Введение
Нейропептид галанин включает 30 аминокислотных остатков у человека (29 у других видов животных) и наряду с другими нейромедиаторами участвует в передаче сигнала на нервных окончаниях. Благодаря участию в различных биологических процессах, например, в потреблении пищи, выработке гормонов, запоминании, засыпании и прочее, галанин рассматривается в качестве регуляторного пептида [1]. Скрининг присутствия матричной РНК галанина показывает его высокое содержание не только в периферическом и центральном отделах нервной системы, но и в ряде других тканей, прежде всего в скелетной мускулатуре, жировой ткани, панкреатических островках [2], во всех отделах миокарда крыс [3]. Биологические свойства галанина опосредованы его взаимодействием с тремя типами рецепторов (GalR1, GalR2 и GalR3), относящимися к семейству G-белок-связанных рецепторов (GPCRs) [4]. С Gi/o ингибирующими белками связаны все подтипы рецепторов. GalR2 наряду с Gi/o взаимодействует с семействами белков Gq/11 и G12/13, тем самым внося разнообразие в действие специфических лигандов к рецепторам галанина [1]. У различных видов животных и у человека наблюдается консервативность для 15 N-концевых аминокислотных остатков [5]. Именно этот участок галанина используется как основа для получения новых биологически активных пептидов.
Для исследования кардиопротекторных свойств лигандов галаниновых рецепторов в ФГБУ «НМИЦ кардиологии» Минздрава России синтезированы с помощью Fmoc-методологии полноразмерный галанин крысы (G29) и шесть N-концевых фрагментов галанина (G1—G6) [6, 7] (табл. 1). Синтезированные пептиды включали аминокислотные остатки Trp2, Asn5, Gly8 и Tyr9, необходимые для преимущественного связывания с GalR2. Пептид G1 (AR-M1896) является специфическим агонистом к GalR2 и имеет невысокое сродство к GalR1 [8] и GalR3 [9]. К его недостаткам относится слабая растворимость в водных растворах и протеолитическая нестабильность. Пептиды G2 и G5, в состав которых входят аминокислотные остатки участка цепи галанина 2-15, включают His или Arg, полярные аминокислоты, способствующие повышению растворимости в водных растворах. Присутствие норлейцина (Nle11, G5) и β-аланина (βAla14, G2) предположительно повышает протеолитическую стабильность пептидов [10]. Кроме того, химерная молекула G2 включает дипептид карнозин (бета-аланил-L-гистидин) через связь Gly-Pro. Известно, что карнозин обладает антиоксидантной активностью, которая связана с его кардиопротекторными свойствами на фоне гипоксии [11]. При моделировании регионального ишемического и реперфузионного повреждения сердца крыс для всех синтезированных пептидов наблюдалось статистически значимое по сравнению с контролем уменьшение размера инфаркта миокарда и активности маркеров некроза (табл. 2). Ранжирование по эффективности действия синтезированных пептидов показало, что наиболее выраженными кардиопротекторными свойствами обладают пептиды G1 и G2, действию которых мы уделили основное внимание в последующей комплексной работе. Именно эти пептиды мы можем рекомендовать для последующей разработки новых лекарственных средств.
Таблица 1. Характеристика фрагментов галанина и его аналогов
| Пептид | Последовательность | Молекулярная масса расчетная | Растворимость в воде, мг/мл |
| G1 | H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-NH2* | 1136,3 | ~0,25 |
| G3 | H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-His-Ala-OH** | 1499,7 | ~10 |
| G4 | H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-His-Ala-NH2** | 1498,7 | ~4 |
| G2 | H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-βAla-His-OH*** | 1499,7 | >20 |
| G5 | H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Nle-Gly-Pro-His-Arg-OH | 1584,8 | >20 |
| G6 | H-Trp-Thr-Leu-Asn-Ala-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-NH2 | 1120,77 | ~0,2 |
| G29 | Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-His-Ala-Ile-Asp-Asn-His-Arg-Ser-Phe-Ser-Asp-Lys-His-Gly-Leu-Thr-ОН**** | 3165,48 | ~1 |
Примечание. * — фрагмент нативного галанина 2-11 (G1); ** — фрагмент нативного галанина 2-15 (G3) и его амид (G4); *** — красным шрифтом выделены искусственные замены у нативных фрагментов галанина; **** — галанин крысы. Курсивом выделен участок, на основе которого синтезировались химерные пептиды.
Таблица 2. Влияние пептидов галанина на размеры инфаркта миокарда, активность в плазме крови креатинкиназы и лактатдегидрогеназы при ишемическом и реперфузионном повреждении сердца крыс in vivo
| Пептид | N | ИМ/ЗР, % | КК-МВ, МЕ/л | ЛДГ, МЕ/л | ОД*, мг/кг | Источник |
| G29 | 9 | 25,6±3,1 | 1822±181,0 | 979±113,6 | 0,5 | [7] |
| G2 | 11 | 26,1±2,5 | 1595±187,1 | 964±81,0 | 1 | [16] |
| G1 | 10 | 32±2,6 | 1504+131,6 | 1027+72,3 | 1 | [18] |
| G3 | 10 | 31,4±3,6 | 1631±187,8 | 923±120,2 | 1 | [19] |
| G6 | 10 | 33,9±1,8 | 1779±177,2 | 1142±38,3 | 0,5 | [20] |
| G5 | 10 | 34,1±2,2 | 1780±78,0 | 941±92,2 | 1,0 | [19] |
| G4 | 10 | 34,1±1,4 | 1639±123,6 | 934±100,3 | 1,0 | [20] |
| Норма** | Литература | 0 | 270±27,8 | 93±10,73 | 0 | [7] |
| Контроль*** | 25 | 43,3±2,0# | 2350±78,7# | 1415±107,9# | 0 | [7] |
Примечание. ОД* — оптимальная доза пептидов; Норма** — значения показателей без моделирования ишемического и реперфузионного повреждения; Контроль*** — моделирование ишемического и реперфузионного повреждения без введения пептидов; # — контрольная группа по всем трем показателям статистически значимо отличается от всех групп. ИМ/ЗР — инфаркт миокарда/зона риска; ЛДГ — лактатдегидрогеназа; КК-МВ — креатинкиназа-МВ.
Моделирование региональной ишемии и реперфузии сердца у самцов крыс Вистар
Моделирование региональной ишемии и реперфузии (И/Р) миокарда крыс производилось с помощью окклюзии передней нисходящей коронарной артерии. Таким образом, зона ишемии захватывала только переднюю стенку левого желудочка (ЛЖ). Продолжительность ишемии составляла 40 мин. После восстановления кровотока производилось введение пептидов в различных дозах внутривенно, и следовал период реперфузии в течение 60 мин. В конце опыта производился забор крови и сердца. Выбранная модель вызывает И/Р повреждение сердца, хорошо воспроизводит патологические процессы, протекающие при остром инфаркте миокарда (ИМ) и точно локализует ишемическое повреждение в передней стенке ЛЖ, что недостижимо при моделировании ИМ фармакологическим путем, с использованием токсинов или под действием стресса.
Моделирование кардиомиопатии при хроническом введении доксорубицина
Классические химиотерапевтические препараты, в частности антрациклины, вызывают необратимую кардиомиопатию (КМП), приводящую к сердечной недостаточности (СН) [12]. Доксорубицин, наиболее часто используемый антрациклин, вызывает необратимую кардиотоксичность 1-го типа за счет избыточно образующихся активных форм кислорода (АФК) и активных форм азота (АФА) [13]. Действие доксорубицина также нацелено на топоизомеразу IIβ (Top IIβ) в кардиомиоцитах, что вызывает повреждение ДНК и апоптоз [14]. Поэтому в экспериментальной кардиологии одним из подходов для моделирования КМП является хроническое введение доксорубицина. Методика проведения эксперимента описана в работе I. Studneva и соавт. (2019) [15].
Оценка параметров токсичности пептида G2
Важным преимуществом действия пептидов галанина является их низкая токсичность. Оценка параметров токсичности пептида G2 на мышах линии BALB/с выполнена по методике W. Deichmann и T. Le Blanc. Однократное введение G2 в диапазоне доз от 37 до 520 мг на 1 кг массы тела не приводило к гибели животных и не провоцировало каких-либо признаков интоксикации в течение 14 дней наблюдения. Наибольшая доза, составляющая 520 мг на 1 кг массы тела, во много раз превышала рекомендуемую оптимальную дозу (ОД) (0,5—1 мг на 1 кг массы тела) для исследований и ограничивалась способностью растворения пептида в воде [16].
Гемодинамические показатели
Изучение гемодинамических показателей на модели И/Р при введении пептидов галанина в количестве ОД выявило незначительные изменения уровня среднего артериального давления и частоты сокращения сердца. Данные показатели в среднем были снижены на 15 и 7% по сравнению с исходным уровнем в контроле и после введения пептида соответственно. В конце опыта уровень среднего артериального давления и частота сокращений сердца соответствовали исходным значениям для обеих групп [6]. В опытах с моделированием КМП при введении доксорубицина у животных конечный систолический размер ЛЖ увеличивался, а фракция укорочения (ФУ) и фракция выброса (ФВ) снижались по сравнению с нормой до 67 и 69% соответственно. Совместное введение доксорубицина и пептида G2 статистически значимо уменьшало конечный систолический размер ЛЖ и увеличивало ФУ и ФВ по сравнению с этими показателями в группе доксорубицина [17].
Влияние галанина и его N-концевых фрагментов на размеры инфаркта миокарда и маркеры некроза
Проведен гистохимический анализ срезов ЛЖ. Величина ИМ определялась соотношением ИМ/зона риска (ЗР). В плазме измеряли уровни маркеров инфаркта миокарда, а именно креатинкиназы и лактатдегидрогеназы. Мы обнаружили статистически значимое уменьшение размеров ИМ и активности указанных маркеров для всех групп, в которых использовались разные модификации фрагментов галанина, в том числе и нативного галанина в пределах их оптимальных доз по сравнению с контрольной группой (см. табл. 2). Развитие КМП под действием доксорубицина сопровождалось увеличением активности креатинкиназы-МВ в плазме крови крыс, которая в 3 раза превышала нормальные значения. В группе G2+доксорубицин данный показатель возвращался к нормальным значениям.
Влияние пептидов галанина на энергетический статус миокарда
И/Р повреждение оказывало заметное влияние на содержание лактата и метаболитов энергетического обмена в сердце крысы. По сравнению с исходным состоянием в контроле в ЗР уровень АТФ был ниже в 4,5 раза, а общий пул адениннуклеотидов (ΣAH) — в 3 раза. Уровень фосфокреатина (ФКр) был ниже на 35%, что привело к уменьшению до 64% общего креатина (ΣКр) по сравнению с исходным значением, при этом уровень креатина (Кр) не претерпел заметных изменений. На фоне указанных изменений происходили активация гликогенолиза и гликолиза, накопление лактата, превышающее исходное значение почти в 10 раз. Введение пептидов G29, G1 или G2 сопровождалось статистически значимым увеличением содержания АТФ, АДФ и АМФ по сравнению с контролем. Уровни ФКр, ΣКр и содержание лактата в ЗР реперфузированного сердца к концу реперфузии восстанавливались до значений, близких к исходным [7, 16, 18, 19]. Сходные результаты наблюдались в опытах с моделированием КМП. После исследований в течение 8 недель общий пул адениннуклеотидов в сердце и аденилатный энергетический заряд кардиомиоцитов у крыс группы доксорубицина были статистически значимо ниже, чем в норме, за счет уменьшения содержания АТФ. Так, содержание ФКр в сердцах животных группы доксорубицина было в 2 раза ниже нормальных значений. Это вызывало уменьшение ΣКр, поскольку содержание свободного Кр под влиянием доксорубицина не изменялось. В группе, в которой G2 вводили совместно с доксорубицином, увеличивался уровень АТФ и АДФ, вследствие чего наблюдалось 1,5-кратное увеличение ΣАН, которое не отличалось от этого показателя в норме. В этой же группе уровни ФКр и ΣКр в миокарде значительно превышали значения данных показателей для группы доксорубицина и были близки к нормальным значениям [17, 20].
Влияние галанина и его N-концевых фрагментов на антиоксидантное состояние миокарда
Окислительный стресс и воспаление являются взаимосвязанными процессами, вовлеченными в сердечно-сосудистые и онкологические заболевания [21] наряду с апоптозом [22] и некрозом [23]. Окислительный стресс, развивающийся на фоне И/Р повреждения миокарда, вызванный генерацией АФК, играет важную роль и в развитии ИМ [24]. Митохондриальный супероксид анион (О2–), образующийся в цепи переноса электронов, является одним из наиболее реактивных короткоживущих АФК и считается основной причиной развития окислительного повреждения клеток [25]. При моделировании И/Р повреждения сердца нами обнаружена высокая концентрация тиобарбитуратных кислотно-активных продуктов (ТБКАП) в плазме крови и миокарде крыс наряду со снижением активности супероксиддисмутазы Cu, Zn-СОД (СОД), каталазы (КАТ) и глутатионпероксидазы (ГП) в ЗР ЛЖ [26]. Введение пептидов G2 и G29 после периода окклюзии коронарной артерии увеличивало активность Cu, Zn-СОД, КАТ и ГП в ЗР, что сопровождалось снижением уровня ТБКАП к окончанию перфузии [26]. Окислительный стресс является одним из ведущих факторов кардиотоксичности, инициируемой доксорубицином [27]. Развитие КМП под действием доксорубицина сопровождалось активацией перекисного окисления липидов и повреждением мембран кардиомиоцитов. Для группы доксорубицина в конце 8-й недели эксперимента уровень ТБКАП в плазме крови и сердце крысы намного превышал значения данного показателя для животных контрольной группы. При введении G2 на фоне доксорубицина этот показатель статистически значимо снижался [17]. Отмечено, что действие доксорубицина приводит к снижению активности ГП, появлению тенденции к уменьшению активности Cu, Zn-СОД и увеличению активности КАТ по сравнению с нормой. Совместное введение доксорубицина и G2 статистически значимо увеличивало активность Cu, Zn-СОД, ГП и незначительно КАТ по сравнению с этими показателями в группе доксорубицина. Введение одного пептида G2 не влияло на активность антиоксидантных ферментов.
В современной литературе отсутствуют данные, свидетельствующие о прямом антиоксидантном действии галанина и его модифицированных N-концевых фрагментов или пептидов, содержащих последовательность карнозина в С-концевой части молекулы. Возможным объяснением антиоксидантного действия пептидов галанина может быть увеличение экспрессии генов антиоксидантных ферментов. Так, в недавней работе A. Timotin и соавт. (2019) изучали уменьшение размеров ИМ у мышей, получавших галанин. Обнаружено увеличение экспрессии мРНК Cu, Zn-СОД в кардиомиоцитах [28]. Принципиально сходные результаты получены при изучении влияния G1 на выживаемость кардиомиобластов крысы линии (H9c2) в ответ на окислительный стресс, вызванный пероксидом водорода (H2O2). Добавление в инкубационную среду G1 увеличивало жизнеспособность клеток, подавляло апоптоз и избыточное образование митохондриального супероксид аниона [29]. Известно, что некоторые пептиды обладают способностью перехватывать АФК и ингибировать перекисное окисление липидов. Статистический анализ выявил, что высокой антиоксидантной активностью обладают низкомолекулярные пептиды с определенным аминокислотным составом, в частности, с высокой концентрацией His, и гидрофобных аминокислот. Предполагается, что вторая аминокислота, примыкающая к С-концу, вносит основной вклад в активность антиоксидантов, среди которых наиболее предпочтительны Asp, Glu, His, Arg, Lys, Pro [30]. Как раз используемые нами пептиды содержат во втором положении лейцин, гистидин или пролин. Пролин находится во втором положении и у другого пептида, обладающего доказанными кардиопротекторными и антиоксидантными свойствами, — метилина (H-MeArg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Phe-OH).
Влияние галанина и его N-концевых фрагментов на обмен глюкозы
В большом количестве исследований показана важная роль галанина в обмене глюкозы [31, 32]. При интрацеребровентрикулярном введении агониста галаниновых рецепторов M617, помимо увеличения экспрессии мРНК GLUT4, увеличивались уровни фосфорилированной Akt и фосфорилированного AS160 в скелетных мышцах [33]. Установлено, что совместное введение инсулина и галанина приводит к повышению поглощения миоцитами меченой глюкозы, повышению плотности GLUT4 в клеточных мембранах и увеличению внутриклеточной концентрации фосфорилированного AS160, по сравнению с другими двумя группами, где инсулин и галанин вводили раздельно друг от друга [34, 35]. В исследовании, выполненном A. Kim и соавт. (2010) [34], обнаружено влияние галанина и на другой важный фактор метаболизма глюкозы. На мышах, находящихся на высокожировой диете, показано, что на фоне увеличения экспрессии галанина и всех трех типов его рецепторов в жировой ткани наблюдается увеличение уровня PPAR-γ (гамма) на 40% по сравнению с контролем. Как известно, PPAR-γ участвует в контроле гомеостаза глюкозы, липидном обмене и служит важной терапевтической мишенью при сахарном диабете 2-го типа [36].
Сигнальные пути, запускаемые галанином
Активацию механизмов клеточной защиты поврежденного сердца под действием галанина прежде всего связывают с запуском сигнальных путей через GalR2, который сопряжен с тремя семействами G белков (Gi/o, Gq/11 и G12/13). Запуск Gi/o пути ведет к ингибированию активности циклической аденилатциклазы (цАМФ), что способствует активации субстрата протеинкиназы B (PKB) и Akt субстрата 160 кДа (AS160). При запуске сигнального пути через Gq/11 реализуется один из механизмов поглощения клетками глюкозы, наблюдаемый под действием инсулина, посредством запуска PI3K сигнального пути через ферментативное действие фосфолипазы С (PLC). Этот фермент взаимодействует с регуляторной субъединицей фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), что приводит к фосфорилированию мембранных фосфатидилинозитолфосфатов по 3-му положению до фосфатидилинозитол-3,4-дифосфата (PIP2) и фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата (PIP3). В свою очередь PIP3 регулирует активность протеинкиназы B (PKB/Akt) и протеинкиназы C (PKC). PKB, как и PKC, играет важную роль в активации транспортера глюкозы 4 (GLUT4) посредством активации белка, активирующего rab GTPase (AS160), которая является субстратом PKB [36]. Исследования показывают, что введение галанина значительно увеличивает активность pPKB и pAS160 в мышечной и жировой тканях крыс с диабетом 2-го типа [37]. Подобные эффекты очень важны при восстановлении миокарда на фоне снижения уровня АТФ [38]. Через путь Gq/11происходит активация фосфолипазы C с последующим гидролизом фосфатидилинозитолдифосфата, тем самым галанин принимает участие в регуляции гомеостаза Са2+, улучшая инотропные свойства сердца [1].
По мере развертывания сигнального ответа на действие галанина наблюдается ингибирование проапоптотических белков BAD/BAX и активностей каспазы-3 и каспазы-9 [39], стимулируются реакции, активируемые митогенактивируемыми протеинкиназами (MEK1/2 и ERK1/2), приводящие к ингибированию открытия митохондриальной поры временной проницаемости (mPTP). Этот путь связан с подвижностью и выживанием [40]. Последующее фосфорилирование ERK способствует увеличению экспрессии рецепторов, активируемых пролифераторами пероксисом (PPARs), отвечающих за энергетический метаболизм, в том числе увеличивается экспрессия PPARγ, стимулирующая поглощение и окисление глюкозы кардиомиоцитами [41]. Таким образом, галанин и его активные N-концевые фрагменты способны действовать через различные механизмы защиты сердечной мышцы.
Заключение
Приведенные данные свидетельствуют о том, что в условиях развития кардиомиопатии под действием хронического введения доксорубицина или при ишемическом и реперфузионном повреждении сердца пептиды галанина способны корректировать энергетический дисбаланс, улучшать метаболизм глюкозы, снижать уровень активных форм кислорода и повышать активность ферментов антиоксидантной защиты в миокарде. Кардиопротекторные свойства галанина выражаются в уменьшении размеров острого инфаркта миокарда, восстановлении фракции укорочения и фракции выброса, сниженных при кардиомиопатии. Таким образом, галанинергическая система является перспективной терапевтической мишенью для снижения токсичности антрациклиновых антибиотиков и уменьшения ишемического и реперфузионного повреждения сердца. Причем наиболее выраженными кардиопротекторными свойствами обладают пептиды G1 и G2. Именно эти пептиды мы можем рекомендовать для последующей разработки новых лекарственных средств.
Благодарности
Авторы выражают искреннюю благодарность руководителю лаборатории метаболизма сердца ФГБУ «НМИЦ кардиологии» Минздрава России О.И. Писаренко за ценные советы при работе над статьей.
Финансовая поддержка
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №18-015-00008 и 18-015-00009).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.