Выявление полиморфных вариантов генов, ассоциированных с риском варикозной болезни нижних конечностей у русских жителей Российской Федерации

Авторы:
  • А. С. Шадрина
    Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия
  • М. А. Сметанина
    Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия
  • К. С. Севостьянова
    Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия
  • Е. А. Соколова
    Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия
  • А. И. Шевела
    Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия
  • Е. Ю. Солдатский
    Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
  • Е. И. Селиверстов
    Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
  • М. Ю. Демехова
    Клиника «Medalp», Санкт-Петербург, Россия
  • О. А. Шонов
    Клиника «Medalp», Санкт-Петербург, Россия
  • Е. А. Илюхин
    Клиника «Medalp», Санкт-Петербург, Россия
  • Е. Н. Воронина
    Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия
  • И. В. Пикалов
    Новосибирский государственный медицинский университет, Новосибирск, Россия
  • И. А. Золотухин
    Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
  • А. И. Кириенко
    Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
  • М. Л. Филипенко
    Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия
Журнал: Флебология. 2016;10(2): 68-76
Просмотрено: 603 Скачано: 181

Варикозная болезнь нижних конечностей (ВБНК) — одно из наиболее распространенных заболеваний сосудов, которому подвержены более 20% взрослого населения развитых стран [1]. Помимо косметического дефекта, пациенты страдают от боли, тяжести в ногах, утомляемости, отеков, на более поздних стадиях присоединяются гиперпигментация, липодерматосклероз и трофические язвы. В настоящее время патогенез ВБНК до конца не изучен. Предполагается, что ключевыми событиями, приводящими к развитию заболевания, служат нарушение структуры и функции стенки вен и недостаточность венозных клапанов, что вызывает рефлюкс, застой крови, гипоксию и повреждение тканей. Предполагаемые механизмы, лежащие в основе этих нарушений, — оксидативный стресс, повреждение эндотелиальных клеток, нарушение баланса продукции ростовых факторов и цитокинов, пролиферация гладкомышечных клеток и их переключение с сократительного на секреторный фенотип, нарушение баланса в синтезе и деградации внеклеточного матрикса, инфильтрация лейкоцитов и воспаление [2—5]. Тем не менее последовательность событий не совсем ясна. Факторы, провоцирующие развитие этого состояния и запускающие цепь патологических изменений, — беременность, избыточная масса тела, пожилой возраст, малоподвижный образ жизни, продолжительные статические нагрузки в вертикальном положении и др. В то же время их нельзя назвать причиной развития варикозной трансформации, поскольку их действие является избирательным и заболевание развивается далеко не у каждого, кто оказывается подверженным экспозиции провоцирующего фактора. Важную роль в развитии ВБНК играет наследственность [6], но анализу того, какие именно генетические варианты влияют на риск этого заболевания, посвящено всего несколько исследований [7]. Одни и те же варианты генов могут по-разному влиять на риск заболеваний в разных этнических группах. Это связано как с генетическими особенностями популяций, так и с образом жизни (питание, привычки, занятость и т. д.), на который влияет регион проживания и особенности культуры. Среди генов, мутации которых могут оказаться связанными с риском ВБНК, можно назвать, в частности, гены AGGF1, HFE, MTHFR, MTR и FOXC2.

Ген AGGF1 кодирует фактор ангиогенеза, играющий ключевую роль в дифференцировке клеток венозной системы и обладающий противовоспалительным и ярко выраженным ангиогенным свойством [8, 9]. По данным Y. Hu и соавт. [10], полиморфные локусы rs13155212 (замена нуклеотида T на C, обозначается T>C) и rs7704267 (замена G>C), расположенные в этом гене, ассоциированы со снижением риска синдрома Клиппеля—Треноне. У 76—100% лиц с этим синдромом развивается варикозное расширение вен. Мы предположили, что носительство генотипов по этим локусам может влиять на риск ВБНК у лиц без этого синдрома.

В гене HFE закодирован белок, регулирующий абсорбцию железа. Два локуса в этом гене, rs1800562 G>A и rs1799945 C>G, ассоциированы с наследственным гемохроматозом – заболеванием, при котором железо накапливается в тканях и органах [11]. Повышенное содержание ионов железа может вызывать индукцию оксидативного стресса, повреждение эндотелия и воспаление [12]. Это может нарушить взаимодействие эндотелиальных клеток с гладкомышечными, приводя к изменениям в структуре стенок вен. Возможно, rs1800562 и rs1799945 связаны с риском развития ВБНК.

Полиморфные локусы в генах фолатного цикла MTHFR C677T и MTR A2756G влияют на уровень аминокислоты гомоцистеина в крови (первая замена приводит к увеличению уровня, вторая — к снижению) [13]. Гомоцистеин и его метаболиты, в свою очередь, вовлечены во множество процессов, приводящих в конечном счете к эндотелиальной дисфункции и повреждению сосудистой стенки [14, 15]. В том числе он влияет на экспрессию генов, важных для взаимодействия клеток эндотелия с гладкомышечными клетками [16]. Это позволяет предположить влияние указанных замен на риск изучаемой патологии.

Мутации в гене фактора транскрипции FOXC2 приводят к редкой форме лимфедемы, сопряженной с дистихиазом. Примерно у половины лиц с этим заболеванием развивается варикозное расширение вен в молодом возрасте [17]. Кроме того, мутации этого гена ассоциированы с первичной недостаточностью клапанов поверхностных и глубоких вен нижних конечностей [18]. Мы проанализировали ассоциацию шести полиморфных локусов (rs7189489 C>A, rs4633732 T>G, rs34221221 T>C, rs1035550 C>T, rs34152738 T>G и rs12711457 G>A), распложенных в регионе этого гена, а также его в 5’ и 3’областях, с риском ВБНК.

Цель нашей работы — изучение влияния полиморфных генетических локусов на риск развития ВБНК у русских, проживающих в Российской Федерации. Для анализа выбраны однонуклеотидные полиморфные замены (SNP, single nucleotide polymorphisms) в генах AGGF1, HFE, MTHFR, MTR и FOXC2.

Выборки. В нашем распоряжении находился материал для генетического исследования (кровь) 505 пациентов с ВБНК, проходивших обследование и хирургическое лечение в Городской клинической больнице № 1 им. Н.И. Пирогова (Москва), государственной Новосибирской областной клинической больнице (Новосибирск), Клинике «Medalp» (Санкт-Петербург) и Центре новых медицинских технологий (Новосибирск).

В настоящее исследование включены 474 пациента, заявивших о русской этнической принадлежности (на основе самоидентификации пациента и обоих его родителей). Выборка состояла из 146 (30,8%) мужчин и 328 (69,2%) женщин (медиана распределения по возрасту 48 лет; нижний квартиль 37 лет; верхний квартиль 57 лет). Из них 333 (70,3%) человека имели семейный анамнез ВБНК, что определяли при опросе по наличию хотя бы одного кровного родственника с ВБНК; 124 (26,2%) человека не имели семейного анамнеза; 17 (3,6%) не смогли предоставить данные об анамнезе. У 141 (29,7%) пациента выявили клинический класс C2; у 237 (50,0%)  — класс C3; у 80 (16,9%) — класс C4; у 9 (2,0%) — класс C5 и у 7 (1,5%) — класс C6.

При анализе ассоциации с ВБНК полиморфизма генов FOXC2 и AGGF1 в качестве контрольной группы была использована выборка из 478 человек русской этнической принадлежности, не имеющих хронических заболеваний вен нижних конечностей в настоящее время и в анамнезе — 147 (30,8%) мужчин и 331 (69,2%) женщина (медиана распределения по возрасту 55 лет; нижний квартиль 44 года; верхний квартиль 62 года). При исследовании ассоциаций SNP в остальных генах в качестве контрольных групп были использованы популяционные выборки этнических русских, члены которых не предоставляли информацию о наличии либо отсутствии у них ВБНК. Использование популяционных выборок не было продиктовано какими-либо специальными соображениями, а было обусловлено лишь наличием именно такого материала на данных этапах работ. В ассоциативных исследованиях оба формата — «случай — здоровый контроль» и «случай — популяционный контроль» — являются приемлемыми, и каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Преимуществом формата «случай — здоровый контроль» является бо́льшая статистическая мощность, в то время как использование популяционного контроля снижает вероятность смещенности контрольной группы по какому-либо параметру. При анализе ассоциации полиморфизма гена HFE была использована популяционная выборка из 764 человек — 237 (31,0%) мужчин и 527 (69,0%) женщин (медиана распределения по возрасту 32 года; нижний квартиль 29 лет; верхний квартиль 36 лет), при исследовании ассоциации SNP в генах MTHFR и MTR — популяционная выборка из 896 человек — 271 (30,2%) мужчина и 625 (69,8%) женщин (медиана распределения по возрасту 44 года; нижний квартиль 30 лет; верхний квартиль 54 года).

Выделение ДНК. ДНК выделяли из венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку ДНК экстракцией примесей фенол—хлороформом и осаждение ДНК этанолом.

Генотипирование. Определение генотипов проводилось с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на ДНК-амплификаторах CFX96 и CFX384 («BioRad», США). Для определения генотипов по локусам AGGF1 rs13155212, HFE rs1799945, MTHFR rs1801133, MTR rs1805087, FOXC2 rs7189489, rs4633732 и rs34152738 применяли метод ПЦР с использованием конкурирующих флюоресцентно меченных олигонуклеотидных зондов. Для определения генотипов по локусам AGGF1 rs7704267, HFE rs1800562, FOXC2 rs34221221, rs1035550 и rs12711457 использовали метод асимметричной ПЦР с добавлением флюоресцентно меченного олигонуклеотидного зонда и последующим анализом кривых плавления в режиме реального времени.

Тест-системы для определения генотипов были разработаны в лаборатории фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

Статистическая обработка. Анализ ассоциации SNP c ВБНК выполняли методом логистической регрессии. При расчете отношения шансов (ОШ), 95% доверительного интервала (95% ДИ) и уровня статистической значимости (p) вводили поправку на пол и возраст пациентов. Соответствие распределения генотипов в выборках закону Харди—Вайнберга проверяли с использованием точного теста. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Вычисления проводили при помощи статистического пакета GenABEL для языка R (version 2.15.1, http://www.r-project.org; функции glm, haplo. score и haplo. glm).

Частоты аллелей и генотипов исследуемых полиморфных локусов в группе пациентов с ВБНК и группах контроля представлены в таблице. Распределение частот генотипов по всем локусам в контрольных группах соответствовало закону Харди—Вайнберга. В группе лиц с ВБНК отклонение от равновесия Харди—Вайнберга было показано для генотипов локусов FOXC2 rs1035550 (p=0,04) и AGGF1 rs13155212 (p=0,02). Частоты аллелей, рассчитанные для русских в нашей выборке, были близки к аналогичным частотам в других европеоидных популяциях, опубликованным на сайте проекта «1000 Genomes» (http://www.1000genomes.org). По данным этого проекта, частоты аллелей по указанным локусам у европеоидов таковы: rs13155212 C — 21—29%, rs7704267 C — 31—48%, rs1800562 A — 3—5%, rs1799945 G — 11—25%, rs1801133 T — 27—47%, rs1805087 G — 14—23%, rs7189489 A — 14—23%, rs4633732 G — 16—30%, rs34221221 C — 32—44%, rs1035550 T — 5—16%, rs34152738 G — 15—23%, rs12711457 A — 37—47%.

Анализ ассоциации SNP c ВБНК Примечание. При вычислении значений ОШ, 95% ДИ и p была введена поправка на пол и возраст пациентов. p<0,05 выделено жирным шрифтом. * — уровень статистической значимости отклонения от равновесия Харди—Вайнберга в группе пациентов с ВБНК; ** — уровень статистической значимости отклонения от равновесия Харди—Вайнберга в контрольной группе.

Нами были показаны статистически значимые различия в частотах встречаемости следующих аллелей и генотипов между группами «случай» и «контроль»: HFE rs1800562 G/A (ОШ=1,80; p=0,02), HFE rs1800562 A (ОШ=1,74; p=0,02), HFE rs1800562 G/A+A/A (доминантная модель наследования, ОШ=1,79; p=0,02), FOXC2 rs7189489 C/A (ОШ=0,72; p=0,03), FOXC2 rs4633732 T/G (ОШ=1,40; p= 0,02), FOXC2 rs1035550 T/T (ОШ=3,65; p=0,03) (см. таблицу). Ни одна из ассоциаций не сохранила статистическую значимость при введении поправки Бонферрони на множественное сравнение.

Для полиморфных локусов в генах AGGF1, HFE и FOXC2, в которых мы исследовали по несколько SNP, был выполнен анализ ассоциации гаплотипов (комбинаций SNP) с риском ВБНК. Статистически значимые ассоциации были обнаружены лишь для сочетаний SNP в гене FOXC2. Гаплотип rs7189489 C-rs4633732 T-rs34221221 C-rs1035550 C-rs34152738 T-rs12711457 G чаще (3,8%) встречался в группе пациентов с ВБНК, чем в группе контроля (1,3%; p=0,01) Наиболее распространенный гаплотип rs7189489 C-rs4633732 T-rs34221221 T-rs1035550 C-rs34152738 T-rs12711457 G, напротив, реже (37,0%) встречался в группе пациентов с ВБНК, чем в контрольной группе (41,6%; p=0,049). Поскольку два вышеуказанных гаплотипа отличаются лишь наличием либо отсутствием аллеля rs34221221 C, это позволяет предположить, что данный аллель все же ассоциирован с риском ВБНК, но его эффект может быть маскирован суммарным эффектом остальных локусов региона.

В настоящей работе мы проанализировали влияние ряда полиморфных вариантов генов AGGF1, HFE, MTHFR, MTR и FOXC2 на риск развития ВБНК у русских жителей Российской Федерации и выявили ряд ассоциаций со значениями p<0,05 (см. таблицу). Тем не менее уровень значимости этих ассоциаций не был высок, и ни одна из них не выдержала введения поправки на множественное сравнение. Следует отметить, что это типичная ситуация для исследований на выборках, размер которых невелик, а сравнений при этом проводится много. С другой стороны, это не означает, что все выявленные ассоциации ложноположительны. Это означает лишь, что какие-то из них могут быть результатом случайных событий. Поэтому такие результаты, естественно, не могут пока стать основой для практических выводов, но их следует принимать во внимание в дальнейших исследовательских работах и подтверждать на выборках большего размера. В нашей работе очевидно случайными являются ассоциации, выявленные лишь для гетерозиготных генотипов (rs7189489 C/A и rs4633732 T/G), поскольку в данном случае невозможно предложить биологический механизм, объясняющий изменение риска для носителей только одного аллеля (гетерозигот), а не двух (гомозигот).

Интерес представляет ассоциация редкой полиморфной замены rs1800562 G>A в гене HFE, приводящей к замене цистеина на тирозин в положении 282 белка HFE и ведущей к аккумуляции железа в тканях пациента, с повышением риска ВБНК. В нашей работе мы выявили ассоциацию для генотипа G/A и аллеля A, ассоциация для генотипа A/A не достигла уровня статистической значимости. Тем не менее мы также провели расчет для разных моделей наследования – доминантной и рецессивной — и показали ассоциацию для доминантной модели. Доминантная модель подразумевает, что носители генотипов G/A и A/A имеют одинаково высокий риск развития ВБНК, т. е. увеличение риска не зависит от дозы аллеля A у пациента. Ранее в работе итальянских исследователей P. Zamboni и соавт. [19] была обнаружена ассоциация этого генетического варианта с риском развития трофических язв у лиц с ВБНК (было проведено сравнение частот аллелей и генотипов в группах лиц с классами C4 и C5—C6). В нашей работе мы провели аналогичный расчет, но значимой ассоциации не выявили. Вероятно, для этого нам не хватило статистической мощности, поскольку пациентов с классами C5—C6 в нашем исследовании было 16, а с классом С4 — 80.

Полиморфный локус rs1035550, расположенный в 3’ регионе гена FOXC2, в нашей работе проанализирован впервые, ранее в мире таких исследований не проводили. Ассоциация с ВБНК была нами показана только для гомозигот по редкому аллелю (генотип T/T). Возможно, замена C>T расположена в каком-либо регуляторном элементе гена, что влияет на уровень наработки белкового продукта, либо она сцеплена с каким-либо другим генетическим вариантом, имеющим такое свойство. Пока что наш результат стоит расценивать только как предварительный, и в дальнейшем было бы интересно изучить эффекты этого локуса на выборках большего размера.

Анализ сочетаний SNP (гаплотипов) в гене FOXC2 позволил предположить, что с риском ВБНК также связан локус rs34221221 T>C. Ранее влияние этого SNP на риск ВБНК было оценено S. Surendran и соавт. [20] в индийской популяции. Примечательно, что авторы выявили ассоциацию с увеличением риска для противоположного аллеля — rs34221221 T, который у индийцев является более редким, а у русских и других представителей европеоидной расы — более частым. Ими также было продемонстрировано, что этот аллель ассоциирован с повышенной продукцией белка FOXC2. По результатам 2 работ сложно сделать вывод о том, действительно ли данный вариант по-разному ведет себя в разных этнических группах. Целесообразно проанализировать ассоциацию rs34221221 с риском ВБНК на более представительной выборке русских, а также изучить его эффекты у представителей других этнических групп.

Подводя итог, необходимо отметить, что успех работ по исследованию генетики мультифакториальных заболеваний, к которым в полной мере относится варикозная болезнь, во многом зависит от того, насколько представительную и хорошо описанную выборку удалось собрать исследователям. Наша работа является попыткой изучения генетики ВБНК у русских жителей Российской Федерации. Пока что нам удалось сформировать коллекцию из 474 образцов ДНК от пациентов с данным заболеванием на базе нескольких клиник Новосибирска, Москвы и Санкт-Петербурга, но в этой выборке недостаточно представлены пациенты с трофическими осложнениями. Это накладывает ограничения на возможности анализа, снижая статистическую мощность при разделении выборки на подгруппы. Кроме того, было бы интересно выделить и другие подгруппы, например, мужчин и женщин, лиц с наличием или отсутствием семейного анамнеза и т. д. Но пока что размер выборки не позволяет нам провести более глубокий анализ.

Мы намерены продолжить работу, пополняя выборку новыми образцами, включая в анализ новые генетические локусы и используя разные аналитические подходы. В связи с этим мы приглашаем к сотрудничеству тех коллег, кому будет интересно участие в нашем исследовании и которые будут готовы помочь в наборе клинического материала для генетического анализа. Только путем коллективных усилий, объединяя материал, собранный на базе многих медицинских учреждений, мы можем добиться успеха в изучении генетики ВБНК в нашей стране.

1. Полиморфные варианты гена фактора ангиогенеза (AGGF1 rs13155212 и rs7704267) и генов фолатного цикла (MTHFR C677T и MTR A2756G) не ассоциированы с риском ВБНК.

2. С повышением риска ВБНК связана редкая полиморфная замена rs1800562 G>A в гене HFE, ведущая к аккумуляции железа в тканях пациента, а также полиморфные варианты rs1035550 C>T и rs34221221 T>C гена фактора транскрипции FOXC2.

3. Ни одна из выявленных ассоциаций не достигла статистической значимости после введения поправки на множественное сравнение. Возможно, это связано с недостаточным размером выборки.

Работа была выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 14−15−00734, тема: «Поиск генов, вовлеченных в патогенез варикозной болезни вен»).

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — М.Ф., А.Ш., И.З., А.К.

Сбор и обработка материала — А.Ш., М.С., К.С., Е.С., А.Ш., Е.С., Е.С., М.Д., О.Ш., Е.И., Е.В., И.П., И.З.

Статистическая обработка — А.Ш., Е.С.

Написание текста — А.Ш.

Редактирование — И.З., М.Ф.

Список литературы:

  1. Beebe-Dimmer JL, Pfeifer JR, Engle JS, Schottenfeld D. The epidemiology of chronic venous insufficiency and varicose veins. Annals of Epidemiology. 2005;15(3):175-184. doi: 10.1016/j.annepidem.2004.05.015.
  2. Lim CS, Davies AH. Pathogenesis of primary varicose veins. The British journal of surgery. 2009;96(11):1231-1242. doi: 10.1002/bjs.6798.
  3. Pfisterer L, König G, Hecker M, Korff T. Pathogenesis of varicose veins  — lessons from biomechanics. VASA. Zeitschrift für Gefässkrankheiten. 2014;43(2):88-99. doi: 10.1024/0301-1526/a000335.
  4. Raffetto JD, Khalil RA. Mechanisms of varicose vein formation: valve dysfunction and wall dilation. Phlebology. 2008;23(2):85-98. doi: 10.1258/phleb.2007.007027.
  5. Segiet OA, Brzozowa M, Piecuch A, Dudek D, Reichman-Warmusz E, Wojnicz R. Biomolecular mechanisms in varicose veins development. Annals of vascular surgery. 2015;29(2):377-384. doi: 10.1016/j.avsg.2014.10.009.
  6. Krysa J, Jones GT, van Rij AM. Evidence for a genetic role in varicose veins and chronic venous insufficiency. Phlebology. 2012;27(7):329-335. doi: 10.1258/phleb.2011.011030.
  7. Bharath V, Kahn SR, Lazo-Langner A. Genetic polymorphisms of vein wall remodeling in chronic venous disease: a narrative and systematic review. Blood. 2014;124(8):1242-1250. doi: 10.1182/blood-2014-03-558478.
  8. Fan C, Ouyang P, Timur AA, He P, You SA, Hu Y, Ke T, Driscoll D J, Chen Q, Wang QK. Novel roles of GATA1 in regulation of angiogenic factor AGGF1 and endothelial cell function. The Journal of biological chemistry. 2009;284(35):23331-23343. doi: 10.1074/jbc.M109.036079.
  9. Chen D, Li L, Tu X, Yin Z, Wang Q. Functional characterization of Klippel—Trenaunay syndrome gene AGGF1 identifies a novel angiogenic signaling pathway for specification of vein differentiation and angiogene­sis during embryogenesis. Human Molecular Genetics. 2013;22(5):963-976. doi: 10.1093/hmg/dds501.
  10. Hu Y, Li L, Seidelmann SB, Timur AA, Shen PH, Driscoll DJ, Wang QK. Identification of association of common AGGF1 variants with susceptibility for Klippel—Trenaunay syndrome using the structure association program. Annals of human genetics. 2008;72(Pt 5):636-643. doi: 10.1111/j.1469-1809.2008.00458.x.
  11. Feder JN, Gnirke A, Thomas W, Tsuchihashi Z, Ruddy DA, Basava A, Dormishian F, Domingo R, Ellis MC, Fullan A, Hinton LM, Jones NL, Kimmel BE, Kronmal GS, Lauer P, Lee VK, Loeb DB, Mapa FA, McClelland E, Meyer NC, Mintier GA, Moeller N, Moore T, Morikang E, Prass CE, Quintana L, Starnes SM, Schatzman RC, Brunke KJ, Drayna DT, Risch NJ, Bacon BR, Wolff RK. A novel MHC class I-like gene is mutated in patients with hereditary haemochromatosis. Nature genetics. 1996;13(4):399-408. doi: 10.1038/ng0896-399.
  12. Kartikasari AE, Georgiou NA, Visseren FL, van Kats-Renauld H, van Asbeck BS, Marx JJ. Endothelial activation and induction of monocyte adhesion by nontransferrin-bound iron present in human sera. FASEB journal. 2005;20(2):353-355. doi: 10.1096/fj.05-4700fje.
  13. Fredriksen A, Meyer K, Ueland PM, Vollset SE, Grotmol T, Schneede J. Large-scale population-based metabolic phenotyping of thirteen genetic polymorphisms related to one-carbon metabolism. Human mutation. 2007;28(9):856-865. doi: 10.1002/humu.20522.
  14. Austin RC, Lentz SR, Werstuck GH. Role of hyperhomocysteinemia in endothelial dysfunction and atherothrombotic disease. Cell death and differentiation. 2004;11(suppl1):S56-S64. doi: 10.1038/sj.cdd.4401451.
  15. Wu S, Gao X, Yang S, Meng M, Yang X, Ge B. The role of endoplasmic reticulum stress in endothelial dysfunction induced by homocysteine thiolactone. Fundamental & clinical pharmacology. 2015;29(3):252-259. doi: 10.1111/fcp.12101.
  16. Zhang D, Chen Y, Xie X, Liu J, Wang Q, Kong W, Zhu Y. Homocysteine activates vascular smooth muscle cells by DNA demethylation of platelet-derived growth factor in endothelial cells. Journal of molecular and cellular cardiology. 2012;53(4):487-496. doi: 10.1016/j.yjmcc.2012.07.010.
  17. Brice G, Mansour S, Bell R, Collin JR, Child AH, Brady AF, Sarfarazi M, Burnand KG, Jeffery S, Mortimer P, Murday VA. Analysis of the phenotypic abnormalities in lymphoedema-distichiasis syndrome in 74 patients with FOXC2 mutations or linkage to 16q24. Journal of medical genetics. 2002;39(7):478-483. doi: 10.1136/jmg.39.7.478.
  18. Mellor RH, Brice G, Stanton AW, French J, Smith A, Jeffery S, Levick JR, Burnand KG, Mortimer PS. Mutations in FOXC2 are strongly associated with primary valve failure in veins of the lower limb. Circulation. 2007;115(14):1912-1920. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.106.675348.
  19. Zamboni P, Tognazzo S, Izzo M, Pancaldi F, Scapoli GL, Liboni A, Gemmati D. Hemochromatosis C282Y gene mutation increases the risk of venous leg ulceration. Journal of vascular surgery. 2005;42(2):309-314. doi: 10.1016/j.jvs.2005.04.003.
  20. Surendran S, Girijamma A, Nair R, Ramegowda KS, Nair DH, Thulaseedharan JV, Lakkappa RB, Kamalapurkar G, Kartha CC. Forkhead box C2 promoter variant c.512C>T is associated with increased susceptibility to chronic venous diseases. PLoS One. 2014;9(3):e90682. doi:10.1371/journal.pone.0090682.