Одним из первых криохирургическое воздействие при опухолях головного мозга применил нейрохирург из Филадельфии - Temple Fay в 1939 г., имплантировав металлические капсулы, соединенные с внешней охлаждающей системой ирригации, в мозг, для лечения глиобластом и абсцессов. Результат показал уменьшение размера опухоли. Работа T. Fay была прервана второй мировой войной и опубликована только в 1959 г. [7].

В 1959 r. G. Rowbotham применил криохирургический метод при удалении глиальных опухолей. Хотя лечение глиом не принесло эффекта, отсутствие осложнений локального замораживания ткани головного мозга дало уверенность в безопасности данной процедуры [9].

В 1961 г. нейрохирург I. Cooper и соавт. создали специальный криохирургический аппарат с криозондом, в основе которого лежала циркуляция жидкого азота, поступающего по цилиндрической канюле на конец рабочего криозонда-манипулятора и охлаждающего его до –190 - –196 °С. Установка использовалась для разрушения опухолей мозга, а также подкорковых ядер при заболеваниях стриопаллидарной системы [6].

В СССР основоположником применения ультранизких температур в хирургии был Э.И. Кандель, поэтому криохирургический метод активно апробировался в нейрохирургии [1]. Совместно с академиком А.И. Шальниковым была создана целая серия криохирургических устройств и аппаратов для практического применения. Основная часть прибора - тонкая металлическая трубка (канюля) с резервуаром, в который заливают жидкий азот. Пользуясь стереотаксическим методом, канюлю вводили в заданную структуру мозга. Другая модель этого прибора, разработанная в 1970 г., позволяла замораживать значительные объемы опухолевой ткани (до 50-55 мм в диаметре) [2, 3].

Разработанный в Институте физических проблем АН СССР акад. А.И. Шальниковым совместно с Э.И. Канделем нейрохирургический криохирургический аппарат (КХА) имел ряд недостатков и в настоящее время сообщения о его применении единичны.

В настоящее время во всем мире отмечается возрождение интереса к криохирургии. Потенциальные возможности этого метода еще недостаточно оценены и изучены [4, 5, 8].

Наше исследование направлено на изучение влияния ультранизких температур на головной мозг животных в эксперименте с использованием интраоперационной ультразвуковой диагностики, методов интраоперационного инвазивного термоконтроля зоны криовоздействия, послеоперационного магнитно-резонансного томографического исследования и морфологии головного мозга млекопитающих, подвергнутого криодеструкции.

В отделении экспериментальных исследований в хирургии РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского РАМН в 2008 и 2009 гг. было проведено 26 экспериментов, в которых использованы 13 свиней и 13 кроликов. Проведение клинических и экспериментальных исследований одобрено Межвузовским комитетом по этике при ассоциации медицинских и фармацевтических вузов и локальным этическим комитетом РНЦХ РАМН им. акад. Б.В. Петровского.

Объектом исследований были: кролики породы «Советская шиншилла» с массой 3,85±0,7 кг, и 4-месячные свиньи помесь «Ландрас» и «Дюрок» с массой 41±3 кг.

Нами проведено два вида экспериментов: 12 острых и 14 хронических. В остром эксперименте сразу после криодеструкции участка головного мозга производили эвтаназию подопытного животного, мозг извлекали и отправляли на морфологическое исследование единым макропрепаратом. В хроническом эксперименте после криовоздействия животное оставляли жить с периодом наблюдения от 1 до 30 сут.

На кроликах было выполнено 8 острых, 5 хронических экспериментов, на свиньях было проведено 4 острых и 9 хронических экспериментов по изучению локального влияния ультранизких температур на ткани головного мозга.

Таким образом, исследовали этапность морфологических изменений в зоне криодеструкции, наступающих на разных сроках эксперимента.

В 2008 г. совместно с Объединенным институтом ядерных исследований (ОИЯИ) (г. Дубна) был разработан экспериментальный криохирургический аппарат. Принцип работы данного криохирургического аппарата основан на пассивной подаче жидкого азота и активной вакуумной аспирации образующегося парообразного азота, что повышает холодопроизводительность аппарата, которая оценена в 10 Ватт. При испытаниях КХА, проведенных в ОИЯИ, наконечником была достигнута минимальная температура - 203 °С. Путем прокачки горячего сухого азота по внутренним каналам криозонда осуществляли отогрев наконечника.

Оценивали результаты экспериментов на основании инвазивного контроля температуры в зоне криодеструкции, интраоперационной ультрасонографии (ИС), магнитно-резонансного исследования (МРТ) головного мозга животных, изучения макропрепарата извлеченного мозга, патоморфологического исследования головного мозга животных.

Под терминами «ледяной шар», «Ice-ball», зона промораживания, зона криодеструкции мы понимаем зону мозга, подвергнутую криовоздействию.

При помощи медь-константановой термопары, вмонтированной в сферическую головку на кончик иглы 22G*3,5’’, и двухканального измеритель-регулятора микропроцессорного (TPM200) осуществляли инвазивный контроль изменения температуры в зоне ice-ball и в прилегающей зоне мозга. Точность измерений температуры зоны замораживания достигала ±0,5°. Количество применяемых во время экспериментов игольчатых термопар составляло от 1 до 4.

Одновременно с криозондом и параллельно ему термопара погружалась в мозг. Инвазивный контроль температуры производился в том же полушарии, где и криодеструкция, в зоне от 0 до 11 мм относительно криозонда. Диапазон температур в измеряемой зоне мозга составлял от –5,3 до –197 °С.

Во всех экспериментах отмечали температуру окружающей среды и общую температуру тела животного.

Для проведения интраоперационной ультрасонографии нами был использован ультразвуковой аппарат Logiq Book GE (США) с линейным датчиком 7,5 МГц. Пожизненное магнитно-резонансное исследование головного мозга животных проводили на MP томографе Hitachi APERTO 0,4Т в режимах T1-BИ, Т2-ВИ и Flair, на 1, 2, 3, 7, 14, 21-е и 28-е сутки после выполненного криовоздействия. Оценивали размер и объем зоны криовоздействия, наличие и размер зоны отека. МРТ-исследование было выполнено 10 животным. Материалом для морфологического исследования являлся головной мозг экспериментальных животных. После фиксации в 10% буферном растворе формалина мозг нарезали на коронарные срезы и размеры криоповреждения (наибольший диаметр) измеряли макроскопически, с помощью линейки. Участки криоповреждения вместе с окружающей тканью и неповрежденные участки головного мозга по стандартной методике заливали в парафин, срезы толщиной 5 мкм депарафинировали и окрашивали гематоксилином и эозином для гистологического исследования. При световой микроскопии исследовали состояние оболочек и вещества головного мозга, сосудистой стенки, как в зоне, подвергнутой низкотемпературному воздействию, так и в визуально интактных участках.

С соблюдением правил асептики и антисептики животным после удаления волосяного покрова на голове выполняли линейный или арбалетный разрез кожи и резекционную трепанацию черепа в лобно-теменной областях с двух сторон. Твердую мозговую оболочку вскрывали дугообразно, основанием к верхнему сагиттальному синусу. Стерильной рабочей частью криоинструмента выполняли криодеструкцию. После энцефалотомии наконечник криоинструмента погружали в мозг на глубину от 6 до 20 мм под углом от 45 до 90° к поверхности мозга. После позиционирования и установки наконечника криоинструмента и его фиксации к операционному столу КХА включали на замораживание (рис. 1).

После окончания каждого опыта заполняли протокол эксперимента с описанием характеристик и объекта исследования, техники и результатов операции.

В рамках нашего исследования изучали следующие параметры:

- зависимость скорости снижения температуры от глубины погружения криозонда;

- зависимость изменения температуры в ледяном шаре от расстояния до криозонда;

- исследовали параметры размораживания и оттаивания ледяного шара;

- изучали эхопризнаки формирования ледяного шара;

- изучали MP-признаки зоны локальной криодеструкции головного мозга млекопитающих;

- изучали патоморфологические изменения в зоне криодеструкции после проведения «острого» и «хронического» экспериментов.

Во время эксперимента общая температура тела подопытных кроликов была 38,9±0,6 °С, свиней - 39,5±0,3 °С (нормальные показатели для здоровых животных данного возраста).

На рис. 2

Учитывая, что холодопроизводительность (мощность) КХЛ во время проведения эксперимента мы не меняли, то снижение температуры мозга в зоне криодеструкции зависело от расстояния до криозонда и времени криовоздействия.

Нами отмечен нелинейный характер снижения температуры в зоне криовоздействия. Общей закономерностью в период замораживания на всех измеряемых расстояниях была высокая скорость охлаждения тканей до момента замерзания (–2,9±0,3 °С) и выраженное снижение скорости дальнейшего охлаждения в образовавшемся ice-ball, при этом чем дальше от криозонда, тем менее выражена данная закономерность (рис. 3).

Скорость снижения температуры до 0 °С на расстоянии 3 мм от криозонда составляла 1,0 °/с, на расстоянии 5 мм была 0,5-0,6 °/с, а на расстоянии 9 мм и далее скорость снизилась до 0,16 °/с.

Температура мозга в зоне криодеструкции на расстоянии от 0 до 11 мм относительно криозонда составляла от –197 °С до –5,3 °С, что приводило к некрозу мозговой ткани (рис. 4).

Мы исследовали зависимость скорости понижения температуры в формирующемся ледяном шаре от глубины погружения криозонда. В проводимом эксперименте мы не получили зависимости скорости снижения температуры в промораживаемой ткани мозга от глубины погружения криозонда.

Измеряя температуру при помощи 4 термопар, погруженных на разных расстояниях от криозонда (3, 7, 9 и 11 мм), мы отметили достоверную зависимость изменения температуры в ледяном шаре от pacстояния до криозонда (p<0,04). Чем ближе к криозонду располагалась зона промораживания, тем ниже была в ней температура. Как и ожидалось, наиболее высокая температура была на границе ледяного шара и нормальной ткани мозга (–2,9±0,3 °С) (рис. 5).

Оттаивание ice-ball происходило пассивно за счет двух источников подвода тепла: основного - внутренняя температура животного и второстепенного - температура окружающей среды. Скорость размораживания во всех экспериментах была равномерно низкой (0,085±0,015 °/с) и она не зависела от значения температуры, с которой начинался период размораживания. На периферии ледяного шара мы отметили более высокую скорость размораживания, что связано с интенсивным теплообменом на границе ледяного шара с незамороженной зоной мозга.

Для безопасного извлечения криозонда из ледяного шара после окончания цикла замораживания производили активный отогрев рабочего наконечника при помощи прокачки горячего сухого азота. На рис. 5 показано, что через 7 мин от начала размораживания температура на расстоянии 3 мм от криозонда достигала +5 °С, что позволяло безопасно извлекать криозонд без риска смещения ледяного шара.

С использованием интраоперационной ультрасонографии (ИС) производили контроль за введением криозонда и формированием ледяного шара. В экспериментах на головном могзе крупных млекопитающих (свиньи) нами проведена оценка результатов использования ИС во время формирования ледяного шара с определением его эхогенности, выявлении его границ и контуров, ИС контроля глубины погружения криозонда и степени размораживания ледяного шара.

Ультрасонографическая картина нормального мозга свиньи соответствовала картине головного мозга человека. Центральная часть извилин, представленная белым веществом, более эхогенна, чем периферия, состоящая из серого вещества.

При ИС ледяной шар представлял гипоэхогенную структуру, с гиперэхогенным контуром по фронту замораживания. Края формирующегося ледяного шара при исследовании были четкими и ровными.

При ультрасонографии криозонд выглядел гиперэхогенным. В начале замораживания вокруг криозонда появлялись гиперэхогенные включения, что соответствует изменениям в веществе головного мозга при снижении температуры. Сформировавшийся ice-ball выглядел как зона гипоэхогенной ткани, прилежащей к криозонду. По периферии этой зоны определялась ткань повышенной эхогенности (гиперэхогенная), толщиной 2-3 мм (гиперэхогенный контур). За ice-ball шла акустическая тень. Ультрасонографическая картина позволяет четко визуализировать увеличение размеров формирующегося ледяного шара по мере роста гипоэхогенной зоны (рис. 6).

Нами отмечено соответствие между ультрасонографическими признаками формирования границ ледяного шара и данными инвазивного измерения температуры по периферии зоны промораживания.

Использование ИС позволяет:

1) контролировать направление и глубину погружения криозонда;

2) следить за размером формирующегося ледяного шара;

3) контролировать процесс размораживания ледяного шара и извлечения криозонда.

При проведении МРТ в послеоперационном периоде мы определяли в зоне криовоздействия участок гиперинтенсивного МР-сигнала на Т2-ВИ и Fkair и слабогипоинвазивного сигнала на Т1-ВИ с достаточно четкими и ровными контурами овальной формы, что можно интерпретировать как МР-признаки локального отека-ишемии в зоне криовоздействия. Участков кровоизлияния выявлено не было (рис. 7).

В левой лобной области хорошо визуализируется очаг ишемии с внутримозговой кистой, окруженный зоной умеренного отека.

Нами отмечено, что границы замороженной зоны, определяемые при ИС, практически совпадали с размерами зоны криодеструкции, полученными по результатам послеоперационных МРТ-исследований.

После острых экспериментов при проведении морфологического исследования препаратов были отмечены очаги деструкции вещества головного мозга с кровоизлияниями по ходу мелких сосудов. По периферии зоны некроза была широкая зона выраженных дистрофических изменений нейронов без четких границ между ними. В кровеносных сосудах всех калибров наблюдались полнокровие и явления стаза. В зоне сохранной мозговой ткани отмечались периваскулярный и перицеллюлярный отек, сосуды были расширены, полнокровны, с явлениями стаза.

При проведении морфологического исследования препаратов хронических экспериментов картина меняется: с первых суток отчетливо начинают выделяться четыре зоны (рис. 8):

1) полных некротических изменений (26 мм);

2) выраженного отека (2 мм);

3) умеренного отека (4 мм);

4) незначительных дистрофических изменений (4 мм).

В зоне тотальных некротических изменений наблюдался полный некроз мозговой ткани, среди которого сохранялись некоторые сосуды и элементы глии в состоянии выраженной дистрофии и очаговыми кровоизлияниями. При более длительной экспозиции криовоздействия некротические изменения были более выражены, а зона отека была более обширна. Между зоной некроза и зоной выраженного отека, начиная с 1-х суток, формировался демаркационный лейкоцитарный вал, который усиливался к 3-м суткам и постепенно уменьшался к 2 нед (рис. 9).

В области сосудов лейкоцитарный вал был более выражен. Зона выраженного отека характеризовалась дистрофическими изменениями большинства нейронов и некрозом отдельных клеток. Для зоны слабовыраженного отека были характерны дистрофические изменения нейронов, а некротические изменения встречались крайне редко. В зоне незначительных дистрофических изменений был отмечен слабый периваскулярный и перицеллюлярный отек, и данная зона без четкой границы переходила в интактный мозг.

Надо отметить, что размеры некротических изменений в зоне замораживания соответствовали размерам по результатам ИС и МРТ-исследований. Это свидетельствует о высокой эффективности криодеструкции как метода достижения тотального холодового некроза ткани мозга в заданном объеме.

На основании полученных нами данных интраоперационного инвазивного контроля температуры в период криовоздействия, наглядно видно, что для эффективной криодеструкции основными параметрами являются скорость замораживания и оттаивания, а также температура в ice-ball. Данные характеристики напрямую зависят от выбранного холодового агента и мощности (холодопроизводительности) прибора. Абсолютные цифры температуры наконечника криоинструмента без учета мощности КХА не являются критерием гарантированного достижения тотального некроза ткани головного мозга.

Ультрасонография - простая и надежная методика, позволяющая уверенно позиционировать криозонд в веществе головного мозга, контролировать процесс формирования и размер ледяного шара, четко визуализировать гиперэхогенный контур, который является границей перехода фаз - жидкости в твердое состояние и обратно.

Анализ полученных нами результатов прижизненной МРТ головного мозга экспериментальных животных, подвергнутых локальной криодеструкции головного мозга, позволяет сделать вывод о высокой эффективности криодеструкции и низкой травматичности данного вида воздействия для окружающих интактных тканей мозга.

Морфологическое исследование подвергнутых криовоздействию фрагментов ткани мозга подтвердило, что используемая нами технология процесса замораживания-оттаивания дает возможность получить надежную деструкцию всех клеточных элементов ткани мозга в запланированном объеме.

Нами отмечено соответствие между данными инвазивного измерения температуры в формирующемся ice-ball, интраоперационной ультрасонографией, результатами МРТ головного мозга и морфологического исследования.

Таким образом, приведенные экспериментальные данные могут служить обоснованием для применения локальной криодеструкции, как эффективного и малоинвазивного метода достижения холодового некроза в заданном объеме ткани, что позволяет рекомендовать этот метод для применения в нейроонкологии и функциональной нейрохирургии.