Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Смирнова Н.Г.

Кафедра патофизиологии

Чефу С.Г.

лаборатория экспериментальных исследований центра лазерной медицины Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова

Коваленко А.Л.

Дирекция по науке ООО "НТФФ "Полисан", Санкт-Петербург

Грашин Р.А.

кафедра клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии Министерства обороны РФ

Власов Т.Д.

Кафедра патофизиологии

Состояние свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты при экспериментальном холестазе

Авторы:

Смирнова Н.Г., Чефу С.Г., Коваленко А.Л., Грашин Р.А., Власов Т.Д.

Подробнее об авторах

Журнал: Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. 2011;(3): 50‑55

Просмотров: 661

Загрузок: 20

Как цитировать:

Смирнова Н.Г., Чефу С.Г., Коваленко А.Л., Грашин Р.А., Власов Т.Д. Состояние свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты при экспериментальном холестазе. Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. 2011;(3):50‑55.
Smirnova NG, Chefu SG, Kovalenko AL, Grashin RA, Vlasov TD. Free-radical oxidation and antioxidant protection by experimental cholestasis. Pirogov Russian Journal of Surgery = Khirurgiya. Zurnal im. N.I. Pirogova. 2011;(3):50‑55. (In Russ.).

?>

Холестаз - клинический синдром, обусловленный нарушением образования и выделения желчи в двенадцатиперстную кишку. Причины холестаза могут быть самыми разнообразными: от патологических изменений гепатоцитов с нарушением транспорта билирубина через клеточную мембрану до нарушения проходимости желчевыводящих путей вплоть до фатерова соска [3, 8].

В основе синдрома внепеченочного холестаза лежит нарушение оттока желчи вследствие механической обтурации внепеченочных желчных протоков. Наиболее частыми причинами внепеченочного холестаза служат желчнокаменная болезнь с обтурацией камнем общего желчного протока и онкологические заболевания, в частности рак поджелудочной железы, желчного пузыря и внепеченочных желчных протоков.

Желчные кислоты (ЖК) являются конечными продуктами обмена холестерина и основными компонентами желчи и играют важную роль в процессах переваривания и всасывания жиров, способствуя росту и функционированию нормальной кишечной микрофлоры [8, 10]. При холестазе нарушается синтез ЖК в гепатоцитах, перераспределяется соотношение первичных (холевая, хенодезоксихолевая) и вторичных (литохолевая, дезоксихолевая, урсодезоксихолевая) ЖК с увеличением количества гидрофобных ЖК [3, 10].

По данным литературы [3, 10], основными факторами, повреждающими гепатоциты, являются гидрофобные ЖК (литохолевая, дезоксихолевая), которые повреждают липидный бислой клеточных мембран гепатоцитов и запускают механизм оксидативного стресса, в результате чего происходит повреждение рецепторов, белковых переносчиков, а также встроенных в мембрану ферментов. Вследствие выхода кальция и натрия в клетку происходит набухание и повреждение клеточных митохондрий, выход цитохрома С в клетку и ее гибель по механизмам некроза и апоптоза.

Гидрофильные ЖК (урсодезоксихолевая, хенодезоксихолевая) оказывают цитопротективное действие, уменьшая пул гидрофобных ЖК, участвующих в энтерогепатической циркуляции, и таким образом снижая степень токсического повреждения гепатоцитов гидрофобными ЖК.

При холестазе повышается уровень свободных радикалов не только в системе желчевыделения, но и в других органах и системах, анатомически и функционально связанных между собой. Так, уровень супероксидного радикала (O2-) на 10-й день после перевязки экспериментальным животным общего желчного протока возрастал в печени на 96%, в кишечнике на 110%, в почках на 118% и в головном мозге на 142% [9].

Летальность пациентов с обструктивной механической желтухой обусловлена развитием не только печеночной, но и почечной недостаточности, геморрагическими и тромбоэмболическими осложнениями [1], возможным пусковым механизмом которых является оксидативный стресс.

Инфузионный гепатопротектор ремаксол (ООО «НТФФ «ПОЛИСАН») - сбалансированный полиионный инфузионный раствор, оказывающий гепатопротекторное действие. Препарат содержит активные компоненты - янтарную кислоту, рибоксин, никотинамид, метионин, а также электролиты - натрия хлорид, магния хлорид, калия хлорид и сольстабилизирующий агент N-метилглюкамин. Показанием к назначению ремаксола являются нарушения функции печени вследствие острого или хронического ее повреждения (токсические, алкогольные, лекарственные гепатиты) [5-7].

Цель данного исследования - изучение состояния процессов свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты на модели экспериментальной обтурационной механической желтухи у крыс, а также влияния инфузионного гепатопротектора ремаксола на эти показатели.

Материал и методы

Исследование выполняли на 28 крысах-самцах линии Вистар (возраст 18 нед, масса 270-300 г), полученных из питомника «Рапполово» РАМН (Санкт-Петербург). Все эксперименты проводили под анестезией (тиопентал натрия 50 мг/кг внутрибрюшинно).

Экспериментальный холестаз моделировали путем перевязки общего желчного протока [8]. Крысам под общей анестезией производили срединную лапаротомию, органы брюшной полости сдвигали и выделяли общий желчный проток. Последний перевязывали лигатурой 4-0, после чего органы брюшной полости крысы аккуратно возвращали в прежнее положение и послойно ушивали операционную рану. Ложнооперированным животным производили срединную лапаротомию без перевязки общего желчного протока.

Животные (n=28) были разделены на три группы: ложнооперированные (n=7), группа животных, которым перевязывали общий желчный проток и вводили физиологический раствор (n=11), группа животных, которым перевязывали общий желчный проток и вводили ремаксол (n=10). Препараты исследования вводили ежедневно в течение 10 дней в хвостовую вену крыс в объеме 1мл на 100 г. На 10-й день после моделирования холестаза животных выводили из опыта, печень и кровь забирали для дальнейшего исследования.

Стабилизированную кровь лабораторных животных для выделения эритроцитов центрифугировали в течение 10 мин в центрифуге К-24 D (Германия) при 3000 об/мин (3000 g) и температуре 2°C. Полученную эритроцитную массу замораживали, погружая в жидкий азот, после чего хранили в холодильной камере при –60оС.

Печень отмывали холодным физиологическим раствором от крови в течение 35-50 с, замораживали в жидком азоте и до начала исследований хранили в холодильной камере при –60оС.

Концентрацию восстановленного глутатиона, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы, каталазы, малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в тканях печени и эритроцитах определяли спектрофотометрическим методом.

Концентрацию восстановленного глутатиона определяли по методике G. Ellman (1959) (А.И. Карпищенко (ред.), 2002) и выражали в мкмоль на 1 г ткани (для гомогенатов ткани) или в мкмоль на 1 г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Определение концентрации диеновых конъюгатов осуществляли по методике И.Д. Стальной (1977) (А.И. Карпищенко (ред.), 2002) и выражали ее в нмоль на 1 г ткани (для гомогенатов ткани) или в нмоль на 1 г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Концентрацию малонового диальдегида определяли по методу M. Uchiyama (1978) (А.И. Карпищенко А.И.(ред.), 2002) и выражали в нмоль на 1 г ткани (для гомогенатов ткани) и нмоль на 1 г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Определение активности глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9) проводили по методу А.Н. Гавриловой (1986) и выражали в мкмоль/мин на 1 г белка (для гомогенатов ткани) или в мкмоль/мин на 1 г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Определение активности глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2) осуществляли методом I. Carlberg и B. Mannervik (1985) и выражали в мкмоль/мин на 1 г белка (для гомогенатов ткани) или в мкмоль/мин на 1 г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - ГЛ-6-ФДГ (КФ 1.1.1.49.) определяли по методу A. Kornberg и соавт. (1955) и выражали в мкмоль/мин на 1 г белка (для гомогенатов ткани) или мкмоль/мин на 1 г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Активность глутатион-S-трансферазы определяли по методу W. Habig и W. Jakoby (1981) и выражали в мкмоль/мин на 1 г белка (для гомогенатов ткани) или мкмоль/мин на 1 г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Для определения активности каталазы (КФ 1.11.1.6.) использовали метод М.А. Королюка и соавт. (1988). Результат выражали в мкмоль/мин на 1 г белка) (для гомогенатов ткани) или мкмоль/мин на 1 г гемоглобина (для гемолизата эритроцитов).

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью пакета прикладных программ Microsoft Exel 2007 и StatSoft Statistica 6.0. В работе приведены средние значения и их стандартные отклонения, а также медианы и процентили. В статистическом анализе использовали непараметрический метод сравнения Манна-Уитни. Значения считали достоверными при заданном критерии вероятности p≤0,01 и p≤0,05.

Результаты и обсуждение

В течение первых нескольких дней после перевязки общего желчного протока у всех экспериментальных животных появлялась и в последующие 10 дней нарастала желтушность слизистых, стул становился ахоличным, моча темнела. Во всех группах животных летальных исходов не было.

О развитии у экспериментальных животных оксидативного стресса можно судить по изменению показателей глутатионового звена антиоксидантной защиты и уровня первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ).

В группе с холестазом и введением физиологического раствора отмечали усиление свободнорадикальных процессов и снижение антиоксидантной активности в тканях печени, что выражалось в снижении в 2 раза уровня восстановленного глутатиона по сравнению с таковым в группе ложнооперированных животных, угнетении активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов - глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, достоверном повышении уровня первичных и вторичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов и малонового диальдегида (р=0,0005) (табл. 1).

В группе животных с холестазом и введением ремаксола отмечалось достоверное повышение показателей глутатионового звена антиоксидантной защиты, расщепляющих перекись водорода и органические перекиси, в том числе гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот по сравнению с таковыми в группе животных, получавших физиологический раствор. Кроме того, достоверно повышался уровень глутатионпероксидазы (р=0,0002) и глутатионредуктазы (р=0,0002), как и уровень ГЛ-6-ФДГ, способствующей образованию восстановленного НАДФ в реакциях пентозофосфатного пути окисления глюкозы, необходимого для глутатионредуктазной реакции (р=0,0001).

Также достоверно по сравнению в группой физиологического раствора был повышен уровень каталазы (р=0,001), являющейся основным ферментом, расщепляющим перекись водорода, и синергистом глутатионпероксидазы.

Глутатион-S-трансфераза, участвующая в инактивации эндогенных метаболитов, осуществляет одну из реакций печеночного метаболизма 2-й фазы - конъюгацию глутатиона с токсичными продуктами ПОЛ, которые образуются при повреждении гепатоцитов гидрофобными ЖК [2, 4, 10]. В группе с введением ремаксола ее содержание также достоверно повышалось по сравнению с группой физиологического раствора (р=0,0035).

На фоне введение ремаксола достоверно по сравнению с группой физиологического раствора снижался уровень показателей промежуточных и конечных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида (р=0,0001) и диеновых конъюгатов (р=0,0006).

В табл. 2

приведены результаты измерения тех же показателей в эритроцитах экспериментальных животных. В группе с холестазом и введением физиологического раствора в эритроцитах животных, как и в тканях печени, отмечалось усиление свободнорадикальных процессов и уменьшение антиоксидантной активности, что выражалось в снижении уровня восстановленного глутатиона по сравнению с группой ложнооперированных животных в 1,7 раза (р=0,003) и угнетении активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов - глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, достоверном повышении уровня первичных и вторичных продуктов ПОЛ -диеновых конъюгатов (0,0009) и малонового диальдегида (р=0,0067).

Отмечалась некоторая разница в динамике показателей глутатионового звена антиоксидантной защиты в группе животных с введением ремаксола и физиологического раствора в тканях печени и эритроцитах.

Так, в группе с ремаксолом в эритроцитах, как и в тканях печени, регистрировалась достоверная разница показателей глутатионредуктазной реакции по сравнению с группой физиологического раствора, повышался уровень глутатионредуктазы (р=0,0019) и ГЛ-6-ФДГ, способствующей образованию восстановленного НАДФ в реакциях пентозофосфатного пути окисления глюкозы, необходимого для глутатионредуктазной реакции (р=0,0001).

В эритроцитах не было динамики значений фермента глутатионпероксидазы по сравнению с таковой в группе физиологического раствора (р=0,158). Поскольку на этом фоне достоверно повышался уровень каталазы (р=0,0001), и максимальная ее активность отмечалась именно в эритроцитах [2, 4], можно предположить, что в эритроцитах антиоксидантная защита осуществляется именно этим ферментом.

Активность и стабильность ключевых ферментов антиоксидантной защиты являются взаимосвязанными и действуют однонаправлено. Только согласованное действие этих ферментов - глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и каталазы необходимо для защиты от инактивирующего воздействия оксидативного стресса.

Поскольку однонаправленная антиоксидантная активность ремаксола отмечалась как в тканях печени, так и в эритроцитах, этот инфузионный гепатопротектор можно рассматривать и как инфузионный субстратный антигипоксант. Антиоксидантное действие ремаксола, возможно, связано с входящей в его состав янтарной кислотой, которая стимулирует дыхание и энергообразование в клетках, улучшает процессы утилизации кислорода тканями и восстанавливает активность ферментов антиоксидантной защиты [6, 7].

Таким образом, при остром экспериментальном холестазе отмечается усиление свободнорадикальных процессов и снижение антиоксидантной активности в тканях печени и эритроцитах, что выражается в снижении уровня восстановленного глутатиона, угнетении активности глутатионзависимых антиоксидантных ферментов - глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, и глутатион-S-трансферазы, повышении уровня первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов - диеновых коньюгатов и малонового диальдегида.

Инфузионный гепатопротектор ремаксол оказывает антиоксидантное действие, поскольку после его 10-дневного введения происходили следующие изменения:

- повышался уровень ферментов, участвующих в восстановлении окисленной формы глутатиона, - глутатионредуктазы и ключевого фермента пентозофосфатного цикла глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, способствующей образованию восстановленного НАДФ в реакциях пентозофосфатного пути окисления глюкозы;

- достоверно повышался уровень глутатионзависимых антиоксидантных ферментов - глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы, как и каталазы - основного фермента, расщепляющего перекись водорода и являющегося синергистом глутатионпероксидазы;

- снижался уровень продуктов перекисного окисления липидов - малонового диальдегида и диеновых конъюгатов по сравнению с таковым в группе животных, получавших физиологический раствор.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail