срезы окрашивали раствором диаминобензидина из набора («Bio Genex», США), препарат разводили по инструкции производителя. Окрашивали 5—15 мин, затем промывали дистиллированной водой, ядра докрашивали гематоксилином Carrazzi. О положительной экспрессии маркеров свидетельствовала коричневая окраска на фоне голубой окраски ядер.
Гистологические препараты фотографировали. По отдельности производили съемку эпидермиса и дермы.
Фотографии обрабатывали с применением программы Морфология 5.0, где выделяли области скопления белка — иммуногистохимического маркера; в зависимости от характера маркера проводили морфометрию. Для определения р53 и Ki-67 подсчитывали количество меченых клеток в поле зрения микроскопа, для Bcl-2 и EGFR — оптическую плотность, для HLA-DR — долю (в процентах) окрашенной площади на препарате. В качестве контроля использовали препараты интактной кожи, показатели которой принимали за 100% (6-я группа).
cтатистическую обработку результатов проводили в программе Statistica 6.1. Соответствие показателей ИГХ нормальному распределению оценивали с помощью критерия Колмогорова—Смирнова. Для выявления различий между группами был проведен однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Внутригрупповые различия выявляли с использованием апостериорных критериев, в частности критерия Тьюки (Tukey HSD). Достоверность различий принимали на уровне р≤0,05.
Следует отметить, что экспрессию маркера p53 в эпидермисе и дерме отмечали в единичных препаратах, поэтому в статистическую обработку не включали.
Межгрупповые сравнения (табл. 2)
В эпидермисе по маркеру Bcl2 (табл. 3)
По маркеру EGFR (табл. 4)
В эпидермисе при внутригрупповом сравнении (табл. 5)
Таким образом, через 1 нед после нидлинга незначительно снижается пролиферация клеток в эпидермисе, в дерме — повышается с аналогичной тенденцией изменений маркера к EGFR, при этом маркер апоптоза не обнаруживается, маркер антиапоптоза практически не изменяется, что не позволяет судить о клеточном обновлении. Механическая травма кожи иглой более чем на 20% повышает экспрессию маркера HLA-DR в эпидермисе, снижая этот показатель примерно на такую же величину в дерме, что не является статистически достоверным.
После однократного введения изотонического раствора NaCl через 1 нед отмечают самое высокое (более чем на 35%) повышение пролиферации клеток в эпидермисе и значительное снижение этого показателя в дерме, при этом экспрессия EGFR практически не изменяется. Маркер апоптоза также не определяется, маркер антиапоптоза практически не изменяется, а показатели HLA-DR снижаются на 10% в эпидермисе и почти на 50% в дерме. Полученные результаты отличаются от тех, которые наблюдались после механической травмы иглой. Нельзя исключить, что, с одной стороны, изотонический раствор NaCl влияет на градиент движения жидкости от базальной мембраны к поверхности рогового слоя эпидермиса, участвуя в повышении клеточной пролиферации и снижая антигенную нагрузку, с другой — способствует разведению основного вещества дермы.
Через 1 нед после однократного введения препарата, содержащего нуклеиновые кислоты, значительно снижается пролиферация клеток эпидермиса и дермы, не обнаруживается маркер апоптоза, не изменяется экспрессия маркеров антиапоптоза и EGFR. При анализе динамики показателя HLA-DR обнаружены его значительное (более чем на 40%) повышение в эпидермисе и снижение (более чем на 20%) в дерме. Влияние нуклеотидного препарата на кожу отличается от нидлинга более выраженным подавлением пролиферации клеток в эпидермисе и дерме, отсутствием влияния на EGFR, более высоким воздействием (на 20%) на антигенпрезентирующие клетки. От изотонического раствора NaCl нуклеотидные препараты отличаются подавлением пролиферации клеток эпидермиса и высоким значением антигенпрезентирующих клеток в эпидермисе.
Низкомолекулярные фракции полипептидов тимуса снижают пролиферацию клеток в эпидермисе, наиболее выраженно в дерме. При отсутствии выявления маркера апоптоза они, единственные в группах сравнения, повышают экспрессию маркера антиапоптоза в дерме, что не исключает повышение выживания клеток и клеточной дифференцировки. Полипептиды тимуса вызывают максимальное повышение (более чем на 50%) антигенпрезентирующих клеток в эпидермисе и минимальное их снижение в дерме, возможно за счет их перераспределения.
Низкомолекулярные фракции полипептидов эпифиза через 1 нед после введения на 20% повышают пролиферацию клеток эпидермиса, снижая этот показатель в дерме. При введении полипептидов эпифиза в эпидермисе и дерме встречались единичные клетки с маркером апоптоза, но аналогично полипептидам тимуса в некоторой степени полипептиды эпифиза повышали экспрессию маркера антиапоптоза в дерме. Они повышают число антигенпрезентирующих клеток в эпидермисе более чем на 40%, снижая их число в дерме.
Однофакторный анализ (ANOVA) сравнения шести групп показал, что проведенные манипуляции оказали влияние на такие маркеры эпидермального слоя кожи, как Ki67 (F=14,47; p≤0,001) и HLA-DR (F=8,02; p≤0,001), но не повлияли на Bcl2 (F=1,71; p≥0,05) и рецептор к EGFR (F=1,41; p≥0,05) (табл. 6).
В дермальном слое анализ сравнения шести групп по фактору однократного введения препарата показал, что проведенные процедуры оказали влияние на такие маркеры, как Bcl2 (F=3,08; p≤0,05), Ki-67 (F=4,26; p≤0,001) и HLA-DR (F=2,58; p≤0,05), но не повлияли на EGFR (F=0,79; p≥0,05) (табл. 7).
Через 1 нед после механической травмы кожи иглой наблюдается очень незначительное перераспределение EGFR в дерму, где отмечается некоторое повышение пролиферации клеток. Рост антигенпрезентирующих клеток в эпидермисе может отражать степень реакции на повреждение эпидермиса.
Введение изотонического раствора NaCl может способствовать пролиферации клеток эпидермиса.
Препарат, содержащий нуклеиновые кислоты, подавляет пролиферацию клеток эпидермиса и дермы, но значительно повышает число антигенпрезентирующих клеток в эпидермисе. Полипептиды тимуса вызывают максимальное повышение антигенпрезентирующих клеток в эпидермисе при снижении их пролиферативной активности, наиболее выраженно снижают пролиферацию клеток в дерме, где больше других препаратов повышают показатели антиапоптоза. Полипептиды эпифиза повышают число антигенпрезентирующих и пролиферирующих клеток в эпидермисе, в небольшой степени повышают показатели антиапоптоза в дерме.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
1e-mail: tnkor@mail.ru
2e-mail: medicine@nrcerm.ru
Подтверждение e-mail
На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.
Подтверждение e-mail
Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.