Генетические предикторы варикозной болезни малого таза: пилотное исследование

Варикозная болезнь малого таза (ВБМТ) — широко распространенное заболевание, патофизиологической основой которого является рефлюкс по гонадным венам и венам органных сплетений малого таза. В большинстве случаев рефлюкс наблюдается на фоне расширения вен и их клапанной недостаточности. Варикозная трансформация чаще всего наблюдается после беременности, однако заболевание диагностируется более чем у 25% женщин репродуктивного возраста, независимо от количества беременностей, родов и прочих факторов риска [1].

Немалое внимание уделяется роли наследственной дисплазии соединительной ткани в исследованиях этиологии варикозной трансформации вен, в частности малого таза. Выявлено, что наличие стигм дизонтогенеза, свидетельствующих о дисплазии соединительной ткани, и биохимические маркеры достоверно чаще встречаются у пациенток с варикозным расширением и рефлюксом вен малого таза, в группе сравнения стигмы выявлены в несколько раз реже [2]. Это дает основания рассматривать факторы, в том числе молекулярно-генетические, свидетельствующие о наличии наследственной дисплазии соединительной ткани, в качестве предикторов ВБМТ.

В настоящее время доказано наличие молекулярно-генетических факторов риска развития хронических заболеваний вен нижних конечностей, в том числе варикозной болезни [3]. Особо выделяются такие вероятные факторы, как полиморфизмы генов матриксных металлопротеиназ (ММР) — группы сериновых протеаз, обеспечивающих структурное равновесие внеклеточного матрикса. Именно дисфункция ММР легла в основу современной теории патогенеза варикозной болезни [4].

Генетические факторы являются важнейшим звеном в определении риска варикозной болезни, поскольку они конституциональные и не изменяются в течение всей жизни; это делает особенно актуальным изучение изменений в структуре генов [5, 6] для улучшения методик персонализированной диагностики и лечения.

Для проведения исследования в этом направлении были выбраны 3 гена-кандидата: ММР 3-го типа (MMP-3 -1171dupА (5А/6А)), ММР 12-го типа (ММР-12 A82G) и сосудисто-эндотелиальный фактор роста (VEGF G634C) [7, 8]. VEGF является фактором, способствующим ангиогенезу и пролиферации клеток стенки сосудов, изменения в его гене описаны с этой точки зрения при разных патологических процессах [9]. Таким образом, данные полиморфные локусы могут, предположительно, приводить к развитию диспластических процессов в системе нижней полой вены и, в частности, к ВБМТ.

Цель работы — выявление молекулярно-генетических предикторов высокого риска развития варикозной болезни малого таза.

Дизайн исследования. Проведено пилотное сравнительное ретроспективное исследование типа случай—контроль.

Группы исследования. 1-я группа включала пациенток репродуктивного возраста от 20 до 45 лет, c ВБМТ, верифицированной с помощью УЗИ органов малого таза и бесконтрастной магнитно-резонансной (МР) ангиографии. В эту группу вошли 20 пациенток, средний возраст 36,4 года. Критерии исключения: наличие в анамнезе тромбозов в системе нижней полой вены и/или посттромботической болезни нижних конечностей по данным ультразвукового (УЗ) дуплексного ангиосканирования; наличие острой гинекологической, гастроэнтерологической, урологической патологии; онкологические заболевания, в том числе органов малого таза; наличие в анамнезе перенесенных хирургических вмешательств на органах малого таза (не ранее 6 мес); беременность и послеродовый период (менее 6 мес) на момент включения в исследование; отказ от участия в исследовании. 2-ю (контрольную) группу — 150 женщин репродуктивного возраста от 20 до 45 лет, средний возраст 38,4 года. Критерии исключения: ВБМТ; варикозная болезнь нижних конечностей (ВБНК); наличие заболеваний и состояний, включенных в критерии исключения для основной группы. ВБМТ и ВБНК выявляли с помощью дуплексного УЗ-ангиосканирования.

Оценку наличия варикозного расширения вен малого таза, а также сопутствующей гинекологической патологии проводили на аппарате экспертного класса с использованием конвексного датчика с частотой 4—8 МГц и вагинального датчика. Исследование венозной системы нижних конечностей проводили по стандартной методике с использованием линейного датчика с частотой 7—12 МГц. УЗ-критериями ВБМТ считали эктазию венозных сплетений малого таза и/или гонадных вен более 5 мм в сочетании с ретроградным кровотоком, регистрируемым при проведении пробы Вальсальвы в режиме цветового допплеровского картирования.

Исследование брюшной полости и малого таза с захватом почечных сосудов проведено на МР-томографе с напряженностью магнитного поля 1,5 Т, применяли Т1- и Т2-взвешенные изображения и изображения с подавлением МР-сигнала от жировой ткани, бесконтрастную трехмерную МР-ангиограмму сосудов, методику количественной оценки потока Quantitative Flow (Q-Flow). Критериями ВБМТ считали наличие рефлюкса по одной или двум гонадным венам продолжительностью более 0,5 с.

Цельную венозную кровь забирали однократно из кубитальной вены, выделение ДНК для молекулярно-генетического тестирования проводили методом фенол-хлороформной экстракции по стандартной методике [10]. Для определения аллельных вариантов генов использовали аллельспецифичную полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с использованием красителя SYBR Green I для индукции флюоресценции.

Статистические методы. Частота встречаемости аллелей и генотипов определены прямым подсчетом. Оценка отклонения распределений генотипов изученных полиморфизмов ДНК от канонического распределения Харди—Вайнберга и анализ ассоциативных связей внутри генотипических сочетаний, а также оценка степени различий в частоте встречаемости аллелей, генотипов и межгенных комбинаций между исследуемыми группами проведены с помощью точного критерия Фишера. Расчет отношения шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ) и р-значения выполнен с помощью общедоступного онлайн-калькулятора.

Определили частоту полиморфных вариантов –1171dupА (5А/6А) гена MMP-3, A82G гена ММР-12 и G634C гена VEGF в основной и контрольной группах, исследовали ассоциации носительства данных полиморфизмов с риском развития ВБМТ. После проведения молекулярно-генетического тестирования частоты генотипов по редким аллелям изучаемых генов определялись прямым подсчетом в соответствии с разделением на клинические группы. Распределение аллелей всех генов соответствует равновесию Харди—Вайнберга; р>0,1. Распределение частот генотипов по полиморфным аллелям изученных генов представлено в табл. 1.

Мы провели анализ ассоциативных связей носительства аллельных вариантов генов с ОШ.

Полиморфный аллель С локуса 634 G/C гена VEGF может рассматриваться в качестве маркера повышенного риска развития ВБМТ, ОШ=5,869 (p=0,00004). Гетерозиготные носители редкого аллеля имеют риск развития варикозной трансформации в 5,611 раза (p=0,0008), а гомозиготы С/С в 16,833 раза (p=0,00021) выше, чем обладатели дикого генотипа. Для носителей редкого полиморфного аллеля С общее увеличение риска составило 4,344 раза (р=0,00001).

Статистически значимых различий в частотах встречаемости аллелей и генотипов полиморфного локуса A-82G гена ММР-12 в исследуемых группах не обнаружено. Выявлено, что носительство полиморфного аллеля 6А локуса –1171dupА (5А/6А) гена MMP-3 является фактором увеличенного риска развития ВБМТ с ОШ=2,250 (p=0,0162). Гетерозиготные носители аллеля 6А имеют риск варикозной трансформации вен таза в 2,619 раза (p=0,1458), а гомозиготы 6А/6А в 5,133 раза (p=0,0158) выше, чем обладатели дикого генотипа, однако для отдельных генотипов различия не являются статистически значимыми. Общий риск для носителей аллеля 6А составил 2,253 (р=0,0182). В табл. 2 представлены

Важно отметить, что именно значение ОШ общего риска является интегральным показателем влияния носительства полиморфного аллеля на вероятность развития заболевания, поэтому общий риск учитывается в первую очередь.

Представленное исследование является пилотным в изучении молекулярно-генетических предик-торов развития ВБМТ у женщин репродуктивного возраста. Согласно полученным предварительным результатам, полиморфные варианты генов ММР-3 и VEGF могут оказывать влияние на риск развития варикозной трансформации вен таза.

Надо отметить, что существуют указания на наличие ассоциативных связей носительства полиморфных аллелей генов ММР и высокого риска ВБНК, в частности, в качестве генов-предикторов описаны ММР-9, ММР-1, ММР-3 и некоторые другие [7—9]. Также ранее было показано увеличение риска ВБНК для редкого аллеля VEGF в популяции Западно-Сибирского региона [11. Учитывая большую частоту выявления в группе исследования таких сопутствующих заболеваний, как ВБНК и хронический геморрой, есть основания предполагать сходство патогенетических процессов варикозной трансформации как подкожных вен нижних конечностей, так и венозных сплетений малого таза и яичниковых вен. Клинические подтверждения этому можно найти в литературе, однако с использованием молекулярно-генетических технологий схожесть процессов патогенеза данных состояний продемонстрирована впервые.

Полученные в ходе изучения полиморфизмов ММР-3 и VEGF сведения о влиянии на риск ВБМТ являются предварительными и отражают результаты пилотного исследования патогенеза варикозного расширения вен в системе нижней полой вены. Выявленное увеличение риска для носителей полиморфных аллелей является основанием для проведения дальнейших исследований с целью поиска молекулярно-генетических предикторов ВБМТ. Важно отметить, что пациенткам выполнено комплексное диагностическое исследование, включающее молекулярно-генетический анализ и бесконтрастную МР-ангиографию, которая является одним из наиболее диагностически ценных и объективных методов визуализации расширения вен малого таза и оценки параметров рефлюкса по гонадным венам [12], что усиливает специфичность молекулярно-генетических методов.

Результаты получены в популяции Западно-Сибирского региона, и, вероятно, на данном начальном этапе их некорректно интерпретировать в глобальном масштабе, однако это открывает перспективы для поиска интегральных маркеров патогенетических процессов при варикозной трансформации венозной стенки различной анатомической локализации.

Выявлено, что носительство полиморфного аллеля 5A/6A гена ММР-3 и полиморфного аллеля С гена VEGF увеличивает риск развития варикозной трансформации в системе нижней полой вены с ОШ=2,253 (p=0,0182) и ОШ=4,344 (p=0,00001) соответственно. С учетом этногенетических особенностей статистически значимое влияние носительства аллельных вариантов генов ММР-3 и VEGF на риск развития ВБМТ описано нами впервые.

Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Президента Р.Ф. (№МД-5175.2016.7) в части МРТ, гранта Российского фонда фундаментальных исследований (№ 16−34−00554 мол_а) в части клинического анализа и ФАНО России по теме 0333−2016−0003 в части работ по постпроцессингу.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.И., К.С., А.А.

Сбор и обработка материала — А.А., К.С.

Статистическая обработка данных — Ю.В.

Написание текста — К.С., Ю.В.

Редактирование — К.С., В.В.