Введение

После первой успешной трансплантации мононуклеарных клеток пуповинной крови человека (МКПКЧ), выполненной Э. Глюкман в 1988 г. ребенку с анемией Фалькони [1], интерес к этим клеткам проявился не только как к источнику гемопоэтических стволовых клеток для лечения больных с онкогематологическими или генетическими нарушениями в системе крови, но и как к возможному средству клеточной терапии для лечения заболеваний сердечно-сосудистой, нервной и опорно-двигательной систем, возможного использования для лечения и соматических, и психоневрологических заболеваний. Этому способствовали несколько факторов: клетки легкодоступны, просто собирать (собирают после родов: около 135 млн родов в год в мире каждый год), возможность использования без дополнительного культивирования, т.к. любой образец содержит достаточное количество клеток для инъекции (в среднем 1,5×10⁹ мононуклеарных клеток), нет этических проблем в получении, минимальный риск заражения, низкая иммуногенность, позволяющая использовать аллогенные клетки (в эксперименте и ксеногенные), способность мигрировать в зону повреждения, долго хранятся в жидком азоте. Возможность долгого хранения позволила создать сеть криобанков для хранения образцов МКПКЧ из различных стран и подбирать наиболее совместимые по HLA-типам образцы, обладающие минимальной иммуногенностью (в мире зарегистрировано более 500 банков пуповинной крови [2]). Способность мигрировать в зону повреждения дала возможность использовать простой способ введения их в организм пациента — внутривенное введение.

Секреция МКПКЧ репаративных пептидов, мРНК, микроРНК, цитокинов, гормонов, факторов роста и др. биологически активных молекул позволяет паракринно реализовать лечебное действие за счет восстановления и репарации нарушенных тканей, в которых повышается жизнеспособность клеток, возрастает их пролиферативная активность и снижается апоптоз [3—8].

Пуповинная кровь человека с клинической точки зрения вначале рассматривалась как источник клеток для клеточной терапии соматических заболеваний, потом психосоматических (детский церебральный паралич, болезнь Паркинсона,) и даже психических (аутизм, шизофрения), в которых практически нет соматического компонента [9—15]. Отсюда возникает вопрос о том, на что может влиять клеточная терапия (вводимые клетки) в отсутствие соматического компонента заболевания или же при введении в здоровый организм, в частности, оказывать влияние на сердечно-сосудистую систему (ССС), когда нет необходимости восстановления и репарации нарушенных тканей, но есть повышенная нагрузка на систему в целом.

При этом лечебное действие МКПКЧ реализуется через их паракринное действие и достигается курсовым внутривенным введением в организм больного больших доз клеток.

Цель работы — изучить влияние внутривенного введения МКПКЧ на функциональное состояние сердечно-сосудистой системы здоровых крыс в субхроническом эксперименте.

Материал и методы

В работе использованы половозрелые крысы линии Wistar — самцы и самки с массой тела 180—200 г (питомник: филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ — ПЛЖ «Рапполово»). Все протоколы экспериментов были утверждены на основании этических и научных рекомендаций Министерства здравоохранения Российской Федерации (утверждение №267 от 19.03.2006 г.) и Национального стандарта Российской Федерации ГОСТ Р 53434—2009 в соответствии с правилами содержания и ухода за экспериментальными животными, что согласуется с директивами Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований.

Экспериментальные группы включали по 10 животных, которые содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище. Длительность эксперимента — 60 дней, на протяжении которых через каждые 10—11 дней животным вводили МКПКЧ. Животные были поделены на следующие группы: самцы — контрольная группа, группа клеточной терапии 400 миллионов клеток/кг (млн кл/кг) массы тела, группа клеточной терапии 800 млн клеток/кг массы тела; самки — контрольная группа, группа клеточной терапии 400 млн кл/кг массы тела, группа клеточной терапии 800 млн кл/кг массы тела. Количество вводимых МКПКЧ рассчитывалось исходя из принятой терапевтической дозировки для человека (600 млн клеток на 70 кг массы тела) и составляло соответственно: 50- и 100-кратную дозу в пересчете на массу тела животного. Клетки вводили внутривенно в хвостовую вену в объеме 0,5 мл физиологического раствора. Введение проводили через каждые 10—11 дней в течение 60 дней. Последнее введение клеток производилось за 14 дней до начала тестирования. На протяжении всего эксперимента животные содержались в стандартных условиях вивария в клетках со свободным доступом к воде и пище.

Образец концентрата замороженных МКПКЧ непосредственно перед введением размораживали на водяной бане при температуре +37 °C и ex tempore отмывали от криопротектора охлажденным до +4 °C раствором следующего состава: 6 мл альбумина + 19 мл физиологического раствора +25 мл реополиглюкина («Уман альбумин» 25% раствор для инфузий, альбумин человека, Kedrion S.p.A., Италия); натрия хлорид 0,9% (ООО «Гематек», Тверь, Россия), «Реополиглюкин» (декстран, ср. мол. масса 30 000—40 000), раствор для инфузий (РУП «Белмедпрепараты», Белгород, Россия). В стерильных условиях клеточный материал переносили в пробирку на 50 мл и доводили охлажденной ТС до верхней метки: первые 10 мл при тщательном перемешивании, остальное — струйно. Суспензию клеток перемешивали и центрифугировали при +4 °C и 600 g в течение 10 мин. Отмывку клеток от криосреды проводили дважды. Осажденную клеточную массу разводили в необходимом объеме транспортной среды и хранили при температуре тающего льда в течение всего периода введения (не более 2 часов).

Клеточный состав МКПКЧ определяли на гематологическом автоматическом анализаторе Abacus 5 Vet (Diatron, Венгрия).

Количество живых клеток в образце определяли окраской трипановым синим.

По окончании эксперимента животных подвергали эвтаназии (СО₂-бокс).

Для оценки состояния сердечно-сосудистой системы проводили мониторинг частоты дыхательных движений (ЧДД), артериального давления (АД), частоты сердечных сокращений (ЧСС), допплерографию сосудов нижних конечностей.

ЧДД измеряли в покое с помощью системы плетизмографии для всего тела у крыс (Tow-Int Tech Co., Ltd, Шанхай, Китай). Для этого животное помещали в камеру и по достижении стабильных показателей осуществляли запись параметров в течение 1 мин.

Для мониторинга ЧСС и АД использовали систему неинвазивного измерения систолического и диастолического давления — «Систола» (ООО «Нейроботикс», Москва, Зеленоград, Россия). Для этого животных предварительно помещали в рестрейнеры для крыс на время 20 мин для привыкания к стрессовой обстановке. Перед измерением животных с рестрейнером ставили на термостатируемую платформу «Флогистон» (ООО «Нейроботикс», Москва, Зеленоград, Россия) с температурой 25 °C; показатели ЧСС и АД снимали у основания хвоста.

При измерении ЧСС под нагрузкой использовали тест «вынужденное плавание». Плавание проводили в сосудах из оргстекла (внутренний диаметр 30 см, высота 75 см, высота столба воды 50 см (температура воды в бассейне 37 °C), в которой животные находились по 120 с, после чего ex tempore осуществляли мониторинг.

Допплерографию сосудов задних конечностей крыс осуществляли с помощью установки «Минимакс-Допплер-К» в комплектации ММ-Д-К (ООО «Минимакс», Санкт-Петербург, Россия) Для этого животных подвергали эфирному наркозу и в области между вторым и третьим пальцами левой стопы, используя датчик на 20 МГц, измеряли объемную и линейную скорости кровотока.

Статистический анализ проводили в программном пакете Excel и с помощью онлайн-калькулятора (https://www.statskingdom.com/170median_mann_whitney.html). Рассчитывали: медиану (Me), верхний и нижний квартили (Q₂₅—Q₇₅); сравнение гипотез проводили по U-критерию Манна—Уитни. Статистически значимыми считали результаты при p<0,05.

Результаты

В течение всего эксперимента каких-либо значимых отклонений в поведении, потреблении корма или воды у животных контрольных и опытных групп не наблюдалось. Внешнее состояние: слизистые, кожные и шерстные покровы крыс оставались без видимых изменений. Клеточных состав МКПКЧ в используемых в работе образцах пуповинной крови после размораживания и отмывки: нейтрофилы — 49,7±3,8%, лимфоциты — 39,4±1,6%, моноциты 7,40±0,06%, эозинофилы — 2,50±0,02%, базофилы — 1,00±0,01%.

Перед введением количество живых клеток в образце составляло 93—95% (окраска трипановым синим).

Описательные статистические показатели, отражающие состояние дыхательной и ССС у животных в покое, представлены на рис. 1.

Рис. 1. Показатели работы сердечно-сосудистой системы в состоянии покоя у лабораторных животных, абсолютные значения. Статистический анализ (бокс-плот, медиана, Me (Q₂₅—Q₇₅).

а — частота сердечных сокращений в состоянии покоя; б — систолическое артериальное давление в состоянии покоя; в — диастолическое артериальное давление в состоянии покоя; г — частота сердечных сокращений в состоянии покоя. ЧСС — частота сердечных сокращений (Уд./мин), САД — систолическое артериальное давлений (мм рт.ст.), ДАД — диастолическое артериальное давлений (мм рт.ст.), ЧДД — частота дыхательных движений (Дв./мин).

Частота дыхания и сердечных сокращений, а также показатели АД контрольных животных (см. рис. 1) полностью соответствуют нормальным значениям для белых крыс [16]. При этом статистически значимых различий в регистрируемых параметрах между животными опытных и контрольных групп не выявлено. Модуляция исследуемых показателей в экспериментальных группах (при сравнении с контрольными животными) находится в пределах границ нормы.

Описательные статистические показатели, отражающие состояние дыхательной и ССС у животных после физической нагрузки (тест «Вынужденное плавание»), представлены на рис. 2.

Рис. 2. Показатели работы сердечно-сосудистой системы после вынужденного плавания покоя у лабораторных животных, абсолютные значения. Статистический анализ (бокс-плот, медиана, Me (Q₂₅—Q₇₅).

а — частота сердечных сокращений в условиях физической нагрузки; б — частота дыхательных движений в условиях физической нагрузки; ЧСС — частота сердечных сокращений (Уд./мин), ЧДД — частота дыхательных движений (Дв./мин); ** — p<0,01.

Из результатов, представленных на рис. 2, видно, что у самцов на фоне максимальной дозировки клеточного материала статистически значимо на 8,0% снижаются ЧСС и ЧДД после интенсивной двухминутной физической нагрузки (p≤0,006 и p≤0,007 соответственно). У самцов на минимальной дозировке и самок двух опытных групп выявлена схожая тенденция.

Описательные статистические показатели допплерографических исследований сосудов стопы задних конечностей представлены на рис. 3.

Рис. 3. Результаты допплерографических исследований задних конечностей крыс. Статистический анализ (бокс-плот, медиана, Me (Q₂₅—Q₇₅).

а — средняя скорость в систоле; б — средняя скорость по сечению сосуда; в — индекс Гослинга; г — индекс Пурсело. Vas — средняя скорость в систоле (см/с), Vam — средняя скорость по сечению сосуда(см/с), PI — индекс Гослинга (у.е.), RI — индекс Пурсело (у.е.); *p≤0,05, ** p≤0,01.

Из результатов, приведенных на рис. 3, следует, что у самцов из группы «800 млн» статистически значимо возросли линейная и объемная скорости кровотока (на 60,0 и 50,6% соответственно, p≤0,005); схожая тенденция затронула других животных опытных групп, но без статистически значимых изменений. Статистически значимо в группе «400 млн» снизился индекс пульсации Гослинга (на 37,7%, p≤0,016); в остальных группах выявлена аналогичная тенденция, что свидетельствует об увеличении упруго-эластических свойств сосудов под воздействием МКПКЧ.

Обсуждение

Проведенные исследования показали, что статистически значимых различий в регистрируемых параметрах между животными опытных и контрольных групп в покое не выявлено. Колебания регистрируемых параметров в экспериментальных группах (при сравнении с контрольными животными) может соответствовать естественным границам нормы для белых крыс [16]. При этом нужно отметить, что после интенсивной двухминутной физической нагрузки на фоне максимальной дозировки МКПКЧ статистически значимо на 7,9 и 8,0%% снижаются ЧСС и ЧДД (p=0,006 и 0,007 соответственно).

Мы определили, что у самцов при введении 800 млн кл/кг массы тела статистически значимо возросли линейная и объемная скорости кровотока (на 60,0 и 50,6% соответственно, p=0,005). Статистически значимо снизился индекс пульсации Гослинга (на 37,7%, p=0,016) при введении 400 млн клеток на кг массы тела, что может говорить об увеличении упруго-эластических свойств сосудов конечности под воздействием МКПКЧ.

Известно, что МКПКЧ широко распространяются по всему организму здоровых крыс в течение 24 часов после однократной внутривенной инъекции и могут оставаться в некоторых органах и тканях до 30 дней [17]. Такого способа введения может быть достаточно для оказания прямого терапевтического эффекта в нескольких тканях, включая ССС. Эти клетки остаются вблизи сосудов, из которых они вышли, и обладают способностью возвращаться в кровоток в более поздние моменты времени [18]. В условиях нашего эксперимента введенные клетки постоянно находились в организме реципиента и могли оказывать на него влияние через продукцию биологически активных веществ.

В этом аспекте результаты наших исследований, выявившие кардиопротекторные свойства МКПКЧ в виде снижения ЧСС на фоне физической нагрузки, повышения упруго-эластических свойств сосудов у животных, обосновывают целесообразность дальнейшего расширения спектра применения пуповинной крови на негематологические заболевания.

Точный механизм эффективности инфузий МКПКЧ в больших дозах у здоровых испытуемых при физических нагрузках еще предстоит выяснить. Кроме того, необходимы дальнейшие исследования, изучающие конкретные типы клеток МКПКЧ и/или возможные секретируемые ими факторы, способные модулировать поведение ССС.

Заключение

Внутривенное введение МКПКЧ в дозе 800 миллионов клеток на килограмм массы тела крыс способствует улучшению работы середечно-сосудистой системы по показателям использованных методов исследования, проявляющихся в увеличении способности переносить физические нагрузки и улучшении показателей периферической гемодинамики.

Вклад авторов:

Концепция и дизайн исследования, написание текста, редактирование — Морозова Я.В.

Обработка материала, редактирование — Скупневский С.В.

Сбор и обработка материала, статистическая обработка — Савельев Р.В.

Обработка материала, написание текста, редактирование — Рябов С.И.

Финансирование. Работа выполнена в рамках программы НИР государственного задания МЗ РФ №124013000811-9 на 2024—2026 гг.

Financing. The work was carried out as part of the research program under state assignment No. 124013000811-9 for the period 2024-2026.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.