Варикозная болезнь нижних конечностей (ВБНК) — одно из наиболее распространенных заболеваний сосудов, которому подвержены более 20% взрослого населения развитых стран [1]. Помимо косметического дефекта, пациенты страдают от боли, тяжести в ногах, утомляемости, отеков, на более поздних стадиях присоединяются гиперпигментация, липодерматосклероз и трофические язвы. В настоящее время патогенез ВБНК до конца не изучен. Предполагается, что ключевыми событиями, приводящими к развитию заболевания, служат нарушение структуры и функции стенки вен и недостаточность венозных клапанов, что вызывает рефлюкс, застой крови, гипоксию и повреждение тканей. Предполагаемые механизмы, лежащие в основе этих нарушений, — оксидативный стресс, повреждение эндотелиальных клеток, нарушение баланса продукции ростовых факторов и цитокинов, пролиферация гладкомышечных клеток и их переключение с сократительного на секреторный фенотип, нарушение баланса в синтезе и деградации внеклеточного матрикса, инфильтрация лейкоцитов и воспаление [2—5]. Тем не менее последовательность событий не совсем ясна. Факторы, провоцирующие развитие этого состояния и запускающие цепь патологических изменений, — беременность, избыточная масса тела, пожилой возраст, малоподвижный образ жизни, продолжительные статические нагрузки в вертикальном положении и др. В то же время их нельзя назвать причиной развития варикозной трансформации, поскольку их действие является избирательным и заболевание развивается далеко не у каждого, кто оказывается подверженным экспозиции провоцирующего фактора. Важную роль в развитии ВБНК играет наследственность [6], но анализу того, какие именно генетические варианты влияют на риск этого заболевания, посвящено всего несколько исследований [7]. Одни и те же варианты генов могут по-разному влиять на риск заболеваний в разных этнических группах. Это связано как с генетическими особенностями популяций, так и с образом жизни (питание, привычки, занятость и т. д.), на который влияет регион проживания и особенности культуры. Среди генов, мутации которых могут оказаться связанными с риском ВБНК, можно назвать, в частности, гены AGGF1, HFE, MTHFR, MTR и FOXC2.

Ген AGGF1 кодирует фактор ангиогенеза, играющий ключевую роль в дифференцировке клеток венозной системы и обладающий противовоспалительным и ярко выраженным ангиогенным свойством [8, 9]. По данным Y. Hu и соавт. [10], полиморфные локусы rs13155212 (замена нуклеотида T на C, обозначается T>C) и rs7704267 (замена G>C), расположенные в этом гене, ассоциированы со снижением риска синдрома Клиппеля—Треноне. У 76—100% лиц с этим синдромом развивается варикозное расширение вен. Мы предположили, что носительство генотипов по этим локусам может влиять на риск ВБНК у лиц без этого синдрома.

В гене HFE закодирован белок, регулирующий абсорбцию железа. Два локуса в этом гене, rs1800562 G>A и rs1799945 C>G, ассоциированы с наследственным гемохроматозом – заболеванием, при котором железо накапливается в тканях и органах [11]. Повышенное содержание ионов железа может вызывать индукцию оксидативного стресса, повреждение эндотелия и воспаление [12]. Это может нарушить взаимодействие эндотелиальных клеток с гладкомышечными, приводя к изменениям в структуре стенок вен. Возможно, rs1800562 и rs1799945 связаны с риском развития ВБНК.

Полиморфные локусы в генах фолатного цикла MTHFR C677T и MTR A2756G влияют на уровень аминокислоты гомоцистеина в крови (первая замена приводит к увеличению уровня, вторая — к снижению) [13]. Гомоцистеин и его метаболиты, в свою очередь, вовлечены во множество процессов, приводящих в конечном счете к эндотелиальной дисфункции и повреждению сосудистой стенки [14, 15]. В том числе он влияет на экспрессию генов, важных для взаимодействия клеток эндотелия с гладкомышечными клетками [16]. Это позволяет предположить влияние указанных замен на риск изучаемой патологии.

Мутации в гене фактора транскрипции FOXC2 приводят к редкой форме лимфедемы, сопряженной с дистихиазом. Примерно у половины лиц с этим заболеванием развивается варикозное расширение вен в молодом возрасте [17]. Кроме того, мутации этого гена ассоциированы с первичной недостаточностью клапанов поверхностных и глубоких вен нижних конечностей [18]. Мы проанализировали ассоциацию шести полиморфных локусов (rs7189489 C>A, rs4633732 T>G, rs34221221 T>C, rs1035550 C>T, rs34152738 T>G и rs12711457 G>A), распложенных в регионе этого гена, а также его в 5’ и 3’областях, с риском ВБНК.

Цель нашей работы — изучение влияния полиморфных генетических локусов на риск развития ВБНК у русских, проживающих в Российской Федерации. Для анализа выбраны однонуклеотидные полиморфные замены (SNP, single nucleotide polymorphisms) в генах AGGF1, HFE, MTHFR, MTR и FOXC2.

Выборки. В нашем распоряжении находился материал для генетического исследования (кровь) 505 пациентов с ВБНК, проходивших обследование и хирургическое лечение в Городской клинической больнице № 1 им. Н.И. Пирогова (Москва), государственной Новосибирской областной клинической больнице (Новосибирск), Клинике «Medalp» (Санкт-Петербург) и Центре новых медицинских технологий (Новосибирск).

В настоящее исследование включены 474 пациента, заявивших о русской этнической принадлежности (на основе самоидентификации пациента и обоих его родителей). Выборка состояла из 146 (30,8%) мужчин и 328 (69,2%) женщин (медиана распределения по возрасту 48 лет; нижний квартиль 37 лет; верхний квартиль 57 лет). Из них 333 (70,3%) человека имели семейный анамнез ВБНК, что определяли при опросе по наличию хотя бы одного кровного родственника с ВБНК; 124 (26,2%) человека не имели семейного анамнеза; 17 (3,6%) не смогли предоставить данные об анамнезе. У 141 (29,7%) пациента выявили клинический класс C2; у 237 (50,0%)  — класс C3; у 80 (16,9%) — класс C4; у 9 (2,0%) — класс C5 и у 7 (1,5%) — класс C6.

При анализе ассоциации с ВБНК полиморфизма генов FOXC2 и AGGF1 в качестве контрольной группы была использована выборка из 478 человек русской этнической принадлежности, не имеющих хронических заболеваний вен нижних конечностей в настоящее время и в анамнезе — 147 (30,8%) мужчин и 331 (69,2%) женщина (медиана распределения по возрасту 55 лет; нижний квартиль 44 года; верхний квартиль 62 года). При исследовании ассоциаций SNP в остальных генах в качестве контрольных групп были использованы популяционные выборки этнических русских, члены которых не предоставляли информацию о наличии либо отсутствии у них ВБНК. Использование популяционных выборок не было продиктовано какими-либо специальными соображениями, а было обусловлено лишь наличием именно такого материала на данных этапах работ. В ассоциативных исследованиях оба формата — «случай — здоровый контроль» и «случай — популяционный контроль» — являются приемлемыми, и каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Преимуществом формата «случай — здоровый контроль» является бо́льшая статистическая мощность, в то время как использование популяционного контроля снижает вероятность смещенности контрольной группы по какому-либо параметру. При анализе ассоциации полиморфизма гена HFE была использована популяционная выборка из 764 человек — 237 (31,0%) мужчин и 527 (69,0%) женщин (медиана распределения по возрасту 32 года; нижний квартиль 29 лет; верхний квартиль 36 лет), при исследовании ассоциации SNP в генах MTHFR и MTR — популяционная выборка из 896 человек — 271 (30,2%) мужчина и 625 (69,8%) женщин (медиана распределения по возрасту 44 года; нижний квартиль 30 лет; верхний квартиль 54 года).

Выделение ДНК. ДНК выделяли из венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку ДНК экстракцией примесей фенол—хлороформом и осаждение ДНК этанолом.

Генотипирование. Определение генотипов проводилось с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на ДНК-амплификаторах CFX96 и CFX384 («BioRad», США). Для определения генотипов по локусам AGGF1 rs13155212, HFE rs1799945, MTHFR rs1801133, MTR rs1805087, FOXC2 rs7189489, rs4633732 и rs34152738 применяли метод ПЦР с использованием конкурирующих флюоресцентно меченных олигонуклеотидных зондов. Для определения генотипов по локусам AGGF1 rs7704267, HFE rs1800562, FOXC2 rs34221221, rs1035550 и rs12711457 использовали метод асимметричной ПЦР с добавлением флюоресцентно меченного олигонуклеотидного зонда и последующим анализом кривых плавления в режиме реального времени.

Тест-системы для определения генотипов были разработаны в лаборатории фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

Статистическая обработка. Анализ ассоциации SNP c ВБНК выполняли методом логистической регрессии. При расчете отношения шансов (ОШ), 95% доверительного интервала (95% ДИ) и уровня статистической значимости (p) вводили поправку на пол и возраст пациентов. Соответствие распределения генотипов в выборках закону Харди—Вайнберга проверяли с использованием точного теста. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Вычисления проводили при помощи статистического пакета GenABEL для языка R (version 2.15.1, http://www.r-project.org; функции glm, haplo. score и haplo. glm).

Частоты аллелей и генотипов исследуемых полиморфных локусов в группе пациентов с ВБНК и группах контроля представлены в таблице. Распределение частот генотипов по всем локусам в контрольных группах соответствовало закону Харди—Вайнберга. В группе лиц с ВБНК отклонение от равновесия Харди—Вайнберга было показано для генотипов локусов FOXC2 rs1035550 (p=0,04) и AGGF1 rs13155212 (p=0,02). Частоты аллелей, рассчитанные для русских в нашей выборке, были близки к аналогичным частотам в других европеоидных популяциях, опубликованным на сайте проекта «1000 Genomes» (http://www.1000genomes.org). По данным этого проекта, частоты аллелей по указанным локусам у европеоидов таковы: rs13155212 C — 21—29%, rs7704267 C — 31—48%, rs1800562 A — 3—5%, rs1799945 G — 11—25%, rs1801133 T — 27—47%, rs1805087 G — 14—23%, rs7189489 A — 14—23%, rs4633732 G — 16—30%, rs34221221 C — 32—44%, rs1035550 T — 5—16%, rs34152738 G — 15—23%, rs12711457 A — 37—47%.

Нами были показаны статистически значимые различия в частотах встречаемости следующих аллелей и генотипов между группами «случай» и «контроль»: HFE rs1800562 G/A (ОШ=1,80; p=0,02), HFE rs1800562 A (ОШ=1,74; p=0,02), HFE rs1800562 G/A+A/A (доминантная модель наследования, ОШ=1,79; p=0,02), FOXC2 rs7189489 C/A (ОШ=0,72; p=0,03), FOXC2 rs4633732 T/G (ОШ=1,40; p= 0,02), FOXC2 rs1035550 T/T (ОШ=3,65; p=0,03) (см. таблицу). Ни одна из ассоциаций не сохранила статистическую значимость при введении поправки Бонферрони на множественное сравнение.

Для полиморфных локусов в генах AGGF1, HFE и FOXC2, в которых мы исследовали по несколько SNP, был выполнен анализ ассоциации гаплотипов (комбинаций SNP) с риском ВБНК. Статистически значимые ассоциации были обнаружены лишь для сочетаний SNP в гене FOXC2. Гаплотип rs7189489 C-rs4633732 T-rs34221221 C-rs1035550 C-rs34152738 T-rs12711457 G чаще (3,8%) встречался в группе пациентов с ВБНК, чем в группе контроля (1,3%; p=0,01) Наиболее распространенный гаплотип rs7189489 C-rs4633732 T-rs34221221 T-rs1035550 C-rs34152738 T-rs12711457 G, напротив, реже (37,0%) встречался в группе пациентов с ВБНК, чем в контрольной группе (41,6%; p=0,049). Поскольку два вышеуказанных гаплотипа отличаются лишь наличием либо отсутствием аллеля rs34221221 C, это позволяет предположить, что данный аллель все же ассоциирован с риском ВБНК, но его эффект может быть маскирован суммарным эффектом остальных локусов региона.

В настоящей работе мы проанализировали влияние ряда полиморфных вариантов генов AGGF1, HFE, MTHFR, MTR и FOXC2 на риск развития ВБНК у русских жителей Российской Федерации и выявили ряд ассоциаций со значениями p<0,05 (см. таблицу). Тем не менее уровень значимости этих ассоциаций не был высок, и ни одна из них не выдержала введения поправки на множественное сравнение. Следует отметить, что это типичная ситуация для исследований на выборках, размер которых невелик, а сравнений при этом проводится много. С другой стороны, это не означает, что все выявленные ассоциации ложноположительны. Это означает лишь, что какие-то из них могут быть результатом случайных событий. Поэтому такие результаты, естественно, не могут пока стать основой для практических выводов, но их следует принимать во внимание в дальнейших исследовательских работах и подтверждать на выборках большего размера. В нашей работе очевидно случайными являются ассоциации, выявленные лишь для гетерозиготных генотипов (rs7189489 C/A и rs4633732 T/G), поскольку в данном случае невозможно предложить биологический механизм, объясняющий изменение риска для носителей только одного аллеля (гетерозигот), а не двух (гомозигот).

Интерес представляет ассоциация редкой полиморфной замены rs1800562 G>A в гене HFE, приводящей к замене цистеина на тирозин в положении 282 белка HFE и ведущей к аккумуляции железа в тканях пациента, с повышением риска ВБНК. В нашей работе мы выявили ассоциацию для генотипа G/A и аллеля A, ассоциация для генотипа A/A не достигла уровня статистической значимости. Тем не менее мы также провели расчет для разных моделей наследования – доминантной и рецессивной — и показали ассоциацию для доминантной модели. Доминантная модель подразумевает, что носители генотипов G/A и A/A имеют одинаково высокий риск развития ВБНК, т. е. увеличение риска не зависит от дозы аллеля A у пациента. Ранее в работе итальянских исследователей P. Zamboni и соавт. [19] была обнаружена ассоциация этого генетического варианта с риском развития трофических язв у лиц с ВБНК (было проведено сравнение частот аллелей и генотипов в группах лиц с классами C4 и C5—C6). В нашей работе мы провели аналогичный расчет, но значимой ассоциации не выявили. Вероятно, для этого нам не хватило статистической мощности, поскольку пациентов с классами C5—C6 в нашем исследовании было 16, а с классом С4 — 80.

Полиморфный локус rs1035550, расположенный в 3’ регионе гена FOXC2, в нашей работе проанализирован впервые, ранее в мире таких исследований не проводили. Ассоциация с ВБНК была нами показана только для гомозигот по редкому аллелю (генотип T/T). Возможно, замена C>T расположена в каком-либо регуляторном элементе гена, что влияет на уровень наработки белкового продукта, либо она сцеплена с каким-либо другим генетическим вариантом, имеющим такое свойство. Пока что наш результат стоит расценивать только как предварительный, и в дальнейшем было бы интересно изучить эффекты этого локуса на выборках большего размера.

Анализ сочетаний SNP (гаплотипов) в гене FOXC2 позволил предположить, что с риском ВБНК также связан локус rs34221221 T>C. Ранее влияние этого SNP на риск ВБНК было оценено S. Surendran и соавт. [20] в индийской популяции. Примечательно, что авторы выявили ассоциацию с увеличением риска для противоположного аллеля — rs34221221 T, который у индийцев является более редким, а у русских и других представителей европеоидной расы — более частым. Ими также было продемонстрировано, что этот аллель ассоциирован с повышенной продукцией белка FOXC2. По результатам 2 работ сложно сделать вывод о том, действительно ли данный вариант по-разному ведет себя в разных этнических группах. Целесообразно проанализировать ассоциацию rs34221221 с риском ВБНК на более представительной выборке русских, а также изучить его эффекты у представителей других этнических групп.

Подводя итог, необходимо отметить, что успех работ по исследованию генетики мультифакториальных заболеваний, к которым в полной мере относится варикозная болезнь, во многом зависит от того, насколько представительную и хорошо описанную выборку удалось собрать исследователям. Наша работа является попыткой изучения генетики ВБНК у русских жителей Российской Федерации. Пока что нам удалось сформировать коллекцию из 474 образцов ДНК от пациентов с данным заболеванием на базе нескольких клиник Новосибирска, Москвы и Санкт-Петербурга, но в этой выборке недостаточно представлены пациенты с трофическими осложнениями. Это накладывает ограничения на возможности анализа, снижая статистическую мощность при разделении выборки на подгруппы. Кроме того, было бы интересно выделить и другие подгруппы, например, мужчин и женщин, лиц с наличием или отсутствием семейного анамнеза и т. д. Но пока что размер выборки не позволяет нам провести более глубокий анализ.

Мы намерены продолжить работу, пополняя выборку новыми образцами, включая в анализ новые генетические локусы и используя разные аналитические подходы. В связи с этим мы приглашаем к сотрудничеству тех коллег, кому будет интересно участие в нашем исследовании и которые будут готовы помочь в наборе клинического материала для генетического анализа. Только путем коллективных усилий, объединяя материал, собранный на базе многих медицинских учреждений, мы можем добиться успеха в изучении генетики ВБНК в нашей стране.

1. Полиморфные варианты гена фактора ангиогенеза (AGGF1 rs13155212 и rs7704267) и генов фолатного цикла (MTHFR C677T и MTR A2756G) не ассоциированы с риском ВБНК.

2. С повышением риска ВБНК связана редкая полиморфная замена rs1800562 G>A в гене HFE, ведущая к аккумуляции железа в тканях пациента, а также полиморфные варианты rs1035550 C>T и rs34221221 T>C гена фактора транскрипции FOXC2.

3. Ни одна из выявленных ассоциаций не достигла статистической значимости после введения поправки на множественное сравнение. Возможно, это связано с недостаточным размером выборки.

Работа была выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 14−15−00734, тема: «Поиск генов, вовлеченных в патогенез варикозной болезни вен»).

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — М.Ф., А.Ш., И.З., А.К.

Сбор и обработка материала — А.Ш., М.С., К.С., Е.С., А.Ш., Е.С., Е.С., М.Д., О.Ш., Е.И., Е.В., И.П., И.З.

Статистическая обработка — А.Ш., Е.С.

Написание текста — А.Ш.

Редактирование — И.З., М.Ф.