Обзор литературы

Повышенная кишечная проницаемость в развитии как органических, так и функциональных заболеваний пищеварительного тракта — один из наиболее активно изучаемых феноменов в гастроэнтерологии. С позиций молекулярной биологии проводится оценка эпителиального барьера кишечника, а также выполняется критический анализ диагностических тестов, позволяющих наиболее информативно выяснить резистентность слизистой оболочки пищеварительного тракта.

Мукозальный барьер кишечника представляет собой многокомпонентную динамическую структуру, отделяющую внутреннюю среду организма от просветного содержимого. Все составляющие барьера условно можно разделить на три уровня — преэпителиальный, эпителиальный и субэпителиальный [1]. Первым механическим препятствием для прямого контакта агрессивных внутрипросветных факторов с эпителием служит слой слизи, толщина которого увеличивается по направлению от тонкой кишки к толстой. Самым распространенным белком слизи в кишечнике является муцин MUC2, предотвращающий адгезию бактерий к эпителию [2]. Активное выделение слизи стимулируют простагландин E2, ацетилхолин, гистамин, пептид тирозин-тирозин (пептид YY) и серотонин [3]. Под слоем слизи расположен кишечный эпителий, который представлен различными видами клеток: эпителиоцитами, бокаловидными клетками, клетками Панета и энтероэндокринными клетками. Эпителиальные клетки связаны друг с другом многокомпонентными соединительными комплексами, состоящими из плотных контактов, адгезионных контактов и десмосом. Субэпителиальный уровень кишечного барьера представлен собственной пластинкой слизистой оболочки, где сосредоточены иммунокомпетентные клетки, секретирующие IgA, цитокины, хемокины, протеазы. Кроме того, здесь расположено подслизистое сплетение энтеральной нервной системы, которое при воздействии на него серотонина, гистамина, эндогенных каннабиноидов участвует в регуляции секреции и моторики кишечника [4].

Цель представленной публикации — систематизация данных о диагностических тестах для оценки повышенной кишечной проницаемости, а также собственный опыт оценки содержания зонулина в кале у пациентов с различными вариантами течения синдрома раздраженного кишечника (СРК).

Модуляция кишечной проницаемости является частью физиологического механизма поддержания гомеостаза. Высказываются предположения, что повышение кишечной проницаемости связано с вероятностью бактериальной транслокации, которая в свою очередь может привести к стимуляции клеток врожденного и приобретенного иммунитета и инициировать воспаление в слизистой оболочке [5—7]. Огромное количество доклинических и клинических исследований продемонстрировало, что нарушение функции эпителиального кишечного барьера участвует в патогенезе многих хронических заболеваний как органической, так и функциональной природы [1, 4, 8]. В частности, появляется все больше доказательств того, что феномен повышенной кишечной проницаемости выступает в качестве одного из ключевых механизмов расстройства взаимодействия по оси «кишечник—мозг» при СРК, представляющем собой серьезную проблему для здравоохранения всех стран мира [1, 8—10].

Одним из доказательств этому является высокая частота развития СРК на фоне перенесенного гастроэнтерита [11, 12]. Впервые повышение проницаемости кишечного барьера при СРК после острой кишечной инфекции, вызванной Campylobacter, описали R. Spiller и соавт. еще в 2000 г. [12]. Однако до сих пор патофизиологические механизмы, ведущие к нарушению кишечной проницаемости при СРК, не ясны. Показано, что кишечная проницаемость изменяется в ответ на стресс — хорошо известный фактор, провоцирующий развитие клинических симптомов при СРК [13—15]. Так, в работе T. Vanuytsel и соавт. продемонстрировано, что у здоровых добровольцев публичное выступление в незнакомой аудитории сопровождалось повышением кишечной проницаемости в той же степени, как и прием нестероидного противовоспалительного препарата индометацина [13]. Существует мнение о том, что нарушение функции кишечного барьера на фоне стресса также опосредовано изменением состава кишечной микробиоты. К примеру, длительный физический стресс в виде 4-дневного катания на лыжах у молодых людей сопровождался увеличением представительства Bacteroides и повышением кишечной проницаемости [14].

Установлено, что повышенная кишечная проницаемость при СРК ассоциирована с висцеральной гиперчувствительностью и тяжестью течения заболевания. Кроме того, согласно имеющимся данным, пациенты с СРК с преобладанием диареи (СРК-Д) имеют более выраженное нарушение эпителиального кишечного барьера, чем пациенты с другими подтипами СРК [9]. И эти различия сохраняются даже после корректировки на другие возможные факторы, такие как пол, индекс массы тела, стаж курения и прием лекарственных препаратов [16]. J. Li и соавт. продемонстрировали, что 47% больных СРК-Д с повышенной кишечной проницаемостью, как правило, имеют более серьезные психологические нарушения и низкий показатель качества жизни [17].

Интересным с клинической точки зрения представляется вопрос о методах оценки кишечной проницаемости. Одним из методов выявления повышенной кишечной проницаемости является определение экспрессии белков плотных контактов при иммуногистохимическом или иммунофлюоресцентном исследовании биоптатов слизистой оболочки кишечника. У пациентов, страдающих СРК-Д, повышение кишечной проницаемости ассоциировано с увеличением экспрессии в подвздошной кишке клаудина-2, регулирующего парацеллюлярный транспорт ионов и воды [18]. Еще одним морфологическим признаком повышенной кишечной проницаемости при СРК-Д является расширение промежутков между эпителиоцитами по данным электронной микроскопии [19]. Зондовая конфокальная лазерная эндомикроскопия во время рутинного эндоскопического исследования позволяет быстро, без взятия биоптата, в режиме реального времени оценить нарушение целостности кишечного эпителия по затекам внутривенно введенного флуоресцеина в просвет кишки. В работе A. Fritscher-Ravens и соавт. показано, что у пациентов с СРК и подозрением на пищевую непереносимость в течение 5 мин после воздействия растворенных антигенов-кандидатов непосредственно на слизистую оболочку двенадцатиперстной кишки происходит расширение межворсинчатых промежутков, а также увеличение количества интраэпителиальных лимфоцитов, и эти изменения связаны с выраженностью клинических симптомов [20]. Безусловно, использование указанных выше методов лимитировано, прежде всего, их инвазивностью и дороговизной.

Среди других способов диагностики повышенной кишечной проницаемости ex vivo используется определение трансэпителиальной резистентности и трансмукозального макромолекулярного потока на образцах слизистой оболочки кишечника в камере Уссинга. Однако, как оказалось, между показателями кишечной проницаемости, измеренной in vivo и in vitro, существуют различия, что может отражать наличие дополнительных функциональных барьеров (собственная пластинка слизистой оболочки, нейроны энтеральной нервной системы, концевые капилляры), которые также препятствуют прохождению молекул в кровоток в организме и исключены в экспериментальных исследованиях. Кроме того, известно, что межэпителиальные плотные контакты находятся под нейрогуморальным контролем вазоинтестинальных и холинергических нейронов подслизистого нервного сплетения, и это взаимодействие теряется в биопсийном материале [21].

Чаще всего проницаемость кишечного барьера измеряется косвенно по экскреции с мочой веществ, которые после их приема внутрь попадают из кишечника в кровоток параклеточным путем, затем фильтруются клубочками почек и выводятся в неизмененном виде без активной реабсорбции [22]. К таким веществам относятся сахара, меченная радиоактивным 51-хромом этилендиаминтетрауксусная кислота (51Cr-EDTA) и полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Известно, что в зависимости от размеров молекул и скорости метаболизма моно-, ди- и олигосахариды по-разному абсорбируются в кишечнике человека. К примеру, сахароза быстро расщепляется до глюкозы и фруктозы и, следовательно, в лучшем случае может дать информацию о проницаемости желудка. В отношении кишечной проницаемости большей диагностической ценностью обладают те сахара, которые не подвергаются воздействию пищеварительных ферментов человека, в частности маннитол, лактулоза и сукралоза. В клинической практике тесты с применением маннитола и лактулозы или маннитола, лактулозы и сукралозы получили название «двойного» и «тройного сахарного теста» соответственно. При этом «двойной сахарный тест» отражает лишь проницаемость эпителия тонкой кишки, о толстокишечной проницаемости позволяет судить «тройной сахарный тест» с сукралозой, которая в отличие от маннитола или лактулозы не ферментируется бактериями толстой кишки [12]. Предполагается, что более крупные молекулы дисахаридов лактулозы и сукралозы могут пересекать кишечный барьер только в местах его повреждения, поэтому считаются своего рода маркерами целостности эпителия, тогда как малый размер молекулы маннитола позволяет моносахариду диффундировать через эпителий трансцеллюлярно. Показано, что доля сахаров, которая всасывается в кишечнике здоровых детей в течение 1 ч после перорального приема, составляет 2% для маннитола и 0,07% для лактулозы [23]. При этом за 24 ч у здорового взрослого человека экскретируется 31,2±3,4% перорально принятого маннитола и 0,32±0,03% лактулозы [24]. Интерпретация результатов основывается на оценке содержания сахаров в суточной моче при помощи метода высокоэффективной жидкостной хроматографии масс-спектрометрии. Увеличение соотношения экскреции сахаров в пользу лактулозы или сукралозы свидетельствует о повышении проницаемости тонкой или толстой кишки соответственно. Установлено, что среди пациентов с СРК-Д отмечается более высокое соотношение лактулоза/маннитол, по сравнению с контрольной группой [16]. При этом повышенная проницаемость тонкой кишки коррелирует с уровнем провоспалительных цитокинов в сыворотке крови, интенсивностью абдоминальной боли и более низким показателем качества жизни [25].

Необходимо отметить, что, несмотря на свою неинвазивность, данные тесты редко применяются на практике, поскольку технически сложны для выполнения, при этом сама процедура исследования не стандартизована и все еще имеет низкую валидность из-за неопределенных оптимальных значений показателей.

51Cr-EDTA и ПЭГ не метаболизируются в организме человека ни пищеварительными ферментами, ни бактериями и теоретически могут отражать проницаемость слизистой оболочки на всем протяжении кишечника. Однако использование 51Cr-EDTA ограничено его радиоактивностью, а ПЭГ — низкой специфичностью вследствие широкой распространенности вещества в окружающей среде, что затрудняет оценку его поступления в организм [1, 26]. К примеру, ПЭГ входит в состав зубных паст, кремов, дезодорантов, шампуней и средств бытовой химии, а также является слабительным препаратом.

В настоящее время перспективным представляется определение неинвазивных биомаркеров повышенной кишечной проницаемости. В качестве потенциальных кандидатов активно изучаются белок, связывающий жирные кислоты (I-FABP), диаминоксидаза (DAO) и зонулин [26, 27]. I-FABP представляет собой цитозольный белок массой 15 кДа, расположенный на ворсинках зрелых энтероцитов, который играет роль в клеточном поглощении и метаболизме жирных кислот [28]. В физиологических условиях циркулирующий в кровотоке уровень I-FABP крайне низкий, его количество значительно возрастает в ответ на повреждение целостности клеточной мембраны эпителия тонкой кишки. В ряде исследований показано, что повышение концентрации I-FABP в сыворотке крови или моче ассоциировано с нарушением кишечной проницаемости и может быть маркером ранней диагностики воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), ишемического колита и целиакии [29, 30]. Имеются также сведения о более высоком уровне I-FABP у пациентов с постинфекционным вариантом СРК по сравнению со здоровыми лицами [31]. При этом отмечается статистически значимая положительная корреляция между сывороточным содержанием I-FABP и степенью кишечной проницаемости по данным «двойного сахарного теста».

DAO — внутриклеточный фермент аминоксидаза, который катализирует окислительное дезаминирование первичных аминов с образованием соответствующих альдегидов, аммиака и пероксида водорода. Данный фермент также экспрессируется на верхушке ворсинок энтероцитов млекопитающих, и его активность увеличивается от двенадцатиперстной к подвздошной кишке [9]. Выдвигается мнение, что DAO может рассматриваться как индикатор целостности слизистой оболочки тонкой кишки и кишечной проницаемости при различных заболеваниях и патологических состояниях — синдроме мальабсорбции, целиакии и ВЗК [32]. Работы, изучающие содержание DAO при СРК, малочисленны, и их результаты достаточно противоречивы. В некоторых сообщается о более высоком уровне DAO в сыворотке крови пациентов с СРК-Д [33]. В других различия между группами СРК-Д и здоровыми лицами не выявлены, а обнаруживались лишь после разделения пациентов с СРК-Д на подгруппы в зависимости от степени повышения кишечной проницаемости, что подчеркивает разнородность больных СРК даже в пределах одной группы [9].

Зонулин является представителем семейства родственных белков гаптоглобинов и единственным известным сегодня физиологическим модулятором, который может обратимо открывать плотные контакты. Гаптоглобины произошли из ассоциированного с комплементом белка маннозо-связывающей-лектин-ассоциированной сериновой протеазы (MAPS), потерявшего в процессе эволюции свою функцию протеазы вследствие мутаций в каталитическом домене, чтобы приобрести новые функции, включая способность регулировать плотные контакты [34]. Высвобождение зонулина на апикальной части эпителиальных клеток кишечника происходит под действием разнообразных внутрипросветных факторов, таких как пищевые антигены и бактериальные токсины. Зонулин изменяет межклеточную целостность тонкой кишки, регулируя синтез эпидермального фактора роста посредством активируемого протеиназой рецептора 2 (PAR2) [8]. Кроме того, он может запускать каскад биохимических реакций, вызывающих разрушение плотных контактов и последующее повышение кишечной проницаемости эпителия толстой кишки [35].

Показано, что активация зонулинового пути, регулирующего проницаемость эпителиального кишечного барьера, участвует в развитии целого ряда аутоиммунных и метаболических заболеваний. В качестве «модельного» расстройства для описания эффектов зонулина обычно рассматривается целиакия, где его роль в патогенезе доказана и хорошо изучена [34, 36]. Неперевариваемые фрагменты глютена способны связывать хемокиновый рецептор CXCR3 и стимулировать MyD88-зависимое высвобождение зонулина [37]. Имеются данные о том, что глютен может запускать высвобождение зонулина не только у лиц с целиакией, но и у здоровых людей, однако его количество и длительность высвобождения намного выше в группе пациентов с целиакией, в результате чего проницаемость кишечника у них повышена более существенно. Способность ингибитора зонулина ларазотида ацетата (AT1001) предотвращать глютен-зависимое воспаление и повреждение кишечника показана на моделях ex vivo и у экспериментальных животных [38]. Кроме того, ларазотида ацетат продемонстрировал хорошую эффективность и безопасность у лиц с целиакией и сейчас проходит III фазу клинических испытаний [39].

Ранее описано, что уровень сывороточного и фекального зонулина увеличивается у пациентов с активной болезнью Крона, но не с язвенным колитом [40]. Однако в недавнем пилотном исследовании G. Caviglia и соавт. обнаружено, что концентрация зонулина в сыворотке крови статистически значимо выше при обоих заболеваниях, при этом наблюдается обратная корреляция между уровнем зонулина и длительностью заболевания [41].

В последние годы появляется все больше работ, оценивающих взаимосвязь секреции зонулина и повышенной кишечной проницаемости при СРК. При этом в некоторых из них не обнаружено различий по содержанию зонулина в сыворотке крови как между пациентами с СРК и здоровыми лицами, так и между подтипами пациентов с СРК в зависимости от преобладающего варианта нарушения моторики [9, 42]. В других, напротив, сообщается о статистически значимом повышении сывороточной концентрации зонулина у пациентов с СРК-Д и СРК с преобладанием запоров (СРК-З), которая сопоставима с таковой у больных целиакией [43]. При этом у всех пациентов с СРК отсутствовали морфологические изменения в тонкой кишке, типичные для глютеновой энтеропатии. В заключение авторы сделали вывод о том, что при СРК отмечается выраженная дисфункция плотных контактов, характерная для других расстройств пищеварительного тракта, в том числе органической природы. Вместе с тем уровень зонулина коррелировал с показателем индекса неудовлетворенности привычной деятельностью кишечника по шкале оценки выраженности симптомов при СРК (Irritable Bowel Syndrome Severity Scoring System), вздутием живота и частотой стула при СРК-Д.

Противоречивость указанных данных требует проявлять осторожность, прежде чем рассматривать сывороточный зонулин в качестве надежного биомаркера кишечной проницаемости при СРК. Предполагается, что определение уровня зонулина в кале может быть более чувствительным и специфичным методом в отношении оценки кишечной проницаемости, поскольку отражает секрецию белка непосредственно из места повреждения эпителия. Кроме того, в проведенных на сегодняшний день исследованиях не обнаружено корреляции между уровнями сывороточного и фекального зонулина [44].

Процесс высвобождения зонулина в кишечнике тесно взаимосвязан с составом микробиоты. Одним из первых подтверждений этому стало исследование A. Moser и соавт., в котором продемонстрировано снижение уровня фекального зонулина у пациентов с СРК-Д после лечения синбиотиками [44]. Выдвигаются предположения, что повышение содержания зонулина в кале отражает часть компенсаторного механизма, направленного на предотвращение усугубления дисфункции кишечного барьера. Как известно, растворимые пищевые волокна, которые не ферментируются в тонкой кишке, метаболизируются микробиотой толстой кишки до короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) — ацетата, бутирата, пропионата [45, 46]. Бутират считается основным источником энергии для колоноцитов и защищает их от развития воспаления и колоректального рака, ингибируя гистоновые деацетилазы, в результате чего снижается кротонилирование гистонов [47]. Кротонилирование наряду с ацетилированием и метилированием относится к реакциям посттрансляционной модификации гистонов, отвечающим за экспрессию генов, в том числе связанных с воспалением и канцерогенезом. Кроме того, взаимодействие бутирата с рецептором 109A, связанным с G-белком (GPR109A), приводит к увеличению синтеза зонулина, уменьшению воспаления и кишечной проницаемости. Ацетат и пропионат являются эндогенными лигандами двух других рецепторов, связанных с G-белком, — GPR41 и GPR43 соответственно. Данные рецепторы не только модулируют высвобождение зонулина, но и влияют на моторику кишечника, увеличивая секрецию глюкагоноподобного пептида-1 и пептида YY [48].

Недавно появились сведения о том, что кишечная микробиота может преобразовывать триптофан из белковых продуктов в активные метаболиты, выполняющие различные функции в организме человека, включая повышение экспрессии белков плотных контактов и синтеза серотонина, а следовательно, снижение проницаемости кишечного барьера и активацию блуждающего нерва [49]. Блуждающий нерв является частью парасимпатической нервной системы и представляет собой ключевое звено, реализующее взаимодействие по оси «кишечник—мозг», поэтому данный факт может быть интересен в отношении развития как нейродегенеративных или психических заболеваний, так и СРК. Влияние микробиоты на высвобождение зонулина представлено на рис. 1 [49].

Рис. 1. Механизмы влияния микробиоты на высвобождение зонулина [49].

GPR109A — рецептор 109A, связанный с G-белком; GPR43 — рецептор 43, связанный с G-белком; 5HT — 5-гидрокситриптамин (серотонин); HDAC — гистондеацетилаза; NF-kB — ядерный фактор фактора транскрипции-kB; КЦЖК — короткоцепочечные жирные кислоты; TRP — триптофан; TPH-1 — триптофангидроксилаза 1-го типа.

Результаты пилотного исследования

В пилотном исследовании нами проведена оценка уровня зонулина в кале у 55 пациентов с СРК. Исследование проводилось на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО «ОмГМУ» Минздрава России методом иммуноферментного анализа с помощью тест-системы IDK Zonulin ELISA («Immundiagnostik AG», Германия). Среднее значение показателя, заявленное производителем тест-системы, по данным обследования 40 практически здоровых лиц, — 61±46 нг/мл. При значениях показателя <83,15 нг/мл результат расценивался как норма, при 83,15—110,0 нг/мл — как повышенная концентрация, >110 нг/мл — как высокая концентрация.

Среди 55 пациентов с СРК 39 (70,9%) женщин и 16 (29,1%) мужчин в возрасте от 20 до 49 лет. Средний возраст составил 33,2±5,5 года. В зависимости от подтипа СРК все участники исследования разделены на четыре группы: СРК-Д (n=19), СРК-З (n=26), СРК-М (СРК-смешанный вариант, n=6), СРК-Н (СРК-неклассифицируемый вариант, n=4). Распределение пациентов различных групп по полу и возрасту представлено в таблице. Статистически значимых различий по возрасту между группами не было. Средняя концентрация зонулина в кале у пациентов с СРК-Д составила 248,0 [176,5; 658,0] нг/мл, с СРК-З — 112,5 [94,8; 136,0] нг/мл, с СРК-М — 186,5 [130,9; 223,4] нг/мл, с СРК-Н — 87,3 [64,4; 197,9] нг/мл. Диаграмма размаха концентрации зонулина в кале у пациентов с СРК по группам в зависимости от подтипа представлена на рис. 2.

Распределение по полу и возрасту обследованных пациентов с синдромом раздраженного кишечника

Примечание. СРК — синдром раздраженного кишечника; СРК-Д — СРК-диарея; СРК-З — СРК-запор; СРК-М — СРК-смешанный вариант; СРК-Н — СРК-неклассифицируемый вариант.

Рис. 2. Диаграмма размаха концентрации зонулина в кале у пациентов с синдромом раздраженного кишечника.

СРК — синдром раздраженного кишечника; СРК-Д — СРК-диарея; СРК-З — СРК-запор; СРК-М — СРК-смешанный вариант; СРК-Н — СРК-неклассифицируемый вариант.

Безусловно, данные результаты следует интерпретировать с осторожностью, и наше исследование должно быть продолжено. Актуальной представляется оценка уровня зонулина во взаимосвязи с тяжестью течения заболевания, психологическим статусом и пищевыми привычками пациентов, а также с составом кишечной микробиоты.

Заключение

Несмотря на то что структура и функция эпителиального кишечного барьера достаточно хорошо изучены, механизмы, посредством которых регулируется кишечная проницаемость, по-прежнему являются актуальным предметом научных исследований. Нарушение барьерной функции кишечника лежит в основе развития многих хронических заболеваний как органической, так и функциональной природы, в том числе синдрома раздраженного кишечника, представляющего собой сложную проблему для систем здравоохранения всего мира. Понимание роли потери целостности и дисфункции эпителиального кишечного барьера необходимо для расширения наших знаний об этиологии и патофизиологии заболевания, что позволит разработать эффективные подходы к лечению пациентов данной группы. К сожалению, в настоящее время остается много нерешенных вопросов, поскольку в реальной клинической практике отсутствуют высокоспецифичные и чувствительные диагностические тесты, позволяющие оценить кишечную проницаемость. Существующие методы зачастую инвазивны, затратны, ненадежны, технически сложны для выполнения и не подходят для динамического мониторинга.

В настоящее время перспективным является поиск неинвазивных биомаркеров повышенной кишечной проницаемости. В качестве потенциальных кандидатов активно изучается роль зонулина — эндогенного аналога токсина холерного вибриона и единственного известного на сегодняшний день физиологического модулятора, который может обратимо открывать плотные контакты. Предполагается, что определение уровня фекального зонулина может быть более чувствительным и специфичным методом в отношении оценки кишечной проницаемости, поскольку отражает секрецию белка непосредственно из места повреждения эпителия. Результаты проведенного нами пилотного исследования, демонстрирующие увеличение концентрации зонулина в кале у пациентов с синдромом раздраженного кишечника, особенно с диареей, позволяют подтвердить вывод о возможности применения данного метода для неинвазивной оценки кишечной проницаемости у данной категории больных.

Источник финансирования: Публикация подготовлена ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский университет» Минздрава России за счет финансирования по Гранту Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ (НШ-2558.2020.7) (соглашение 3075-15-2020-036 от 17 марта 2020 г.) «Разработка технологии здоровьесбережения коморбидного больного гастроэнтерологического профиля на основе контроля приверженности».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Ливзан М.А.

Сбор и обработка материала — Ливзан М.А., Гаус О.В.

Статистический анализ данных — Гаус О.В.

Написание текста — Гаус О.В.

Редактирование — Ливзан М.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.