CELSR и планарная клеточная полярность

Лимфедема — заболевание, характеризующееся застоем богатой белком жидкости в интерстициальных тканях, когда скорость продукции лимфы превышает скорость ее удаления [1]. Первичная лимфедема (ПЛ), включая изолированные, синдромные и системные формы, встречается с частотой около 1,00—1,15 на 100 тыс. человек в возрасте до 20 лет [2, 3], возникает вследствие врожденной дисплазии, гипоплазии или гиперплазии компонентов лимфатической системы, вызванной генетическими нарушениями. В настоящее время выделяют до 13 форм изолированной ПЛ и несколько системных и синдромных форм, включая синдром лимфангиэктазии-лимфедемы Хеннекама, лимфедему-дистихиаз, холестаз-лимфедему и др. [4]. Мутации в семи генах (FLT4, GJC2, FOXC2, SOX18, GATA2, CCBE1 и PTPN14) ответственны за развитие 36% наследственных и 8% спорадических случаев заболевания [5]. Большинство из них связаны с сигнальным путем рецептора фактора роста эндотелия сосудов 3 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3, VEGFR3), который отвечает за эмбриональный лимфангиогенез [4]. Дефекты передачи сигнала VEGFR3 приводят к аплазии лимфатических сосудов и развитию врожденной лимфедемы типа 1A (лимфедема Милроя) [4, 6—8].

Сигнальный путь VEGFR3 является основным, но не единственным биологическим механизмом, отвечающим за развитие патологии лимфатической системы. Появляется все больше сообщений об ассоциации нарушений в белках (генах), ответственных за морфологию сосудов, с развитием ПЛ: атипичного кадгерина FAT4 и синдрома лимфангиэктазии-лимфедемы Хеннекама 2 (код по электронной базе данных «Менделевское наследование у человека», Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM: 616006), коннексина GJC2 и лимфатической мальформации 3 (OMIM: 613480), компонента механочувствительного ионного канала PIEZO1 и лимфатической мальформации 6 (OMIM: 616843), рецептора адгезии CELSR1 — организатора комплекса планарной клеточной полярности (Planar Cell Polarity, PCP) — и лимфатической мальформации 9 (ЛМ9; OMIM: 619319) [9].

Понятие «планарная клеточная полярность» обозначает способность клеток к образованию поляризованных межклеточных контактов, определяющих кооперативное поведение клеток для формирования нормальной структуры органов и тканей и сам процесс образования таких контактов. PCP представляет собой неканонический путь передачи сигнала WNT без участия β-катенина. Белки, вовлеченные в данный процесс, были описаны при изучении строения крыла Drosophila melanogaster. Основной (коровый) модуль включает 6 участников: трансмембранные компоненты Frizzled (Fzd), Vangl и Flamingo (Fmi у дрозофилы; Celsr1 у позвоночных), цитоплазматические Disheveled (Dvl), Prickle (Pk) и Diego (Dgo у дрозофилы, Inversin/Diversin у позвоночных). Flamingo (Celsr1) формирует транс-димеры и участвует в организации поляризованных структур между соседними клетками в плоскости эпителия [10, 11] и оказывают координирующий эффект при распространении сигнала от клетки к клетке [12, 13] (рис. 1).

Рис. 1. Модель организации комплекса планарной клеточной полярности и патологии, ассоциированные с нарушениями структуры комплекса.

CELSR1 (ADGRC1), CELSR2 (ADGRC2, MEGF3) и CELSR3 (ADGRC3, MEGF2, Fm1, EGFL1) составляют подсемейство C-рецепторов адгезии, сцепленных с G-белком (Adhesion G protein-coupled receptor, ADGRC) [11, 14]. Белки CELSR являются неклассическими кадгеринами, которые, в отличие от классических представителей, не взаимодействуют с катенинами. В структуре CELSR выделяют крупный эктодомен, состоящий из 2700 аминокислот, который включает 8 или 9 N-концевых кадгериновых повторов, до 8 доменов, подобных эпидермальному фактору роста, до двух повторов ламинина G-типа, EGF-подобный ламинин, один мотив гормонального рецептора (HRM) и домен GAIN (GPCR Autoproteolysis INduction). В мембрану встроен 7-трансмембранный домен (7-ТМ), внутриклеточный цитоплазматический хвост имеет размер 300—600 аминокислотных остатков (P35916 VGFR3_HUMAN) [11, 15] (рис. 2).

Рис. 2. Структура белка CELSR1.

Представлены основные домены и их относительный размер в соответствии с количеством аминокислотных остатков в каждом домене.

Функционирование белков семейства CELSR на молекулярном уровне во многом остается малопонятным. Как и большинство членов семейства ADGR, они являются орфанными рецепторами с неизвестным механизмом активации. Даже предположение о связи CELSR с гетеротримерным G-белком основано только на наличии характерного для GPCR 7-трансмембранного домена, а участок, взаимодействующий с каким-либо G-белком, пока не идентифицирован. Кадгериновые, EGF-подобные и ламининовые повторы придают адгезивные свойства и облегчают межклеточную коммуникацию, а домены GAIN и ламинин могут связывать неидентифицированные лиганды. Участок GPS в домене GAIN у большинства ADGR отвечает за автопротеолиз внеклеточного домена, протекающий в просвете эндоплазматического ретикулума при биосинтезе рецепторов. Зрелые ADGR обычно расщеплены и существуют в виде нековалентно связанного комплекса N- и C-концевых фрагментов, но некоторые из них, в том числе CELSR1, не расщепляются из-за отсутствия консенсусной каталитической последовательности (Leu↓Thr/Ser/Cys) в GPS [11]. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что ADGR способны активировать сигнальные события, не связанные с G-белками, а основанные на гомофильных транс-взаимодействиях, которые необходимы для планарной клеточной полярности [11].

Гомологи генов и белков подсемейства ADGRC присутствуют у большинства животных, включая кишечнополостных, насекомых, асцидий, ланцетников, желудевых червей и высших позвоночных. Как упоминалось выше, структура комплекса PCP была исследована на клетках крыла D. melanogaster, а при помощи модельных линий мышей с мутациями и нокаутом Celsr1 были выявлены особенности экспрессии и определена роль Celsr1 при органогенезе и функционировании различных систем организма (табл. 1). Одной из первых таких моделей стали линии мышей Spin cycle (Celsr^Scy, p.N1110K) и Crash (Celsr^Crsh, p.D1040G) с миссенс-мутациями в области кадгериновых повторов CELSR1, разработанные J. Curtin и соавт. в 2003 г. [16].

Таблица 1. Экспериментальные модели для исследования CELSR1

Эмбрионы с гомозиготными мутациями были нежизнеспособны вследствие серьезного дефекта нервной трубки — неспособности инициировать ее закрытие от границы среднего/заднего мозга по всему позвоночнику. Гетерозиготные особи имели отклонения в функционировании вестибулярного аппарата, проявлявшиеся в характерном поведении: встряхивании головой, скручивании, вращении во время подвешивания за хвост. У мутантных мышей также отмечались слуховые нарушения, и при исследовании кортиева органа взрослой особи были обнаружены дефекты ориентации стереоцилиарных пучков [16]. Полное отсутствие (нокаут) CELSR1, по-видимому, является даже менее критичным, чем патогенные мутации: было показано, что летальность у эмбрионов мыши Celsr1^-/- составляет около 20% [18]. Таким образом, при помощи мутантных мышей (и других животных моделей) были выявлены основные «мишени» CELSR1: нервная трубка и ее производные [16, 19], волосы [17], стереоцилии и нейроны внутреннего уха [21, 22], ресничные клетки яйцевода [24] и других трубчатых органов, клапаны эндотелиальных сосудов [20].

CELSR1 и лимфедема

CELSR1 имеет критически важное значение для эмбрионального развития лимфатической системы. В процессе формирования лимфатических и венозных клапанов эндотелиальные клетки удлиняются, подвергаются переориентации и скоординированной миграции в просвет сосуда, где инициируют формирование створок клапана. Celsr1 в сосудах мыши начинает экспрессироваться при формировании клапанов, на 16-й день эмбрионального развития (E16—E16.5) [20], что примерно соответствует 23-й гестационной неделе у человека [25]. Нокаут Celsr1 у мышей приводит к нарушению межклеточных контактов, эндотелиальные клетки не способны перестраиваться и принимать перпендикулярную ориентацию в местах инициации клапана, что приводит к его аплазии. Дисфункция клапанов препятствует способности лимфатической системы собирать и выводить богатую белком жидкость из тканей, что может привести к лимфатическому отеку [26]. При этом Celsr1 необходим для формирования, но не для поддержания структуры лимфатической системы — нокауты после образования клапана не влияют на сосуды [20].

Нарушения CELSR1 ассоциированы с развитием ЛМ9. На сегодняшний день опубликовано менее 10 экспериментальных статей, описывающих генетические особенности и клинико-фенотипические признаки заболевания (табл. 2). Показано, что ЛМ9 относится к формам с ранней манифестацией (первая декада жизни), характеризуется неполной пенетрантностью и вариабельностью тяжести проявлений, поражает преимущественно женщин. Частота заболевания пока не установлена, но в наиболее крупном исследовании P. Maltese и соавт. инактивирующие мутации CELSR1 были выявлены у 5 из 95 пациентов с ПЛ [1]; таким образом, частоту ЛМ9 среди пациентов с изолированной ПЛ можно ориентировочно оценить в 5%.

Таблица 2. Патогенные и условно-патогенные мутации CELSR1 у пациентов с первичной лимфедемой

Первым исследованием, подтвердившим ассоциацию CELSR1 с развитием лимфедемы, стала работа M. Gonzalez-Garay и соавт. [27]. При помощи полноэкзомного секвенирования у пробанда с семейной ПЛ была выявлена нонсенс-мутация CELSR1 (c.5871G>A, p.Trp1957*). По словам пациента, впервые отеки нижних конечностей появились у него в 10-летнем возрасте, однако диагноз был поставлен только в 39 лет. Для оценки функционирования лимфатической системы ног была проведена флуоресцентная лимфатическая визуализация в ближнем инфракрасном диапазоне, при которой наблюдался характерный лимфатический фенотип, проявляющийся в извилистости сосудов, обширном обратном токе лимфы, а также в уникальном «листовом потоке» в обеих ногах, который указывает на дефект работы клапанного механизма при движении лимфы в коллекторах. Исследователи провели генотипирование и других членов трех поколений семьи. Инактивирующий вариант CELSR1 был идентифицирован у 5 членов семьи с подтвержденной лимфедемой нижних конечностей и отсутствовал у 6 здоровых. После построения родословной характер наследования заболевания был определен как аутосомно-доминантный [27].

Вторым крупным исследованием семейной лимфедемы, ассоциированной с CELSR1, стал анализ 22 членов семьи, проведенный R. Erickson и соавт. в 2019 г. Лимфедема была диагностирована у 5 человек — все женщины, с поражениями нижних конечностей разной степени и манифестацией заболевания в детском и раннем подростковом возрасте. В ходе полноэкзомного секвенирования двух женщин с лимфатическими нарушениями и их отца, у которого не наблюдалось симптомов заболевания, была обнаружена инактивирующая мутация CELSR1 (c.5121dupC, p.Ile1708fs*44). Всем троим была проведена лимфосцинтиграфия нижних конечностей, показавшая у одной из женщин выраженные лимфатические нарушения, включающие множественное расширение сосудов, увеличенное количество мелких лимфатических узлов со слабым фокусом активности, что может свидетельствовать об аномалии лимфатического протока, вызванной нарушением работы клапана. У второй женщины была более легкая форма, характеризовавшаяся наличием множественных извилистых каналов и мелких плохо визуализируемых узлов в паховой и подвздошной областях. Их отец имел небольшие отклонения в строении лимфатической системы, не приводящие к развитию заболевания. Для подтверждения мутации образцы 17 из 22 членов семьи были исследованы при помощи секвенирования по Сэнгеру, которое показало, что носителями данного варианта являются 5 женщин и 4 мужчин, но клинические проявления были обнаружены только у женщин. Авторы предположили, что одним из вероятных объяснений манифестации, ограниченной полом, являются особенности гормональной регуляции в эмбриональный, ранний постнатальный и пубертатный периоды [28].

Поиск новых полиморфизмов CELSR1, ассоциированных с развитием лимфедемы, также провели P. Maltese и соавт. (2019), которые при анализе 95 пробандов обнаружили 5 человек с инактивирующими мутациями CELSR1 (c.5226+2T>A; c.6739+1G>A; c.868G>T, p.Glu290*; c.2042del p.Asn681Metfs*16; c.5702-1G>C); еще 7 редких миссенс-вариантов были классифицированы как «варианты неопределенной значимости» (variants of uncertain significance, VUS). У 4 женщин с инактивирующими мутациями заболевание проявилось в детском и подростковом возрасте и выражалось в одностороннем и двустороннем отеке и поражением нижних конечностей. У мужчины с мутацией c.5702-1G>C заболевание проявилось в 77 лет, обследование родственников не проводилось, однако имелись данные о том, что его мать и дочь страдали лимфедемой. При помощи экзомного секвенирования инактивирующие варианты CELSR1 были найдены еще у 5 из 10 членов семей пробандов, итого выявлено 10 носителей инактивирующих мутантных вариантов. Лимфедема проявилась у 5 (83%) из 6 женщин с мутациями и у 1 (25%) из 4 мужчин. На основании полученных результатов авторы исследования также сделали вывод о том, что у этого заболевания имеются определенные закономерности проявления, связанные с полом: женщины характеризуются практически полной пенетрантностью и более ранним проявлением лимфедемы, тогда как мужчины — неполной пенетрантность с более поздней манифестацией заболевания [1].

Еще один случай семейной лимфедемы, ассоциированный с CELSR1, наблюдали в Корее. У 27 пациентов с ПЛ из 60 исследуемых CELSR1 оказался наиболее часто мутирующим геном. Стоит отметить, что доля пациентов с врожденной лимфедемой в исследуемой когорте составила менее 10%, что может влиять на спектр подтипов ПЛ и выявляемых мутаций. Гетерозиготная нонсенс-мутация c.8446C>T (p.Gln2816*) была обнаружена у матери и дочери с лимфедемой верхних и нижних конечностей и классифицирована как «вероятно патогенная». У дочери была выявлена дополнительная мутация c.8871_8872del (p.Cys2957*), которая может обусловливать более тяжелое течение заболевания [29].

В работе C. Sudduth и соавт. (2022) был исследован случай несиндромальной лимфедемы у молодого мужчины: в 9-месячном возрасте появился отек правой руки (что было подтверждено лимфосцинтиграфией), а в 19 лет развился отек правой ноги. Полноэкзомное секвенирование образцов пациента и его матери, имевшей лимфедему нижних конечностей, выявило делецию в гене CELSR1 (c.4326_4332del; p.Thr1443Gfs*14), приводящую к сдвигу рамки считывания и образованию стоп-кодона [30].

Только в 10% случаев ПЛ отек начинался с верхних конечностей, причем в ¹/₂ таких случаев он впоследствии проявлялся и на нижних конечностях [31]. Первичная лимфедема верхних конечностей часто обнаруживается при синдромальных состояниях или при поражениях генов, вызывающих генерализованную лимфатическую дисплазию. Синдром Фелан—МакДермид — одно из заболеваний, сопровождающихся лимфатическими отеками. Это системное заболевание, вызванное делецией, хромосомными перестройками 22q13.3 или патогенными мутациями SHANK3, расположенного в этом локусе. SHANK3 — компонент нейронального синапса, и его дисфункция может объяснить типичную клиническую картину синдрома, включая отсутствие или сильную задержку речевого развития, умственную отсталость [32]. В то же время заболевания почек и лимфедема, по-видимому, ассоциированы с другими нарушениями в генах, расположенных в локусе 22q13.3, например, отсутствием CELSR1 и/или, ATXN10, FBLN1, UPK3A, WNT7B [33, 34]. Было высказано предположение, что лимфедема верхних и нижних конечностей при синдроме Фелан—МакДермид может быть результатом инактивации CELSR1 [33], а небольшое нарушение в структуре самого CELSR1 может приводить к развитию несиндромальной лимфедемы [30], но это предположение пока не нашло убедительного эспериментального подтвеждения.

CELSR1 и другие заболевания

Нарушение продукции нормального CELSR1 приводит к дефектам эмбрионального развития и постэмбрионального функционирования различных органов и систем. Наиболее тяжелые последствия описаны для ЦНС, поскольку клеточная полярность играет решающую роль в нейруляции на стадии раннего эмбриогенеза. Простые и составные гетерозиготные мутации CELSR1, дигенные и полигенные мутации в генах PCP ассоциированы с дефектами нервной трубки у человека и животных: анэнцефалией, спинальной дизрафией, краниорахишизисом, гидроцефалией [35—38]. Этиопатогенез анэнцефалии, наряду со средовыми и другими генетическими факторами, включает несколько соматических мутаций в генах CELSR1, VANGL1, VANGL2 и FZD6, которые нарушают передачу сигнала или дестабилизируют комплекс PCP [39, 40].

С началом нейрогенеза апикальные нейрональные клетки-предшественники переходят от симметричного (пролиферативного) к асимметричному (дифференцирующему) способу деления, который прямо или косвенно — через базальные промежуточные предшественники — приводит к образованию нейронов. За счет серии симметричных делений базальные предшественники обеспечивают увеличение конечного пула нейронов [41]. Нарушение баланса между пролиферацией и дифференцировкой апикальных нейрональных предшественников приводит к выраженным морфологическим и поведенческим дефектам. В ходе эмбрионального развития CELSR1 участвует в контроле нейрогенеза, имеющего критическое значение для регулирования количества, разнообразия и положения нейронов, а также для нормализации размера и архитектуры коры головного мозга. Ошибки нейрогенеза у мышей с мутациями Celsr1 приводят к уменьшению количества кортикальных нейронов, аномальной архитектуре головного мозга (более толстой вентрикулярной/субвентрикулярной зонам и более тонким верхним слоям неокортекса), микроцефалии и поведенческим нарушениям: гиперактивности, аномальному исследовательскому поведению или, напротив, социальной изоляции. Комбинация данных фенотипов по большей части характеризует заболевания нервной системы человека, при которых нередко встречаются расстройства аутистического спектра (РАС) и синдром дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ). Это подтверждает и транскриптомный анализ: 10% неправильно регулируемых генов у мутантных по CELSR1 особей связаны с РАС, а 2,5% — с СДВГ [42, 43].

CELSR1 связан не только с ошибками нейрогенеза, но и с патогенезом нейродегенеративных заболеваний. Показано, что при болезни Паркинсона может нарушаться баланс сигнальных путей WNT: активация пути WNT/PCP и подавление передачи сигнала WNT/β-катенин, что приводит к нарушению гомеостаза дофаминэргических нейронов [44, 45]. Гиперэкспрессия CELSR1 обнаружена у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой, что также может свидетельствовать о вкладе PCP в патогенез этого заболевания [46, 47]. Предполагалось, что CELSR1 может участвовать и в развитии шизофрении, но экспериментальные исследования пока не подтвердили эту гипотезу [48].

PCP необходимы для нормальной организации эпителия при формировании трубчатых структур выделительной и репродуктивной системы. В нескольких исследованиях было показано, что CELSR1 и VANGL2 участвуют в морфогенезе мочеточников [49—51]. В почках мутантных мышей с гомозиготными и гетерозиготными мутациями Celsr1 (crash) и Vangl2 (loop-tail) наблюдалось дефектное ветвление, гетерозиготные мутации Celsr1 и Vangl2 также приводили к образованию незрелых клубочков. Было обнаружено, что на поздних стадиях эмбриогенеза CELSR1 необходим для контроля диаметра канальцев, предотвращения их разрастания за счет ориентации митоза вдоль продольной оси почечных канальцев [52]. Показано, что развитие аутосомно-доминантного поликистоза почек может быть связано с нарушением системы планарной клеточной полярности: в 6 из 10 образцов почечных кист были обнаружены патогенные мутации в гене CELSR1 [53]. Также была выявлена ассоциация полиморфизма rs9846911 CELSR1 с хронической болезнью почек, осложненной гипертонией [54].

Инактивация CELSR1 может быть причиной нарушений развития и функционирования органов репродуктивной системы. В работе D. Shi и соавт. (2014) были исследованы 43 гомозиготные самки мыши с делецией в 26—29 экзонах Celsr1, все они были бесплодны. Авторы изучили структуру репродуктивных органов и на основании обнаруженных изменений заключили, что Celsr1 необходим для направленного движения ресничек, формирования правильной формы и расположения эпителиальных клеток, что способствует нормальному морфогенезу эпителиальной ткани [55].

Мутации и другие нарушения CELSR1 связаны с развитием онкологических заболеваний человека и могут влиять на эффективность противоопухолевой терапии и агрессивные свойства опухоли [56—58]. CELSR1 входит в число наиболее часто мутирующих генов в образцах аденокарциномы толстой кишки [59] и плоскоклеточного рака ротовой полости [60]. мРНК CELSR1 гиперэкспрессирована при глиоме и способствует пролиферации, миграции и инвазии клеток глиомы [61]. Гиперэкспрессия CELSR1 обнаружена и при другой опухоли ЦНС, эпендимоме [62]. При раке молочной железы CELSR1 может быть использован как маркер люминальных подтипов опухоли [63] и для прогнозирования инвазии протоковой карциномы in situ [64]. Показана связь CELSR1 с регуляторными микроРНК: CELSR1 является прямой мишенью miR-199a-5p в клетках глиомы [61]; miR-629-5p ингибирует CELSR1 в клетках аденокарциномы легких, способствуя повышению проницаемости эндотелиальных клеток и метастазированию [65]; при раке яичников кольцевая РНК CELSR1 (circCELSR1) связывает miR-598, что повышает экспрессию BRD4 и способствует пролиферации и миграции опухолевых клеток [66].

CELSR1 играет важную роль в развитии сердечно-сосудистой системы. J. Theis и соавт. (2022) исследовали 5 семей, имеющих наследственную аномалию, двустворчатый аортальный клапан. При помощи полногеномного секвенирования были идентифицированы потенциально патогенные миссенс-варианты в нескольких генах, в том числе в CELSR1. Также обнаружена связь мутаций CELSR1 с синдромом гипоплазии левых отделов сердца [67] и других врожденных пороков сердца [68]. Кроме того, имеются многочисленные данные об ассоциации CELSR1 с развитием ишемического инсульта [69—72].

Исследование роли CELSR1 в патологических и физиологических процессах не ограничивается приведенными исследованиями. Показана связь CELSR1 с хронической обструктивной болезнью легких [73], ревматоидным артритом [74] и семейным косоглазием [75], но биологические механизмы этих процессов пока не ясны. Также продолжаются исследования роли CELSR1 в развитии лимфедемы и поиск новых маркеров лимфатических нарушений. Совершенствование технологий генетического тестирования позволило проводить диагностику изменений сразу в нескольких генах, ассоциированных и потенциально ассоциированных с развитием лимфедемы. Результатом анализа молекулярно-генетических особенностей подтипов ПЛ стала возможность информирования пациентов о том, чего они могут ожидать от своего заболевания, и о том, как лучше всего избежать осложнений и справиться с ними [4, 76, 77]. В то же время использование технологий секвенирования нового поколения в биомедицинских исследованиях и для диагностики заболеваний привело к обнаружению множества вариантов неопределенной значимости, что затрудняет интерпретацию результатов.

В случае с CELSR1 анализ функциональной и клинической значимости генетических вариаций осложняется также тем, что механизмы активации и регуляции самого рецептора остаются малопонятными, а частота выявляемых мутаций очень низкой [9]. Несмотря на то что CELSR1 является перспективным маркером ПЛ, в настоящее время генетическое тестирование на мутации CELSR1 у больных лимфедемой в формате исследования одного гена не имеет явного практического значения. В то же время при анализе данных полноэкзомного и полногеномного секвенирования мутации CELSR1 следует рассматривать как возможную причину первичной лимфедемы, особенно для пациентов, у которых клинико-фенотипическая картина не соответствует более распространенным подтипам заболевания, таким как лимфедема Милроя [4].

Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности. ПРОЕКТ №FZSM-2023-0011.

Участие авторов:

Концепция и структура работы — Ю.В. Филина, А.А. Ризванов, Р.Р. Мифтахова

Сбор и обработка материала — Ю.В. Филина, А.К. Фейсханов, А.Р. Ибрагимова

Написание текста — Ю.В. Филина, А.Р. Ибрагимова

Редактирование — Р.Р. Мифтахова, А.А. Ризванов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.