Эозинофильные клетки, ассоциированные с мутацией BRAF, в пограничных серозных опухолях яичника

Пограничная серозная опухоль яичника является неинвазивным новообразованием низкой степени злокачественности, состоящим из ветвящихся папиллярных структур, выстланных стратифицированным серозным эпителием [1]. Несмотря на хороший прогноз для I FIGO стадии заболевания, вероятность прогрессирования пограничной опухоли в серозную карциному яичников низкой степени злокачественности варьирует от 4 до 15%, по данным разных авторов [2, 3]. В таких случаях пациентки имеют менее благоприятный прогноз и более низкую выживаемость. Также известно, что микропапиллярный вариант пограничной серозной опухоли характеризуется более агрессивным течением и частым прогрессированием в серозную карциному [4].

Последние исследования подтверждают важную роль мутаций KRAS и BRAF, которые являются регуляторами сигнального пути митогенактивированной протеинкиназы (MAPK), в пограничных серозных опухолях яичника. В то время как мутация KRAS может быть ассоциирована с развитием серозной карциномы низкой степени злокачественности, мутация BRAF связана с низким риском прогрессирования и, как следствие, с благоприятным течением заболевания [5, 6]. Так, например, в исследовании M. Chui и соавт. [4], проведенном в 2019 г., показано, что пограничные опухоли с мутацией KRAS и опухоли дикого типа имели повышенный риск развития серозного рака низкой степени злокачественности (2,3 и 4,4% соответственно), в то время как для BRAF-мутированных опухолей этот показатель составлял всего 0,5%.

В последние годы появляется все больше доказательств того, что BRAF-мутированные пограничные серозные опухоли могут быть ассоциированы с клетками с обильной эозинофильной цитоплазмой [4—7]. Эозинофильные клетки представляют собой опухолевые клетки с сенесцентным фенотипом. Механизм образования эозинофильных клеток, вероятно, следующий. Активация онкогена BRAF приводит к значительному снижению субъединицы рибонуклеотидредуктазы M2 (RRM2), что вызывает снижение уровня дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTP). Вышеперечисленный каскад реакций приводит к повреждению ДНК, репликативному стрессу и остановке клеточного цикла [8]. Следовательно, активированный онкоген BRAF может приводить к онкоген-индуцированному старению, тем самым образуя эозинофильные клетки [8]. Этот механизм также подтверждается исследованиями in vitro, в результате которых в этих клетках были выявлены экспрессия биомаркеров, ассоциированных со старением, — бета-галактозидазы и p16, а также низкий уровень маркера пролиферативной активности Ki-67 [9]. На основании вышеописанных результатов можно предположить, что мутация BRAF может препятствовать прогрессированию пограничной серозной опухоли в серозную карциному низкой степени злокачественности.

Цель исследования — определить диагностическую значимость эозинофильных клеток для выявления пограничных серозных опухолей яичника с мутацией BRAF.

В исследование включено 42 пациентки с пограничной серозной опухолью яичников в возрасте 15 лет и старше, которым была произведена циторедуктивная операция в ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России в период с 2018 по 2023 г. Критериями исключения были образцы, содержащие менее 50% опухолевой ткани, а также с дефектами микротомного среза/окрашивания гематоксилином и эозином. В 7 случаях была проведена неполная циторедуктивная операция из-за отсутствия срочного гистологического исследования замороженных срезов. Во всех случаях микропапиллярного паттерна роста обнаружено не было.

Все микропрепараты, окрашенные гематоксилином и эозином, были проанализированы тремя патологоанатомами на предмет наличия округлых клеток с эозинофильной цитоплазмой, занимающей не менее 50% от площади всей клетки. Эти клетки должны быть хорошо заметны при увеличении в 100 раз и расположены внутриэпителиально или десквамированы с поверхности эпителия.

Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к рецепторам эстрогена (клон SP1, Ventana, ready-to-use) и прогестерона (клон 1E2, Ventana, ready-to-use), а также к маркеру пролиферативной активности Ki-67 (клон 30—9, Ventana, ready-to-use) выполнено с помощью панели детекции VENTANA UltraView DAB IHC Detection Kit на иммуностейнере BenchMark XT (Ventana Medical-Systems).

Анализ мутаций в 15-м экзоне гена BRAF проводили методом прямого секвенирования по Сэнгеру на генетическом анализаторе 3500 (Applied Biosystems). Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программного обеспечения Sequencing Analysis 6 (Applied Biosystems) для визуализации электрофореграммы Megalign (пакет программ DNASTAR) и выравнивания таргетного фрагмента на референсную последовательность (транскрипт NM_004333.6).

С помощью сканирующего микроскопа Aperio AT2 (Leica Biosystems, США) получены цифровые изображения окрашенных микропрепаратов (формат изображений.svs). Для иммуногистохимических маркеров рецепторов эстрогена и прогестерона был определен показатель H-score (Histo-score) по формуле:

HS=1а+2b+3c,

где a — количество слабо окрашенных клеток (в %); b — количество умеренно окрашенных клеток (в %); c — количество сильно окрашенных клеток (в %); 1, 2, 3 — интенсивность окрашивания (в баллах).

Для статистической обработки данных использовали программу GraphPad Prism 9.3.1 (Dotmatics). Оценку уровня значимости различий между двумя группами (BRAF-мутированный и дикий тип) проводили с помощью критерия Манна–Уитни, t-критерия Стьюдента и точного критерия Фишера. Для установления внутренней согласованности результатов теста применяли каппу Флейсса (ϰ). При определении диагностической значимости эозинофильных клеток оценивали чувствительность и специфичность, положительную и отрицательную прогностическую ценность.

Для оценки диагностической значимости количественных признаков при прогнозировании определенного исхода применяли метод анализа ROC-кривых. Разделяющее значение количественного признака в точке cut-off определяли по наивысшему значению индекса Юдена.

Статистически значимым считали значение p<0,05.

Согласно генетическому тестированию, примерно половина пограничных серозных опухолей имела мутацию BRAF (19 из 42 случаев). Эта мутация во всех случаях состояла из нуклеотидной замены c.1799T>A в 15-м экзоне кодирующей ДНК.

Пациентки с мутацией BRAF^V600E на момент выполнения операции были значительно моложе, чем лица, не имевшие мутацию в опухоли. Так, средний возраст больных в группе с мутацией BRAF^V600E составил 33,6±15,6 года (95% ДИ 26—41), в то время как в группе опухолей без мутации средний возраст пациенток был 43,9±12,7 года (95% ДИ 38—49) (p=0,002).

В 7 случаях информация о стадии FIGO была недоступна из-за неполного объема оперативного вмешательства в связи с отсутствием срочного гистологического исследования замороженных срезов опухоли. Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что из 35 пограничных серозных опухолей стадия по FIGO>I выявлялась в 2 BRAF^V600E мутантных и в 6 опухолях дикого типа. Следовательно, пограничные серозные опухоли с мутацией BRAF^V600E реже имели неинвазивные импланты в сальнике и брюшине (11,76%) по сравнению с опухолями дикого типа (33,3%) (на уровне статистической тенденции; p=0,228).

При анализе безрецидивной пятилетней выживаемости у 2 пациенток (по одному случаю в каждой группе) был выявлен рецидив опухоли. Из 14 случаев с краткосрочным периодом наблюдения, который составил 3 года, один рецидив был обнаружен у пациентки с опухолью, не имеющей BRAF^V600E -мутации.

При анализе внутренней согласованности между тремя патологоанатомами рассчитанные значения каппы Флейсса позволили определить надежность теста как достаточную (ϰ=0,7). На рис. 1, а, б показано, что эозинофильные клетки были идентифицированы большинством патологоанатомов (двумя или тремя) в 78,9% BRAF-мутированных опухолях (15/19) и в 8,7% (2/23) опухолях дикого типа (p<0,0001). Кроме того, необходимо отметить, что в 2 случаях опухолей с мутацией BRAF все патологоанатомы не обнаружили эозинофильные клетки, а в 2 случаях в группе дикого типа были достоверно выявлены эозинофильные клетки.

Рис. 1. Эозинофильные клетки в пограничных серозных опухолях.

Округлые клетки с четкими границами, обильной эозинофильной цитоплазмой определяются как в опухолях с мутацией BRAF (а), так и в опухолях дикого типа (б). Окраска гематоксилином и эозином, ×400.

В нескольких образцах, не имеющих мутацию BRAF, определялись десквамированные с поверхности опухоли клетки со схожей морфологией, которые ошибочно были расценены как истинные эозинофильные клетки, что могло снизить воспроизводимость этого признака патологоанатомами. Однако при сравнении гистологических особенностей классических эозинофильных клеток и их аналогов последние отличались не только меньшим размером, но и количеством эозинофильной цитоплазмы (рис. 2).

Рис. 2. Схожая морфология истинных эозинофильных клеток и эпителиальных клеток, отделяющихся от поверхности опухоли.

а — опухоль с мутацией BRAF, истинные эозинофильные клетки с обильной цитоплазмой; б — опухоль дикого типа, десквамированные клетки меньшего размера с меньшим количеством эозинофильной цитоплазмы. Окраска гематоксилином и эозином, ×100.

Чувствительность и специфичность прогнозирования мутации BRAF^V600E для эозинофильных клеток составили 78,9% (95% ДИ 56,7—91,5) и 91,3% (95% ДИ 73,2—98,5) соответственно. Положительная прогностическая ценность составила 88,2% (95% ДИ 65,7—97,9), отрицательная прогностическая ценность — 84% (95% ДИ 73,2—98,5).

Также был выполнен иммуногистохимический анализ экспрессии рецепторов эстрогена (ER), прогестерона (PR) и маркера пролиферативной активности Ki-67 в опухолевой ткани. Статистически значимых различий для значений рецептора эстрогена и Ki-67 обнаружено не было.

Для значений H-score-рецептора прогестерона в зависимости от наличия или отсутствия рецидива выявлены статистически значимые различия (p=0,047). Площадь под ROC-кривой составила 0,857±0,093 с 95% ДИ 0,675—1,000. Пороговое значение H-score для рецепторов прогестерона в точке cut-off, которому соответствовал наивысший показатель индекса Юдена, составило 250,000. Рецидив прогнозировали при значении PR ниже данной величины. Чувствительность и специфичность модели составили 100 и 66,7% соответственно.

При анализе экспрессии ER, PR и Ki-67 в зависимости от мутации BRAF не удалось установить статистически значимых различий (таблица).

ИГХ-экспрессия ER, PR и Ki-67 в мутантных опухолях и опухолях дикого типа

Примечание. Используемый метод: U-критерий Манна–Уитни.

Статистически значимых различий в безрецидивной выживаемости в зависимости от экспрессии ER, PR, Ki-67, а также мутационного статуса опухоли не обнаружено (рис. 3).

Рис. 3. Кривые Каплана–Мейера безрецидивной выживаемости больных с пограничными серозными опухолями яичников с различной экспрессией PR (а), ER (б), Ki-67 (в) и различным молекулярно-генетическим статусом (г).

Пограничная серозная опухоль яичников, как известно, является индолентным новообразованием, что обусловливает необходимость длительного периода наблюдения за больными для определения исходов заболевания [2, 10]. В связи с этим прогнозирование течения заболевания для данного морфологического типа опухолей в настоящее время представляет собой значительную проблему. Однако в ряде исследований [2—7, 9] показано, что наличие в пограничных серозных опухолях мутации BRAF ассоциировано с благоприятным прогнозом и низким риском прогрессии в серозную карциному низкой степени злокачественности.

В настоящей работе показано, что сенесцентные клетки с обильной эозинофильной цитоплазмой были ассоциированы с пограничными серозными опухолями с мутацией BRAF и продемонстрировали значительную чувствительность и специфичность (78,9 и 91,3% соответственно) для прогнозирования вышеуказанной мутации. Полученные данные согласуются с исследованием M. Chui и соавт. [5], в котором чувствительность и специфичность эозинофильных клеток составили 67 и 95% соответственно.

При анализе внутренней согласованности между тремя патологоанатомами рассчитанные значения каппы Флейсса позволили определить надежность теста как достаточную (ϰ=0,7). Полученные результаты отличаются от использованных в исследовании M. Chui и соавт. [5], в котором каппа Флейсса, определенная пятью врачами, составила 0,41. Установленные различия можно частично объяснить большим количеством участвующих исследователей, полуколичественной оценкой наличия эозинофильных клеток в опухоли, в то время как в настоящей работе использовалась бинарная система оценки. Кроме того, более низкая воспроизводимость, выявленная врачами в работе M. Chui и соавт. [5], может быть связана с наличием в выборке микропапиллярного варианта опухолей (12 образцов), в то время как в данной работе микропапиллярного паттерна не выявлено.

Также необходимо отметить, что снижение внутренней согласованности может быть связано с кубическими клетками, выстилающими папиллярные структуры опухоли, которые можно ошибочно принять за эозинофильные клетки [5]. Однако последние характеризуются более округлой формой, обильной эозинофильной цитоплазмой, истинные эозинофильные клетки также лишены ресничек, в них не выявляются фигуры митоза [5].

Основное клиническое значение мутационного статуса BRAF и, следовательно, эозинофильных клеток заключается в прогностическом значении наблюдения за пациентками с пограничными серозными опухолями. В проведенных ранее исследованиях [11, 12] статус мутации BRAF был успешно протестирован в качестве прогностического фактора. Кроме того, определение мутации KRAS также продемонстрировало прогностическую ценность, поскольку ее наличие в опухолях тесно связано с развитием рецидивов [6].

Для прогнозирования течения заболевания помимо исследования компонентов сигнального пути МАРК, в настоящее время проводится поиск иммуногистохимических антител, которые могут быть внедрены в ежедневную патолого-анатомическую практику. Так, многие авторы [13—15] продемонстрировали постепенное увеличение пролиферативной активности от доброкачественных серозных цистаденом до пограничных серозных опухолей и серозных карцином низкой степени злокачественности, однако им не удалось определить пороговое значение для Ki-67 с высокой чувствительностью и специфичностью для прогнозирования прогрессии пограничной опухоли в серозную карциному.

Несмотря на возможность иммуногистохимического исследования уровня экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона, данные современной литературы [16—19] о возможности их использования для определения прогноза и течения заболевания представлены неполно и во многом противоречивы. В то время как некоторые авторы [20] показали, что статус рецепторов стероидных половых гормонов может успешно использоваться в качестве прогностического фактора, другие не смогли подтвердить их прогностическую ценность [21] или только один из маркеров (прогестерон или эстроген) показал положительный прогностический потенциал [22, 23]. Таким образом, в настоящее время пороговые значения для рецепторов эстрогена и прогестерона окончательно не определены.

Эозинофильные клетки в серозных пограничных опухолях яичников могут в достаточной мере отражать мутацию BRAF^V600E и коррелировать с низким риском прогрессии в серозную карциному низкой степени злокачественности. Таким образом, связь между гистологическими особенностями и определенными мутациями может лечь в основу будущей терапевтической стратификации, не требующей молекулярного профилирования опухоли.

Работа выполнена при поддержке премии Международного общества гинекологических патологов молодым ученым (International Society of Gynecological Pathologists (ISGyP) Young Member Award).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования –Бадлаева А.С., Асатурова А.В.

Сбор и обработка материала — Бадлаева А.С., Трегубова А.В., Юдина А.А.

Написание текста — Бадлаева А.С., Асатурова А.В.

Трегубова А.В.

Редактирование — Асатурова А.В., Бадлаева А.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.