Смирнова Н.Г.

Кафедра патофизиологии

Чефу С.Г.

лаборатория экспериментальных исследований центра лазерной медицины Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова

Коваленко А.Л.

Дирекция по науке ООО "НТФФ "Полисан", Санкт-Петербург

Грашин Р.А.

кафедра клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии Министерства обороны РФ

Власов Т.Д.

Кафедра патофизиологии

Состояние свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты при экспериментальном холестазе

Журнал: Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. 2011;(3): 50-55

Просмотров : 228

Загрузок : 11

Как цитировать

Смирнова Н. Г., Чефу С. Г., Коваленко А. Л., Грашин Р. А., Власов Т. Д. Состояние свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты при экспериментальном холестазе. Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. 2011;(3):50-55.
Smirnova N G, Chefu S G, Kovalenko A L, Grashin R A, Vlasov T D. Free-radical oxidation and antioxidant protection by experimental cholestasis. Khirurgiya. 2011;(3):50-55.

Авторы:

Смирнова Н.Г.

Кафедра патофизиологии

Все авторы (5)

Холестаз - клинический синдром, обусловленный нарушением образования и выделения желчи в двенадцатиперстную кишку. Причины холестаза могут быть самыми разнообразными: от патологических изменений гепатоцитов с нарушением транспорта билирубина через клеточную мембрану до нарушения проходимости желчевыводящих путей вплоть до фатерова соска [3, 8].

В основе синдрома внепеченочного холестаза лежит нарушение оттока желчи вследствие механической обтурации внепеченочных желчных протоков. Наиболее частыми причинами внепеченочного холестаза служат желчнокаменная болезнь с обтурацией камнем общего желчного протока и онкологические заболевания, в частности рак поджелудочной железы, желчного пузыря и внепеченочных желчных протоков.

Желчные кислоты (ЖК) являются конечными продуктами обмена холестерина и основными компонентами желчи и играют важную роль в процессах переваривания и всасывания жиров, способствуя росту и функционированию нормальной кишечной микрофлоры [8, 10]. При холестазе нарушается синтез ЖК в гепатоцитах, перераспределяется соотношение первичных (холевая, хенодезоксихолевая) и вторичных (литохолевая, дезоксихолевая, урсодезоксихолевая) ЖК с увеличением количества гидрофобных ЖК [3, 10].

По данным литературы [3, 10], основными факторами, повреждающими гепатоциты, являются гидрофобные ЖК (литохолевая, дезоксихолевая), которые повреждают липидный бислой клеточных мембран гепатоцитов и запускают механизм оксидативного стресса, в результате чего происходит повреждение рецепторов, белковых переносчиков, а также встроенных в мембрану ферментов. Вследствие выхода кальция и натрия в клетку происходит набухание и повреждение клеточных митохондрий, выход цитохрома С в клетку и ее гибель по механизмам некроза и апоптоза.

Гидрофильные ЖК (урсодезоксихолевая, хенодезоксихолевая) оказывают цитопротективное действие, уменьшая пул гидрофобных ЖК, участвующих в энтерогепатической циркуляции, и таким образом снижая степень токсического повреждения гепатоцитов гидрофобными ЖК.

При холестазе повышается уровень свободных радикалов не только в системе желчевыделения, но и в других органах и системах, анатомически и функционально связанных между собой. Так, уровень супероксидного радикала (O2-) на 10-й день после перевязки экспериментальным животным общего желчного протока возрастал в печени на 96%, в кишечнике на 110%, в почках на 118% и в головном мозге на 142% [9].

Летальность пациентов с обструктивной механической желтухой обусловлена развитием не только печеночной, но и почечной недостаточности, геморрагическими и тромбоэмболическими осложнениями [1], возможным пусковым механизмом которых является оксидативный стресс.

Инфузионный гепатопротектор ремаксол (ООО «НТФФ «ПОЛИСАН») - сбалансированный полиионный инфузионный раствор, оказывающий гепатопротекторное действие. Препарат содержит активные компоненты - янтарную кислоту, рибоксин, никотинамид, метионин, а также электролиты - натрия хлорид, магния хлорид, калия хлорид и сольстабилизирующий агент N-метилглюкамин. Показанием к назначению ремаксола являются нарушения функции печени вследствие острого или хронического ее повреждения (токсические, алкогольные, лекарственные гепатиты) [5-7].

Цель данного исследования - изучение состояния процессов свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты на модели экспериментальной обтурационной механической желтухи у крыс, а также влияния инфузионного гепатопротектора ремаксола на эти показатели.

Материал и методы

Исследование выполняли на 28 крысах-самцах линии Вистар (возраст 18 нед, масса 270-300 г), полученных из питомника «Рапполово» РАМН (Санкт-Петербург). Все эксперименты проводили под анестезией (тиопентал натрия 50 мг/кг внутрибрюшинно).

Экспериментальный холестаз моделировали путем перевязки общего желчного протока [8]. Крысам под общей анестезией производили срединную лапаротомию, органы брюшной полости сдвигали и выделяли общий желчный проток. Последний перевязывали лигатурой 4-0, после чего органы брюшной полости крысы аккуратно возвращали в прежнее положение и послойно ушивали операционную рану. Ложнооперированным животным производили срединную лапаротомию без перевязки общего желчного протока.

Животные (n=28) были разделены на три группы: ложнооперированные (n=7), группа животных, которым перевязывали общий желчный проток и вводили физиологический раствор (n=11), группа животных, которым перевязывали общий желчный проток и вводили ремаксол (n=10). Препараты исследования вводили ежедневно в течение 10 дней в хвостовую вену крыс в объеме 1мл на 100 г. На 10-й день после моделирования холестаза животных выводили из опыта, печень и кровь забирали для дальнейшего исследования.

Стабилизированную кровь лабораторных животных для выделения эритроцитов центрифугировали в течение 10 мин в центрифуге К-24 D (Германия) при 3000 об/мин (3000 g) и температуре 2°C. Полученную эритроцитную массу замораживали, погружая в жидкий азот, после чего хранили в холодильной камере при –60оС.

Печень отмывали холодным физиологическим раствором от крови в течение 35-50 с, замораживали в жидком азоте и до начала исследований хранили в холодильной камере при –60оС.

Концентрацию восстановленного глутатиона, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы, каталазы, малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в тканях печени и эритроцитах определяли спектрофотометрическим методом.

Концентрацию восстановленного глутатиона определяли по методике G. Ellman (1959) (А.И. Карпищенко (ред.), 2002) и выражали в мкмоль на 1 г ткани (для гомогенатов ткани) или в мкмоль на 1 г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Определение концентрации диеновых конъюгатов осуществляли по методике И.Д. Стальной (1977) (А.И. Карпищенко (ред.), 2002) и выражали ее в нмоль на 1 г ткани (для гомогенатов ткани) или в нмоль на 1 г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Концентрацию малонового диальдегида определяли по методу M. Uchiyama (1978) (А.И. Карпищенко А.И.(ред.), 2002) и выражали в нмоль на 1 г ткани (для гомогенатов ткани) и нмоль на 1 г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Определение активности глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9) проводили по методу А.Н. Гавриловой (1986) и выражали в мкмоль/мин на 1 г белка (для гомогенатов ткани) или в мкмоль/мин на 1 г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Определение активности глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2) осуществляли методом I. Carlberg и B. Mannervik (1985) и выражали в мкмоль/мин на 1 г белка (для гомогенатов ткани) или в мкмоль/мин на 1 г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - ГЛ-6-ФДГ (КФ 1.1.1.49.) определяли по методу A. Kornberg и соавт. (1955) и выражали в мкмоль/мин на 1 г белка (для гомогенатов ткани) или мкмоль/мин на 1 г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Активность глутатион-S-трансферазы определяли по методу W. Habig и W. Jakoby (1981) и выражали в мкмоль/мин на 1 г белка (для гомогенатов ткани) или мкмоль/мин на 1 г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Для определения активности каталазы (КФ 1.11.1.6.) использовали метод М.А. Королюка и соавт. (1988). Результат выражали в мкмоль/мин на 1 г белка) (для гомогенатов ткани) или мкмоль/мин на 1 г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью пакета прикладных программ Microsoft Exel 2007 и StatSoft Statistica 6.0. В работе приведены средние значения и их стандартные отклонения, а также медианы и процентили. В статистическом анализе использовали непараметрический метод сравнения Манна-Уитни. Значения считали достоверными при заданном критерии вероятности p≤0,01 и p≤0,05.

Результаты и обсуждение

В течение первых нескольких дней после перевязки общего желчного протока у всех экспериментальных животных появлялась и в последующие 10 дней нарастала желтушность слизистых, стул становился ахоличным, моча темнела. Во всех группах животных летальных исходов не было.

О развитии у экспериментальных животных оксидативного стресса можно судить по изменению показателей глутатионового звена антиоксидантной защиты и уровня первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ).

В группе с холестазом и введением физиологического раствора отмечали усиление свободнорадикальных процессов и снижение антиоксидантной активности в тканях печени, что выражалось в снижении в 2 раза уровня восстановленного глутатиона по сравнению с таковым в группе ложнооперированных животных, угнетении активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов - глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, достоверном повышении уровня первичных и вторичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов и малонового диальдегида (р=0,0005) (табл. 1).

В группе животных с холестазом и введением ремаксола отмечалось достоверное повышение показателей глутатионового звена антиоксидантной защиты, расщепляющих перекись водорода и органические перекиси, в том числе гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот по сравнению с таковыми в группе животных, получавших физиологический раствор. Кроме того, достоверно повышался уровень глутатионпероксидазы (р=0,0002) и глутатионредуктазы (р=0,0002), как и уровень ГЛ-6-ФДГ, способствующей образованию восстановленного НАДФ в реакциях пентозофосфатного пути окисления глюкозы, необходимого для глутатионредуктазной реакции (р=0,0001).

Также достоверно по сравнению в группой физиологического раствора был повышен уровень каталазы (р=0,001), являющейся основным ферментом, расщепляющим перекись водорода, и синергистом глутатионпероксидазы.

Глутатион-S-трансфераза, участвующая в инактивации эндогенных метаболитов, осуществляет одну из реакций печеночного метаболизма 2-й фазы - конъюгацию глутатиона с токсичными продуктами ПОЛ, которые образуются при повреждении гепатоцитов гидрофобными ЖК [2, 4, 10]. В группе с введением ремаксола ее содержание также достоверно повышалось по сравнению с группой физиологического раствора (р=0,0035).

На фоне введение ремаксола достоверно по сравнению с группой физиологического раствора снижался уровень показателей промежуточных и конечных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида (р=0,0001) и диеновых конъюгатов (р=0,0006).

В табл. 2

приведены результаты измерения тех же показателей в эритроцитах экспериментальных животных. В группе с холестазом и введением физиологического раствора в эритроцитах животных, как и в тканях печени, отмечалось усиление свободнорадикальных процессов и уменьшение антиоксидантной активности, что выражалось в снижении уровня восстановленного глутатиона по сравнению с группой ложнооперированных животных в 1,7 раза (р=0,003) и угнетении активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов - глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, достоверном повышении уровня первичных и вторичных продуктов ПОЛ -диеновых конъюгатов (0,0009) и малонового диальдегида (р=0,0067).

Отмечалась некоторая разница в динамике показателей глутатионового звена антиоксидантной защиты в группе животных с введением ремаксола и физиологического раствора в тканях печени и эритроцитах.

Так, в группе с ремаксолом в эритроцитах, как и в тканях печени, регистрировалась достоверная разница показателей глутатионредуктазной реакции по сравнению с группой физиологического раствора, повышался уровень глутатионредуктазы (р=0,0019) и ГЛ-6-ФДГ, способствующей образованию восстановленного НАДФ в реакциях пентозофосфатного пути окисления глюкозы, необходимого для глутатионредуктазной реакции (р=0,0001).

В эритроцитах не было динамики значений фермента глутатионпероксидазы по сравнению с таковой в группе физиологического раствора (р=0,158). Поскольку на этом фоне достоверно повышался уровень каталазы (р=0,0001), и максимальная ее активность отмечалась именно в эритроцитах [2, 4], можно предположить, что в эритроцитах антиоксидантная защита осуществляется именно этим ферментом.

Активность и стабильность ключевых ферментов антиоксидантной защиты являются взаимосвязанными и действуют однонаправлено. Только согласованное действие этих ферментов - глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и каталазы необходимо для защиты от инактивирующего воздействия оксидативного стресса.

Поскольку однонаправленная антиоксидантная активность ремаксола отмечалась как в тканях печени, так и в эритроцитах, этот инфузионный гепатопротектор можно рассматривать и как инфузионный субстратный антигипоксант. Антиоксидантное действие ремаксола, возможно, связано с входящей в его состав янтарной кислотой, которая стимулирует дыхание и энергообразование в клетках, улучшает процессы утилизации кислорода тканями и восстанавливает активность ферментов антиоксидантной защиты [6, 7].

Таким образом, при остром экспериментальном холестазе отмечается усиление свободнорадикальных процессов и снижение антиоксидантной активности в тканях печени и эритроцитах, что выражается в снижении уровня восстановленного глутатиона, угнетении активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов - глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, и глутатион-S-трансферазы, повышении уровня первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов - диеновых коньюгатов и малонового диальдегида.

Инфузионный гепатопротектор ремаксол оказывает антиоксидантное действие, поскольку после его 10-дневного введения происходили следующие изменения:

- повышался уровень ферментов, участвующих в восстановлении окисленной формы глутатиона, - глутатионредуктазы и ключевого фермента пентозофосфатного цикла глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, способствующей образованию восстановленного НАДФ в реакциях пентозофосфатного пути окисления глюкозы;

- достоверно повышался уровень глутатионзависимых антиоксидантных ферментов - глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы, как и каталазы - основного фермента, расщепляющего перекись водорода и являющегося синергистом глутатионпероксидазы;

- снижался уровень продуктов перекисного окисления липидов - малонового диальдегида и диеновых конъюгатов по сравнению с таковым в группе животных, получавших физиологический раствор.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail